楊 睿，李 萍，張 偉，李 函，楊 凡，陸 賓，季莉莉*

（1. 上海市浦東新區(qū)光明中醫(yī)醫(yī)院，上海 201399；2. 上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生健康委員會監(jiān)督所，上海200135；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué) 中藥研究所 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評價(jià)

國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

川楝子是臨床常用中藥，能舒肝瀉熱、行氣止痛、殺蟲，有小毒[1]。實(shí)驗(yàn)室前期研究參考川楝子臨床用法和用量，建立了肝毒性小鼠模型，并證實(shí)川楝子可以誘導(dǎo)顯著的急性肝毒性，其所含的川楝素（TSN）是主要的肝毒性成分[2-3]。但是目前川楝子肝毒性的機(jī)制尚不清楚，也并未尋找到可以快速、靈敏的檢測其肝毒性的生物標(biāo)志物。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種長度大于200 核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA?？焖佟⒏咄康?LncRNA 芯片檢測技術(shù)的發(fā)展，為它作為肝毒性生物標(biāo)志物提供了可能。本研究基于LncRNA，使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、基因芯片、RT-PCR、受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC）分析等方法，在川楝素給藥后小鼠血清中尋找表達(dá)差異明顯的可以指征中藥急性肝毒性的生物標(biāo)志物，以期為中藥肝毒性的研究打開新的思路，為中藥臨床安全使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF 級C57BL/6 小鼠，雄性，體質(zhì)量為18 ～ 20 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)溫度：（22 ± 1） ℃，相對濕度：（65 ± 10）%，照明時(shí)間每天12 h。

1.2 藥物、試劑與儀器

TSN（川楝素，上海純優(yōu)生物科技有限公司，稱取其粉末用10%PG 溶液充分溶解后，配制成1 mg/mL 的溶液）；PG（丙二醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ALT 與AST 試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol（Invitrogen，美國Thermo 公司）；異丙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；SuperScriptTM III Reverse Transcriptase（Invitrogen，美國Thermo 公司）；5× RT 緩沖液（Invitrogen，美國Thermo 公司）；引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司）；2 × PCR master mix（美國Arraystar 公司）；NanoDrop 2000（美國Thermo 公司）、Gene Amp PCR System 9700（Applied Biosystems，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、ViiA 7 Realtime PCR System（Applied Biosystems，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）等。

1.3 動(dòng)物分組與處理

空白對照組10 只；溶媒對照組（10% PG）10 只；TSN 6 h（10 mg/kg） 10 只；TSN 12 h（10 mg/kg）10只。待動(dòng)物體質(zhì)量在20 g 左右，給藥前禁食不禁水12 h，每隔6 h 給藥TSN 一次，總共兩次。灌胃給藥，0.1 mL/10 g。溶媒對照組給予相同體積的10%PG 溶液。于末次給藥12 h 后，禁食不禁水。12 h 后摘眼球取血和肝。

1.4 血清肝生化指標(biāo)檢測

血液經(jīng)靜置、離心、吸取上層血清、分裝后，按照試劑盒說明測定ALT、AST 活力。

1.5 病理切片觀察肝組織

固定于甲醛的肝大葉用石蠟包埋后進(jìn)行切片, 蘇木素?伊紅（HE）染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.6 LncRNA 基因芯片分析

芯片技術(shù)服務(wù)委托上?？党缮锕こ逃邢薰具M(jìn)行，采用 Arraystar 長鏈非編碼RNA 芯片（ Mouse LncRNA Array V4.0） 技術(shù)分析各10 例PG 試劑對照組、TSN 6 h 組、TSN 12 h 組的外周血清中LncRNA差異表達(dá)譜，進(jìn)行差異基因分析，計(jì)算轉(zhuǎn)錄本間的顯著性水平（P值）及倍數(shù)變化。

1.7 LncRNA 的RT-PCR

血清提取總RNA：血清樣品按說明加入TRIzol試劑，依次進(jìn)行兩相分離、RNA 沉淀和清洗、重溶解沉淀等；RNA 質(zhì)量檢測：采取紫外吸收測定法，使用NanoDrop 2000 測定RNA 濃度和純度；RNA 合 成cDNA：使 用SuperScriptTM III Reverse Transcriptase 等按說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物：Primer 5.0 軟件。RT-PCR 檢測：使用2 ×PCR master mix、上下游引物等按說明進(jìn)行cDNA 的RT-PCR。引物信息見表1。

