李懇懇 王松磊 羅瑞明 馬 亮 劉 麗 魏培媛 張 也

(寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，銀川 750021)

0 引 言

作為在人體內(nèi)被直接吸收利用的單糖，葡萄糖是人體新陳代謝的重要物質(zhì)，但對于嬰幼兒來講，長期食用含糖食品會導(dǎo)致肥胖癥、食欲降低及齲齒等健康問題[1]。由于國內(nèi)不少廠家為提升奶制品的口感而使用葡萄糖進(jìn)行摻雜，因此對奶制品中葡萄糖的檢測十分必要。目前葡萄糖的檢測方法主要有比色法[2]、氣相色譜法[3]、熒光檢測法[4]和電化學(xué)傳感器法[5]等，其中比色法和氣相色譜法在檢測時不僅非常耗時，且樣品預(yù)處理過程煩瑣[6?7]，而熒光檢測法易受到其他物質(zhì)的干擾[8]。近年來，電化學(xué)傳感器法由于具有優(yōu)異的靈敏度、快速的響應(yīng)時間和良好的穩(wěn)定性等優(yōu)點被人們認(rèn)為是檢測葡萄糖的重要方法之一[9?10]。目前用于葡萄糖檢測的傳感器以酶類傳感器為主[11?12]，雖然該類傳感器對葡萄糖的選擇性極高，但其進(jìn)一步的應(yīng)用因為高成本及天然酶的不穩(wěn)定性而遇到了重重阻礙[13?14]。

為解決這些問題，無酶葡萄糖電化學(xué)傳感器因具有長期穩(wěn)定性及可重復(fù)性等優(yōu)點引起人們的極大關(guān)注[15]，但是無酶葡萄糖傳感器技術(shù)的發(fā)展受到陽極材料制備過程復(fù)雜及電極的電化學(xué)活性界面難控制的影響[16?17]。近年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)過渡金屬的納米材料是制備葡萄糖電化學(xué)傳感器最合適的材料之一[18?19]。據(jù)報道，鎳基材料通過氧化還原對Ni3+/Ni2+的相互轉(zhuǎn)化進(jìn)行電催化循環(huán)，因此基于鎳的葡萄糖傳感器比其他過渡金屬基傳感器展現(xiàn)出更高的靈敏度[20?21]。Wang等[22]的研究表明，Ni3+與 Ni2+的比例增加會使電極具有更高的電催化活性，但是其在富氧環(huán)境下耐久性不足的缺點限制了在實際中的應(yīng)用。自支撐電極是目前一種新型的電極類型，該類電極較化學(xué)修飾電極相比具有更高的穩(wěn)定性和催化活性[23]，而導(dǎo)電性基底碳紙具有三維結(jié)構(gòu)和良好的穩(wěn)定性[24]，是制備自支撐電極的最佳選擇材料。

針對葡萄糖無酶傳感器快速檢測需求，我們采用一步水熱法制備基于碳紙負(fù)載的過渡金屬碳酸鹽材料自支撐電極，構(gòu)建出無酶葡萄糖電化學(xué)傳感器，該傳感器具有快速的響應(yīng)時間和較高的靈敏度，可以實現(xiàn)對乳制品中葡萄糖的有效檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所用儀器包括：CHI?660E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)、TGL?16M型高速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)、FCH?202型數(shù)顯加熱磁力攪拌器(弗魯克有限公司)、Smart Lab X射線衍射儀(日本理學(xué)株式會社)、SU4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)。

Ni(NO3)2·6H2O、尿素、丙酮、無水乙醇、乙二醇和葡萄糖購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。NaCl、NaOH、抗壞血酸(AA)、乳糖(Lac)、L?半胱氨酸(L?Cys)和果糖(Fru)購自上海瑞恩有限公司。碳紙購自蘇州晟爾諾科技有限公司。乳制品樣品均購自某超市。所用試劑均為分析純，所用水為去離子水。

