鞠成國，張 強，唐婷婷，王 巍*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連116600； 2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600）

威靈仙始載于《新修本草》，味辛、咸，性溫，其性猛善走，通行十二經(jīng)脈，具有很好的祛風濕、通經(jīng)止痹痛的功效[1]，現(xiàn)代藥理學研究表明威靈仙在抗炎鎮(zhèn)痛方面有很好的療效[2-3]。2020 年版 《中國藥典》（一部）規(guī)定威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團鐵線蓮Clematis hexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr.的干燥根和根莖[4]?，F(xiàn)代化學成分研究表明威靈仙含有大量的皂苷類成分[5]，因基原不同，其化學成分間亦存在一定差別。由于成分決定療效，因此不同基原威靈仙的抗炎鎮(zhèn)痛效果勢必有所不同。本研究旨在對不同基原威靈仙進行藥效學及化學成分進行比較，并構建藥效與化學成分的譜效關系，為威靈仙抗炎鎮(zhèn)痛的物質基礎研究提供支持，并為威靈仙飲片的炮制加工及臨床合理用藥提供理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試藥

S0-1 為威靈仙對照藥材、S0-2 為棉團鐵線蓮對照藥材（均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為121189-201102、121578-201202）；S1-S11 批威靈仙藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學翟延君教授鑒定，均為正品，信息見表 1；阿司匹林腸溶片（北京曙光藥業(yè)有限責任公司，批號：20140607）。

表 1 樣品信息Tab. 1 Information of samples

1.2 動物

SPF 級昆明小鼠，雄性［購自遼寧長生生物技術有限公司，動物許可證號為：SCXK（遼）2020-0001］，體質量為（20±2）g。

1.3 試劑

二甲苯、冰醋酸為化學級，均購自成都市科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，均購自天津科密歐化學試劑有限公司；水為超純水。

1.4 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫科技公司）；FA1004B 型分析天平（上海精密科學儀器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 威靈仙給藥溶液及陽性藥溶液制備 分別稱取各批次藥材適量，加8 倍量、6 倍量水，水煎提取兩次，每次1 h，合并濾液，濾液蒸干研細備用。取適量干粉，加水混溶，制成濃度為0.13 g/mL 的威靈仙混懸液；取阿司匹林腸溶片，用研缽研磨成細粉狀，稱取粉末適量，加水制成0.01 g/mL 的阿司匹林混懸液[6]。

1.5.2 耳腫脹抗炎實驗 小鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，隨機分成14 組，每組10 只。即空白組、模型組、阿司匹林組、威靈仙S1-S11 組。各批次威靈仙及阿司匹林組灌胃相應給藥液0.4 mL/20 g，空白組和模型組灌胃等量的水，各組均連續(xù)灌胃給藥7 d。除空白組外，其余各組小鼠末次給藥1 h 后，于右耳前后兩面涂抹20 μL 二甲苯致炎。1 h 后脫頸椎處死小鼠，用直徑8 mm 的打孔器沿耳緣沖下耳廓，左右兩耳取同一部位，分別置于分析天平上稱其質量，計算鼠耳腫脹度及抑制率[7]。小鼠耳腫脹度（%） =（小鼠致炎耳片質量－小鼠未致炎耳片質量）/小鼠未致炎耳片質量×100%；腫脹抑制率（%）=（模型組小鼠致炎后耳片平均腫脹度-給藥組小鼠致炎后耳片平均腫脹度）/模型組小鼠致炎后耳片平均腫脹度×100%。

1.5.3 冰醋酸扭體鎮(zhèn)痛實驗 小鼠分組及給藥方法同“1.5.2”項。末次給藥1 h 后，除空白組外各組小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.2 mL。記錄給藥后15 min 內(nèi)各小鼠扭體（腹部凹陷、伸展后肢、臀部抬高）次數(shù)，計算扭體抑制率[8]。扭體抑制率（%） =（模型組小鼠15 min 內(nèi)平均扭體次數(shù)－給藥組小鼠15 min 內(nèi)平均扭體次數(shù)）/模型組小鼠15 min 內(nèi)平均扭體次數(shù)×100%。

