劉常麗，胡引娣，徐 雷,2*

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢430065；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾、寧心之功效[1]，為臨床常用大宗中藥材之一。2018 年國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，其中包含茯苓的方劑就占四分之一，足見(jiàn)其配伍廣泛和療效確切[2]。茯苓的主要化學(xué)成分有三萜類、多糖類、甾醇類、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等[3-4]，其中，三萜類化合物是茯苓的主要生物活性物質(zhì)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明, 三萜類成分具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、治療腎病、保肝、美白等多種藥理活性，常作為評(píng)價(jià)茯苓品質(zhì)的重要指標(biāo)[5-6]。除藥用外，茯苓也是《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》收錄的藥食同源藥材，在食品、日化等領(lǐng)域亦有廣泛應(yīng)用。

傳統(tǒng)茯苓以云南為道地產(chǎn)區(qū)，稱為“云苓”，體糯質(zhì)重，品質(zhì)最佳，但野生資源短缺，產(chǎn)量不高。自人工栽培以來(lái)，湖北、安徽、河南3 省接壤的大別山區(qū)逐漸發(fā)展成為茯苓主產(chǎn)區(qū)[7-8]。茯苓屬于木腐型真菌，主要通過(guò)菌絲體分泌胞外酶降解馬尾松、赤松等植物的纖維素和半纖維素提供營(yíng)養(yǎng)所需[9-11]。目前茯苓栽培主要采用段木方式，包括三種栽培模式：松林環(huán)境的林下仿生栽培；類似于傳統(tǒng)農(nóng)作物的旱田單作栽培；地面種植一年生淺根系草本農(nóng)作物、地下種植茯苓的立體栽培。隨著茯苓藥材生產(chǎn)和松林資源保護(hù)間的矛盾日益凸顯，為減少松木資源消耗，部分產(chǎn)區(qū)開(kāi)展了代料栽培模式的探索。為評(píng)價(jià)不同栽培模式茯苓品質(zhì)差異，擬采用HPLC 指紋圖譜技術(shù)對(duì)茯苓藥材的三萜類成分進(jìn)行分析研究，以期為代料栽培模式推廣應(yīng)用奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試新鮮茯苓菌核樣品均采集自湖北省羅田縣九資河鎮(zhèn)。仿生栽培、立體栽培、旱田栽培采用成年馬尾松段木，其中，仿生栽培模式為松樹(shù)林下環(huán)境栽培；立體栽培模式為林邊荒地地表種植芝麻，地下栽培茯苓；旱田栽培模式是在種植農(nóng)作物的大田種植茯苓。代料栽培模式為人工配制培養(yǎng)料栽培茯苓，主要配料為松木屑、松針、玉米粒、小麥粒、熟石膏等。4 種栽培模式均采用常規(guī)田間管理技術(shù)，4 月中旬種植，10 月下旬采收。樣品經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院徐雷副教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核。茯苓樣品共10 批，去皮后，采用趁鮮切制法加工，打粉備用，具體樣品信息見(jiàn)表1。

表1 茯苓樣品信息Tab. 1 Samples information of P. cocos

1.2 儀器與試藥

Shimadzu-LC-20ADXR 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；UVmini-1240 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；KQ-300 型超聲波清洗器（武漢岱摩斯清洗設(shè)備有限公司）。

茯苓酸（批號(hào)：F-006-190813，上海創(chuàng)賽科技有限公司）；磷酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó) Sigma-Aldrich公司）；水為超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品溶液制備 取茯苓酸對(duì)照品適量，精密稱定至棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3.2 供試品溶液制備 取茯苓藥材粉末（過(guò)80目篩），精密稱定約0.8 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，浸泡30 min 后精密稱定，超聲提取60 min，冷卻至室溫，精密稱定，補(bǔ)足失重，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液20 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸至約1 mL，殘留物用甲醇分次溶解、洗滌，轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾液用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得[12]。

1.3.3 色譜條件 采用Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動(dòng)相為0. 1%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～ 20 min，50% ～55%B；20 ～ 40 min，55% ～ 58%B；40 ～ 65 min，58% ～ 82% B；65 ～ 70 min，82% ～ 90%B；70 ～75 min，90% ～ 50%B；75 ～ 85 min，50%B），檢測(cè)波長(zhǎng)：242 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；記錄時(shí)間：85 min[13-14]。

1.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留 時(shí) 間RSD 為0 ～ 0.37%， 相 對(duì) 峰 面 積RSD 為0 ～ 4.26%，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）”進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度在0.985 以上，RSD為0.54%，表明儀器精密度良好。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0 ～ 0.27%，相對(duì)峰面積RSD為0 ～ 4.03%，相似度在0.950 以上，RSD 為1.52%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茯苓藥材粉末6 份，制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0 ～ 0.50%，相對(duì)峰面積RSD 為0 ～ 4.76%，相似度在0.947 以上，RSD 為1.13%，表明所采用方法重復(fù)性較好。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓 HPLC 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取10 批不同栽培模式的茯苓根據(jù)“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）”進(jìn)行分析，采用中位數(shù)法建立10 批茯苓三萜類成分的疊加指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜（R），共標(biāo)定11 個(gè)共有特征峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同栽培模式茯苓樣品HPLC 疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜（R）Fig. 1 The HPLC overlap fingerprints and reference fingerprints of P. cocos with different cultivated modes