1.2 實驗過程

1.2.1 碳紙預(yù)處理

將碳紙的尺寸裁剪為2cm×3 cm的大小，依次用丙酮、無水乙醇和去離子水超聲清洗10 min，置于60℃真空干燥箱內(nèi)干燥8 h，冷卻至室溫后備用。

1.2.2 碳紙負(fù)載鎳基材料電極的制備

采用簡便的一步水熱法制備。首先稱取4 mmol Ni(NO3)2·6H2O和15 mmol尿素于燒杯中，加入由1.5 mL超純水和13.5 mL乙二醇配成的水熱反應(yīng)液，隨后將混合溶液持續(xù)攪拌20 min使其混合均勻。配制好的前驅(qū)體溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應(yīng)釜中，將上一步處理好的碳紙倚靠于反應(yīng)釜的聚四氟乙烯內(nèi)膽中，密封后放入160℃的烘箱中連續(xù)反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫。隨后將碳紙取出，依次用無水乙醇和超純水各洗滌數(shù)次至無顆粒脫落，反應(yīng)釜內(nèi)剩余溶液中的沉淀經(jīng)離心干燥后用于后續(xù)表征。最后將制備的工作電極置于60℃真空干燥箱內(nèi)干燥8 h，即得到生長于碳紙上的Ni(HCO3)2納米顆粒(NPs)，記為Ni(HCO3)2NPs/CP。

1.2.3 材料表征

采用粉末X射線衍射(XRD)對樣品進(jìn)行物相分析。測試條件：工作電壓45 kV、電流200 mA、Cu靶Kα輻射源、波長0.154 18 nm、掃描范圍5°～85°。樣品的形貌采用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行分析，加速電壓15 kV。

1.2.4 乳制品樣品的制備

乳制品樣品的制備參考GB/T 5009.8?2016[25]中的樣品處理過程并進(jìn)行了改進(jìn)，具體過程如下：

固體樣品的制備：稱取粉碎后的試樣5 g于100 mL容量瓶中，加水50 mL溶解并緩慢加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，定容至刻度，超聲30 min后用干燥濾紙過濾，濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾后即得到處理好的樣品。

液體樣品的制備：取試樣200 mL于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行除水處理，隨后取試樣2 g于50 mL容量瓶中，定容至刻度，充分搖勻后用干燥濾紙過濾，濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾后即得到處理好的樣品。

1.2.5 電化學(xué)性能測試

使用CHI?660E型電化學(xué)工作站在室溫下進(jìn)行所有的電化學(xué)測試，采用常規(guī)的三電極體系，以多用鉑片電極夾將制備好的Ni(HCO3)2NPs/CP固定作為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。所用的電化學(xué)測試方法主要包括循環(huán)伏安(CV)法和時間-電流響應(yīng)法，支持電解質(zhì)為0.1 mol·L-1NaOH溶液，掃描電位窗口范圍為0～0.7 V(vs SCE)，掃描速率(v)為100 mV·s-1。此外，在所有測試中的工作電極幾何面積控制在0.25 cm2。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的形貌表征

以SEM觀察樣品的微觀形貌特征，結(jié)果如圖1所示。圖1a為碳紙基底的SEM圖，可看出碳紙基底由直徑約為10 μm的碳纖維構(gòu)成，其表面光滑且溝槽略淺。圖1b、1c為Ni(HCO3)2NPs/CP的低倍SEM圖像，可看出在碳纖維上均勻生長出Ni(HCO3)2NPs并形成致密的結(jié)構(gòu)，有利于電催化氧化時對葡萄糖分子的吸附。圖1d的高倍SEM圖像清晰地展示出Ni(HCO3)2呈現(xiàn)多面體結(jié)構(gòu)，其分散性一般且呈聚集狀態(tài)，粒徑約為50 nm，緊密相連，在增加了表面積的同時提供了更多的催化活性位點。

圖1 (a)裸碳紙和(b～d)Ni(HCO3)2NPs/CP的SEM圖Fig.1 SEM images of(a)bare carbon paper and(b?d)Ni(HCO3)2NPs/CP