1.5.4 HPLC 指紋圖譜建立 （1）供試品溶液制備

取“1.5.1”項下預留威靈仙干粉，精密稱取0.4 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，過0.45 μm 微孔濾膜，即得[9]。

（2）色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脫（0 ～8 min，95%～95%B；8 ～15 min，95%～88%B；15 ～40 min，8%～80%B；40 ～60 min，80%～75%B；60 ～70 min，5%～70%B；70 ～80 min，70%B；80 ～95 min，70% ～55%B；95 ～110 min，55%～10%B；110 ～115 min，10%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：205 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL[10]。

（3）方法學考察 取S1 供試品溶液，按“1.5.4（2）”項下色譜條件進樣，重復6 次，計算各共有峰的相對保留時間、共有峰峰面積及色譜圖的相似度，考察設備精密度；取S1 供試品溶液，分別在制備后的0、2、4、8、12、16、24 h 時， 按“1.5.4（2）”項下色譜條件進樣，計算各共有峰的相對保留時間、共有峰峰面積及色譜圖的相似度，考察24 h 內(nèi)樣品穩(wěn)定性；取0.1 g 的S1 藥材干粉6 份，按上述方法操作，制備供試品溶液，按“1.5.4（2）”項下色譜條件進樣，計算各共有峰的相對保留時間、共有峰峰面積及色譜圖的相似度，考察方法重復性。

1.5.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù) ± 標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。偏最小二乘回歸分析采用MINITAB 17 軟件。

2 結果

2.1 抗炎鎮(zhèn)痛作用結果

與模型組比較，阿司匹林組及各批次威靈仙組均明顯降低小鼠耳腫脹度（P< 0.05），提高腫脹抑制率（P< 0.05），減少扭體次數(shù)率（P< 0.05），增強扭體抑制率（P< 0.05）。結果見表2。

表 2 各組小鼠抗炎鎮(zhèn)痛實驗結果（±s，n = 10）Tab.2 Experimental results of anti inflammation and analgesia in mice of each group（±s，n = 10）

表 2 各組小鼠抗炎鎮(zhèn)痛實驗結果（±s，n = 10）Tab.2 Experimental results of anti inflammation and analgesia in mice of each group（±s，n = 10）

注：與空白組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

扭體抑制率/%空白組 0.24 ± 0.09 100.00 ± 0.09 0.0 ± 0.00 100.00 ± 0.00模型組 98.13 ± 11.18# 0.0 ± 0.00# 40.25 ± 3.50# 0.0 ± 0.00#阿司匹林組 48.31 ± 2.49*# 50.77 ± 2.54*# 9.75 ± 2.99*# 75.78 ± 7.42*#S1 組 52.43 ± 3.31*# 46.57 ± 3.37*# 13.20 ± 3.19*# 67.20 ± 7.94*#S2 組 60.24 ± 3.94*# 38.61 ± 4.02*# 14.40 ± 2.88*# 64.22 ± 7.16*#S3 組 51.83 ± 3.98*# 47.18 ± 4.06*# 12.67 ± 3.21*# 68.53 ± 7.99*#S4 組 49.55 ± 4.01*# 49.51 ± 4.09*# 10.00 ± 2.58*# 75.16 ± 6.42*#S5 組 49.15 ± 7.02*# 49.92 ± 7.15*# 16.33 ± 2.94*# 59.42 ± 7.31*#S6 組 53.11 ± 3.86*# 45.88 ± 3.94*# 9.60 ± 3.05*# 76.15 ± 7.58*#S7 組 58.53 ± 7.34*# 40.36 ± 7.48*# 12.20 ± 2.59*# 69.69 ± 6.43*#S8 組 50.88 ± 5.29*# 48.15 ± 5.39*# 15.80 ± 2.39*# 60.75 ± 5.93*#S9 組 57.05 ± 3.18*# 41.87 ± 3.24*# 10.50 ± 2.65*# 73.91 ± 6.57*#S10 組 56.33 ± 2.92*# 42.60 ± 2.98*# 14.20 ± 2.39*# 64.72 ± 5.93*#S11 組 50.89 ± 3.93*# 48.14 ± 4.00*# 11.00 ± 2.58*# 75.16 ± 6.41*#F 58.101 58.101 40.005 40.005 P 0.000 0.000 0.000 0.000組別 耳腫脹度/% 腫脹抑制率/%15 min 內(nèi)扭體次數(shù)/次