表1 RT-PCR 所需引物Tab. 1 Primers for RT-PCR

1.8 ROC 曲線分析

使 用GraphPad Prism 5 軟 件 對ALT、AST 和候選LncRNA 生物標(biāo)志物的小鼠血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ROC 曲線分析和作圖， 通過曲線下面積、敏感度、特異度等值來評估候選LncRNA生物標(biāo)志物的價(jià)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSN 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠急性肝毒性

動(dòng)物處理前，肉眼觀察小鼠的行為學(xué)，TSN 給藥6 h 組和12 h 組的小鼠均出現(xiàn)少動(dòng)喜臥、對外界刺激反應(yīng)遲緩等現(xiàn)象。解剖后，這兩組肝臟顏色暗紅，局部呈斑點(diǎn)狀。血液學(xué)指標(biāo)如圖1 所示，與空白對照組和溶媒對照組相比，C57BL/6 小鼠在TSN 給藥12 h 后能夠提高血清ALT、AST 活力（P< 0.01）；6 h 組能夠提高血清AST 活力（P< 0.05）。病理結(jié)果如圖2，空白對照組和溶媒對照組未見明顯變化；6 h 組見輕微肝內(nèi)出血；12 h 組可見明顯肝內(nèi)出血，炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死。提示TSN 給藥12 h（10 mg/kg）能顯著誘導(dǎo)急性肝毒性。

圖1 TSN 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠急性肝毒性的ALT/AST 酶活力（±s，n = 10）Fig. 1 Activity of ALT / AST in acute hepatotoxicity induced by TSN in C57BL / 6 mice（±s，n = 10）

圖2 TSN 誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠急性肝毒性的病理結(jié)果Fig. 2 Pathological results of acute hepatotoxicity induced by TSN in C57BL / 6 mice

2.2 TSN 給藥小鼠血清 LncRNA 芯片檢測結(jié)果

在TSN 給藥12 h 組的LncRNA 芯片結(jié)果中，近3 萬個(gè)LncRNA 中有38 個(gè)LncRNA 差異變化（>10倍），見表2、圖3 所示。

圖3 川楝素單次給藥12 h 基因芯片差異變化聚類圖（>10 倍）Fig. 3 Cluster diagram of gene chip difference changes after single administration of toosendanin for 12 h （> 10 fold）

表2 川楝素在芯片中引起小鼠血清中差異變化的LncRNA（> 10 倍）Tab. 2 LncRNA in serum of mice induced by toosendanin in microarray（> 10 fold）

2.3 RT-PCR 驗(yàn)證TSN 給藥小鼠血清中顯著變化的LncRNA

從38 個(gè)差異變化的LncRNA 中，采用RTPCR 實(shí)驗(yàn)在TSN 給藥小鼠血清6 h 和12 h 組中驗(yàn)證13 個(gè)顯著變化15 倍以上且原始強(qiáng)度大于100的LncRNA。設(shè)計(jì)引物時(shí)發(fā)現(xiàn)其中Gm16596、Tmem178b、BC038906、Rdh11 等4 個(gè)LncRNA引物特異性欠佳，既能擴(kuò)增出LncRNA 條帶，又能擴(kuò)增出后面的mRNA 條帶，干擾mRNA 分別為NM_001364196.1（EmL1）、NM_001004182.4、XM_006535264.1/ NM_173370.3（Cds1）、NM_001362270，故無法開展后續(xù)試驗(yàn)。其余9 個(gè)LncRNA 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，TSN 給藥小鼠血清6 h、12 h 組中有3 個(gè)下調(diào)LncRNA（AK017411、AK003718、XLOC_019815）通過了驗(yàn)證，它們的變化情況均與芯片結(jié)果一致，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈良好時(shí)效關(guān)系。提示AK017411、AK003718、XLOC_019815 為候選LncRNA 血清生物標(biāo)志物。

圖4 RT-PCR 驗(yàn)證顯著變化LncRNA 在小鼠單次給藥TSN 6 h 與12 h血清中的表達(dá)（±s，n = 10）Fig. 4 RT-PCR confirmed the expression of LncRNA in serum of TSN in mice after single administration of TSN for 6 h and 12 h（±s，n = 10）

2.4 ROC 曲線分析

結(jié)果顯示如圖5、圖6、表3，在TSN 給藥造成顯著肝毒性的12 h 組中，3 個(gè)候選LncRNA 與肝毒性“金標(biāo)準(zhǔn)”ALT、AST 均能明確指示肝毒性，曲線下面積均為1；而在造成輕微肝毒性的6 h 組中，AK017411、AK003718、XLOC_019815 的評價(jià)結(jié)果略優(yōu)于ALT、AST，證明其具有良好敏感性。