XRD能夠?qū)Σ牧系慕M成、晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度等進(jìn)行解釋說明。Ni(HCO3)2NPs/CP的XRD圖如圖2所示。從圖中可以看出衍射峰分別位于2θ=14.8°、25.9°、33.6°、37.0°、40.1°、43.0°、45.7°、55.7°和62.5°處，與 Ni(HCO3)2標(biāo)準(zhǔn)卡片(PDF No.15?0782)基本吻合，分別對應(yīng) Ni(HCO3)2的(110)、(211)、(310)、(222)、(321)、(400)、(330)、(510)和(440)晶面，說明所制備的材料為Ni(HCO3)2晶體，其峰型尖銳則表明結(jié)晶性能良好。另外，圖中沒有雜相衍射峰，說明在水熱反應(yīng)的高溫高壓環(huán)境下，尿素完全分解并與鎳源反應(yīng)生成的產(chǎn)物晶型單一、純度較高。

圖2 Ni(HCO3)2NPs/CP的XRD圖Fig.2 XRD pattern of Ni(HCO3)2NPs/CP

2.2 Ni(HCO3)2NPs的合成及檢測原理

Ni(HCO3)2NPs通過一步水熱法合成，其在水熱過程中的形成機理可推斷(圖3)為尿素在水熱過程中會分解為NH3·H2O和CO2，這2種物質(zhì)會慢慢水合形成 OH-、CO32-、HCO3-離子，Ni2+與 HCO3-反應(yīng)生成Ni(HCO3)2。具體的反應(yīng)式如下：

在含葡萄糖的堿性溶液中，電極表面的Ni(HCO3)2NPs與溶液中OH-結(jié)合生成NiOOH，含有高價鎳的NiOOH將葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯，導(dǎo)致加入葡萄糖之后的氧化峰電流密度增大，同時生成Ni(OH)2，Ni(OH)2又與OH-結(jié)合生成NiOOH，保證了催化氧化反應(yīng)的不間斷進(jìn)行。電極表面發(fā)生的可能電化學(xué)反應(yīng)如圖3所示。

圖3 Ni(HCO3)2NPs水熱過程形成機理及其對葡萄糖的傳感原理Fig.3 Formation mechanism in hydrothermal process and sensing principle for glucose of Ni(HCO3)2NPs

2.3 Ni(HCO3)2NPs/CP自支撐電極對葡萄糖的傳感性能

2.3.1 Ni(HCO3)2NPs/CP對葡萄糖的CV研究

采用循環(huán)伏安法來評估Ni(HCO3)2NPs/CP的電催化性能。圖4a展示了裸碳紙在含5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中的電化學(xué)行為，裸碳紙在NaOH溶液中含有/不含有葡萄糖時均沒有明顯的氧化還原峰出現(xiàn)，說明裸碳紙在葡萄糖電化學(xué)氧化過程中表現(xiàn)相對不活躍，不能將其直接應(yīng)用于對葡萄糖的檢測。圖4b表明當(dāng)其表面負(fù)載Ni(HCO3)2NPs時，可觀察到一對明顯的氧化還原峰，同時峰值電流的顯著增大則說明Ni(HCO3)2NPs對葡萄糖具有良好的電化學(xué)響應(yīng)。制備的Ni(HCO3)2NPs/CP展現(xiàn)的優(yōu)異電化學(xué)性能可歸功于以下幾個方面：第一，過渡金屬碳酸鹽與導(dǎo)電材料能夠產(chǎn)生協(xié)同作用提高其導(dǎo)電性，同時還能穩(wěn)定活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)，此外，碳紙能夠有效抑制晶體的過度生長從而獲得尺寸為納米級別的過渡金屬碳酸鹽顆粒；第二，Ni(HCO3)2NPs/CP的納米結(jié)構(gòu)提供了更大的比表面積和更多的活性位點，利于催化氧化反應(yīng)的進(jìn)行；第三，NiOOH與葡萄糖反應(yīng)生成的Ni(OH)2可在電極表面再次反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)镹iOOH，因此Ni(HCO3)2修飾電極檢測葡萄糖時氧化峰電流增大。