2.2 方法學考察結果

精密度考察結果顯示各共有峰的相對保留時間RSD < 0.6%，共有峰峰面積RSD < 1.0%，色譜圖的相似度大于 0.99，表明設備精密度良好；穩(wěn)定性考察結果顯示各共有峰相對保留時間RSD < 0.9%，共有峰面積RSD < 1.3%，色譜圖相似度大于 0.99，表明24 h 內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好；重復性考察結果顯示各共有峰相對保留時間RSD < 0.8%，共有峰面積RSD <1.2%，色譜圖相似度大于 0.99，表明方法重復性良好。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

取“1.5.4”項下供試品溶液，在“1.5.4”項下色譜條件下測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012 版）”進行共有峰的匹配，得到指紋圖譜，對各色譜峰進行平滑、去噪、峰對齊后，生成對照指紋圖譜，見圖1，共標記23 個共有峰。與對照圖譜比較，11 批樣品圖譜相似度在0. 653 ～0.975 之間，相似度結果見表3。

圖1 2 批對照藥材及11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig. 1 The HPLC fingerprint of 2 batches of control herbs and 11 batches of samples

表3 2 批對照藥材及11 批樣品指紋圖譜相似度Tab. 3 The fingerprint similarity of 2 batches of control herbs and 11 batches of samples

2.4 譜效關系分析

考慮威靈仙各批次藥材相似度較低，為了更全面的反映化學成分與藥效之間的關系，因此在23 個共有峰的基礎上，又在對照圖譜上選擇峰面積占比大于0.5%的15 個特征峰進行譜效關系分析，38 個特征峰保留時間見表4。以38 個特征峰的峰面積作為自變量（X），編號為X1、X2、X3…X38，各批次威靈仙腫脹抑制率或扭體抑制率作為因變量（Y），將數(shù)據(jù)分別代入MINITAB 17 軟件，建立偏最小二乘回歸方程，得到特征峰與腫脹抑制率或扭體抑制率之間的回歸方程，腫脹抑制率Y= - 0.033 8X1- 0.122 7X2+ 0.058 4X3- 0.050 9X4+ 0.059 7X5+ 0.065 3X6+ 0.051 4X7+0.093 4X8+ 0.032 5X9+ 0.023 8X10+ 0.015 9X11+ 0.013 4X12-0.060 8X13- 0.131 3X14+ 0.004 3X15- 0.169 4X16+0.023 6X17+ 0.072 2X18- 0.027 8X19- 0.211 5X20-0.073 0X21+ 0.320 3X22+ 0.027 7X23+ 0.038 0X24+0.008 8X25- 0.013 2X26+ 0.007 3X27- 0.090 3X28+0.1 480X29- 0.109 5X30+ 0.144 9X31+ 0.083 0X32-0.120 9X33- 0.080 5X34+ 0.025 1X35- 0.191 5X36+0.031 1X37- 0.000 5X38（R2= 0.959 5）；扭體抑制率Y= - 0.151 5X1- 0.119 8X2- 0.077 1X3- 0.183 9X4-0.082 8X5- 0.043 8X6+ 0.075 8X7+ 0.008 6X8- 0.009 0X9+0.057 0X10+ 0.073 9X11+ 0.030 5X12+ 0.143 7X13+ 0.067 0X14+0.007 4X15+ 0.101 9X16+ 0.136 6X17+ 0.022 8X18-0.045 5X19- 0.054 1X20+ 0.023 3X21- 0.136 4X22-0.037 1X23+ 0.013 4X24+ 0.005 8X25- 0.192 9X26+0.012 1X27- 0.051 1X28- 0.063 4X29- 0.116 5X30+0.083 0X31+ 0.146 7X32- 0.085 2X33- 0.023 0X34+0.090 7X35+ 0.226 3X36- 0.006 8X37+ 0.048 7X38（R2= 0.973 8）。其中，各項系數(shù)代表對應特征峰對藥效的貢獻大小，絕對值越大對藥效貢獻越大，正值代表與藥效正相關，負值代表與藥效負相關，偏最小二乘回歸模型回歸系數(shù)見圖2。結果可見，與抗炎作用呈較大（相關系數(shù)絕對值≥01，下同）正相關的特征峰有3 個，為P22 ＞P29 ＞P31，呈較大負相關的特征峰有7 個，為P20 ＞P36 ＞P16 ＞P14 ＞P2 ＞P33 ＞P30；與鎮(zhèn)痛作用呈較大正相關的特征峰有5個，為P36 ＞P32 ＞P13 ＞P17 ＞P16，呈較大負相關的特征峰有6 個，為P26 ＞P4 ＞P1 ＞P22 ＞P2 ＞P30。