表3 候選LncRNA 生物標(biāo)志物與ALT、AST 的ROC 分析結(jié)果Tab. 3 ROC analysis results of candidate LncRNA biomarkers and ALT, AST

圖5 血清TSN（6 h）組候選LncRNA 生物標(biāo)志物與ALT、AST 的ROC 曲線Fig. 5 ROC curve of candidate LncRNA biomarkers and ALT and AST in TSN （6 h） group

圖6 血清TSN（12 h）組候選LncRNA 生物標(biāo)志物與ATL、AST 的ROC 曲線Fig. 6 ROC curve of candidate LncRNA biomarkers with ALT and AST in serum TSN （12 h） group

2.5 AK017411、AK003718、XLOC_019815 可 以 作為指征川楝子誘導(dǎo)急性肝毒性的血清生物標(biāo)志物

如圖7所示，3個(gè)LncRNA生物標(biāo)志物篩選的過程。

圖7 指征川楝子誘導(dǎo)急性肝毒性的血清生物標(biāo)志物的篩選過程Fig. 7 Screening of serum biomarkers for acute hepatotoxicity induced by toosendan fruit

3 討論

四環(huán)三萜類化合物川楝素（TSN）不僅是川楝子公認(rèn)的主要活性成分，還是其肝毒性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[2-9]。灌胃小鼠、大鼠川楝素，其急性中毒的LD50分別為 244.2 mg/kg 和 120.7 mg/kg；對小鼠腹腔注射的 LD50為 13.44 mg/kg[10]。本研究前期研究參考川楝子臨床用法和用量，摸索建立的肝毒性小鼠模型中的劑量為10 mg/kg，給藥6 h 能造成輕微肝毒性，12 h 能造成顯著肝毒性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的肝毒性生物標(biāo)志物ALT 與AST 已經(jīng)應(yīng)用了近半世紀(jì)，一直是臨床和科學(xué)研究中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于在特異性和敏感性上存在許多局限性，不能完全滿足當(dāng)前藥物安全性評價(jià)的要求。因此，近幾年國內(nèi)外專家都致力于尋找和驗(yàn)證新的高靈敏度和高特異性的肝毒性生物標(biāo)志物，比如：GLDH、miR-122 等[11]。LncRNA 是一種內(nèi)源性非編碼RNA，長度大于200 個(gè)核苷酸單位，參與細(xì)胞內(nèi)多種過程調(diào)控，具有在種類、數(shù)量、功能上都不明確等特點(diǎn)。根據(jù)LncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以將其分為外顯子同義重疊、內(nèi)含子同義重疊、內(nèi)含子反義、天然反義、反向、基因間共6 種類型。同時(shí)，快速、高通量的LncRNA 芯片檢測技術(shù)近年來得到了快速的發(fā)展，為其作為肝毒性生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測提供了可能。已經(jīng)有學(xué)者開始研究將LncRNA應(yīng)用于一些疾病生物標(biāo)志物的尋找，并取得了一些進(jìn)展[12-14]，但目前未見在肝毒性研究中的報(bào)道，特別是未見對于中藥肝毒性的研究。

ROC 曲線常見于評估不同診斷試驗(yàn)對疾病的識別能力，將靈敏度與特異性以圖示方法結(jié)合在一起，可準(zhǔn)確反映某分析方法特異性和敏感性的關(guān)系，是試驗(yàn)準(zhǔn)確性的綜合代表。目前使用ROC 曲線來評估肝毒性生物標(biāo)志物的文獻(xiàn)報(bào)道較少，我們創(chuàng)新性地將候選生物標(biāo)志物與ALT、AST 共同評估，證明了候選生物標(biāo)志物的價(jià)值。

AK017411[15]、AK003718[16]、XLOC_019815[17]均屬于基因間類型的LncRNA，長度分別為945、1 273、213 個(gè)核苷酸，均未見其功能注釋乃至肝毒性相關(guān)的報(bào)道，有極大的研究價(jià)值和潛力。

4 結(jié)論

本研究通過 LncRNA 芯片檢測，結(jié)合 RT-PCR驗(yàn)證和ROC 曲線評價(jià)，從近30 000 個(gè) LncRNA 中篩選出這3 個(gè)LncRNA，均在6 h 和12 h 給藥小鼠的血清中發(fā)生明顯變化且具有時(shí)效關(guān)系，可作為指征川楝子誘導(dǎo)急性肝毒性的血清生物標(biāo)志物。希望本研究結(jié)果能為中藥肝毒性的研究打開新的思路，為中藥臨床安全使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。