以對(duì)照?qǐng)D譜為參照，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，10 批茯苓指紋圖譜的相似度均較高，分別為0.939、0.932、0.949、0.958、0.930、0.934、0.958、0.911、0.930、0.899，表明代料栽培模式與三種段木栽培模式所生產(chǎn)的茯苓藥材中所含主要三萜類成分相同。

2.2 不同栽培模式茯苓三萜類成分分析

在標(biāo)定的11 個(gè)共有峰中， 9 號(hào)色譜峰的峰面積較大，與其相鄰色譜峰的分離度亦較好，且在不同批次樣品中穩(wěn)定存在，故確定其為參照峰，計(jì)算其它各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，茯苓不同批次各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 值均較小，最大也僅0.74%，結(jié)果詳見(jiàn)表2，表明不同栽培模式生產(chǎn)的茯苓藥材中，所含的主要三萜類化學(xué)成分種類一致。

茯苓不同批次各個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD值均較大，RSD 值最小的是5 號(hào)色譜峰為12.72%，最大的是3 號(hào)色譜峰達(dá)112.02%，結(jié)果詳見(jiàn)表3，顯示各種三萜類成分在不同栽培模式的茯苓中含量差異較大，相同栽培模式的不同批次間相對(duì)峰面積差異較小。其中，代料栽培模式較其它三種段木栽培模式而言，1、4 號(hào)色譜峰相對(duì)面積明顯較小，2、3、8 號(hào)色譜峰相對(duì)面積明顯較大，表明不同栽培模式含有相似三萜類化學(xué)成分譜，但主要三萜類化學(xué)成分含量，不同栽培模式各有優(yōu)勢(shì)，部分以代料栽培為高，部分以段木栽培為高，部分比較接近。

表3 茯苓指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積Tab. 3 The relative peak areas of common peaks of P. cocos fingerprints

2.3 聚類分析

選擇 10 批茯苓樣品的11 個(gè)共有特征峰，運(yùn)用IBM SPSS（20.0）軟件，采用組間連接法，度量標(biāo)準(zhǔn)選用平方歐式距離，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[15]。當(dāng)分類距離d = 5 時(shí)，不同栽培模式10 批茯苓樣品被分為2 類，聚類分析樹(shù)狀圖見(jiàn)圖2。其中，S1-S7 聚為第1 類，S8-S10 聚為第2 類，結(jié)果顯示，除1 個(gè)批次旱田栽培模式樣品S8 外，仿生栽培、立體栽培、旱田栽培三種段木栽培模式聚為一類，代料栽培聚為一類。表明三種段木栽培模式三萜類化學(xué)成分含量更加接近，而代料栽培模式雖含有與段木栽培相似的三萜類物質(zhì)成分構(gòu)成，但含量存在一定差異。

圖2 茯苓樣品聚類分析樹(shù)狀圖Fig. 2 The cluster analysis tree of P. cocos samples

3 討論

茯苓藥材主要源自段木栽培，其生產(chǎn)需大量消耗松林資源，為減少對(duì)產(chǎn)區(qū)森林資源和生態(tài)環(huán)境的破壞，云南、安徽、湖北等地的部分產(chǎn)區(qū)已限制砍伐松林和開(kāi)荒種植茯苓，因此傳統(tǒng)段木栽培方式，已制約茯苓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。盡管主產(chǎn)區(qū)采取森林輪伐、禁伐等措施，但持續(xù)增長(zhǎng)的生產(chǎn)規(guī)模仍對(duì)道地產(chǎn)區(qū)松林資源保護(hù)和生態(tài)平衡產(chǎn)生較大威脅，代料栽培以松木屑和其它農(nóng)作物及廢棄秸稈為營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，大大降低了對(duì)成年松木資源的消耗，在保障藥材質(zhì)量的基礎(chǔ)上，基于代料栽培技術(shù)的茯苓生態(tài)種植模式研究及運(yùn)用，將是實(shí)現(xiàn)茯苓產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的探索途徑。

茯苓栽培后的腐朽木材中，纖維素、半纖維多被降解，剩下物質(zhì)以木質(zhì)素為主，相對(duì)含量高達(dá)50%，可作為木質(zhì)素的來(lái)源，用于樹(shù)脂、分散劑、表面活性劑等的制備或生產(chǎn)有機(jī)肥料等[10]，而在道地產(chǎn)區(qū)這些腐朽木材往往多被丟棄，造成較大資源浪費(fèi)，給生態(tài)環(huán)境也帶來(lái)壓力，如何實(shí)現(xiàn)腐朽木材資源最有效利用也是茯苓產(chǎn)業(yè)發(fā)展過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。因此，茯苓產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物的綠色價(jià)值還有待充分挖掘，需要基于中藥資源循環(huán)理念開(kāi)展藥材生產(chǎn)過(guò)程副產(chǎn)物的資源化利用，以提升茯苓產(chǎn)業(yè)綜合效益和產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力，為生態(tài)環(huán)境保護(hù)及道地產(chǎn)區(qū)美麗鄉(xiāng)村建設(shè)提供有力支撐[16]。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同栽培模式茯苓HPLC 指紋圖譜研究，表明代料栽培技術(shù)所生產(chǎn)的茯苓藥材，與三種生境的段木栽培相比，含有相似的三萜類化學(xué)成分譜。進(jìn)一步通過(guò)聚類分析，段木栽培模式和代料栽培模式的茯苓藥材，分別聚為一類，顯示兩者雖然成分組成相似但含量存在差異。研究為不同栽培模式茯苓藥材鑒別以及代料栽培技術(shù)推廣應(yīng)用提供了科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。