表4 特征峰保留時間Tab. 4 Retention time of characteristic peaks

3 討論

3.1 提取條件及色譜條件的選擇

由于2020 年版《中國藥典》中對威靈仙定量分析提取方法的要求較為繁瑣，相當于是對齊墩果酸的富集，圖譜成分簡單，不可用于指紋圖譜分析。因此，本研究參考文獻[9-10]對比了不同濃度甲醇及不同濃度乙醇的提取效率，結果顯示100%甲醇提取液的HPLC 色譜峰相對較多，且峰高相對均衡，因此采用100%甲醇作為提取液。由于威靈仙中成分主要為皂苷類，故文獻中多選205 ～210 nm 作為檢測波長，本研究對威靈仙及棉團鐵線蓮對照藥材供試品溶液進行紫外全波長掃描，均在205 nm 處呈最大吸收，故選擇205 nm 作為檢測波長。針對流動相，本研究對比了乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水，結果發(fā)現(xiàn)以乙腈-水作為流動相各色譜峰略微拖尾，而以乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水作為流動相各色譜峰峰形較好，且無差別，故選擇乙腈-0.05%磷酸水作為流動相。

圖 2 特征峰標準化系數(shù)Fig. 2 Characteristic peak standardization coefficient

3.2 抗炎鎮(zhèn)痛作用譜效關系分析

結果顯示，有3 個特征峰與抗炎作用呈較大正相關，有7 個特征峰呈較大負相關，有5 個特征峰與鎮(zhèn)痛作用呈較大正相關，有6 個特征峰呈較大負相關。表明威靈仙中的化學成分對抗炎鎮(zhèn)痛作用既有正向調(diào)節(jié)作用也有負向調(diào)節(jié)作用。總體來看，不同基原威靈仙在抗炎與鎮(zhèn)痛藥效方面起效的物質基礎之間存在較大差別。實驗結果提示，在威靈仙飲片加工過程中，可針對不同用途，參考與抗炎或鎮(zhèn)痛作用具有較大正相關的成分作為評價指標，采用不同方法及輔料對威靈仙進行合理的炮制加工，以達到提高臨床治療效果的目的。

4 結論

本實驗通過偏最小二乘回歸法建立了不同來源威靈仙抗炎鎮(zhèn)痛的譜效關系，初步預測了抗炎鎮(zhèn)痛的物質基礎，為威靈仙飲片的炮制加工及臨床合理用藥提供理論研究基礎。但本研究只是初步研究了不同基原威靈仙抗炎鎮(zhèn)痛的譜效關系，對于具體藥效物質的定性、定量分析及作用機制研究尚需深入研究。