圖4 樣品在無葡萄糖和含有5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中的CV曲線Fig.4 CV curves of the samples in 0.1 mol·L-1NaOH solution without glucose and containing 5 mmol·L-1glucose

為研究Ni(HCO3)2NPs/CP的電催化動力學(xué)控制過程[26]，記錄其在10～100 mV·s-1不同掃描速率下的CV曲線，結(jié)果如圖5a所示。圖中顯示隨著掃描速率的增加，峰值電流不斷增大，陽極峰電位正向偏移，陰極峰電位負(fù)向偏移，這是因為當(dāng)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)時，電化學(xué)反應(yīng)和電解質(zhì)擴散相互制約，當(dāng)掃描速率過快時電化學(xué)反應(yīng)發(fā)生快，擴散速度相對較慢，限制了電化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致強極化作用，使電位出現(xiàn)偏移，表明在葡萄糖的電化學(xué)氧化過程中存在著動力學(xué)限制[27]。圖5b表明峰值電流與掃描速率的平方根成良好的線性關(guān)系，氧化峰電流線性方程為y=1.065 2x-0.917 6(R2=0.999)，還原峰電流線性方程為y=-0.822 9x+0.884 3(R2=0.998)，說明Ni(HCO3)2NPs/CP上的葡萄糖電化學(xué)氧化過程是一個典型的擴散控制過程[28]。

圖5 (a)Ni(HCO3)2NPs/CP在含有5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中的不同掃速下的CV曲線;(b)峰值電流與掃速平方根的校準(zhǔn)曲線Fig.5 (a)CV curves of Ni(HCO3)2NPs/CP in 0.1 mol·L-1NaOH solution containing 5 mmol·L-1glucose at different scan rates;(b)Calibration curve of peak current and square root of scan rate

2.3.2 電解質(zhì)溶液pH值的優(yōu)化

NiOOH在葡萄糖電化學(xué)催化氧化過程中起關(guān)鍵作用，而OH-則參與生成NiOOH，為此研究了pH值對Ni(HCO3)2NPs/CP電催化氧化葡萄糖的影響。圖6a展示了在5 mmol·L-1葡萄糖中Ni(HCO3)2NPs/CP的電流響應(yīng)強度與pH值的關(guān)系，可明顯看到隨pH值的增加，氧化峰向低電勢方向移動，還原峰向高電勢方向移動。圖6b揭示了陽極峰值電勢與pH值之間的線性關(guān)系，回歸方程為y=-0.109x+1.913(R2=0.996)。在典型的Nernst過程中，轉(zhuǎn)移的質(zhì)子數(shù)與電子數(shù)相等，斜率為-0.059 V[19,29]。但是，此修飾電極的斜率為-0.109 V，表明在葡萄糖的電化學(xué)氧化過程中轉(zhuǎn)移的質(zhì)子數(shù)與電子數(shù)之間存在差異，即表明在電催化氧化葡萄糖過程中，Ni(HCO3)2NPs/CP表面同時發(fā)生多個電化學(xué)反應(yīng)，也進(jìn)一步驗證了上述電催化機理。當(dāng)pH>13時，峰值電流的突然增大表明有大量的氧氣逸出，發(fā)生析氧反應(yīng)，因此所有的電化學(xué)測試均在pH=13下進(jìn)行。

圖6 (a)Ni(HCO3)2NPs/CP在含有5 mmol·L-1葡萄糖的不同pH值NaOH溶液中的CV曲線;(b)Ni(HCO3)2NPs/CP的CV曲線的陽極電位與pH值之間的線性關(guān)系Fig.6 (a)CV curves of Ni(HCO3)2NPs/CP in NaOH solutions containing 5 mmol·L-1glucose at different pH values;(b)Linear relationship between anode potential of CV curve of Ni(HCO3)2NPs/CP and pH value

2.3.3 Ni(HCO3)2NPs/CP對葡萄糖的電流響應(yīng)

采用時間-電流響應(yīng)曲線評估所制傳感器對葡萄糖檢測的靈敏度和線性范圍。首先考察了外加電位的影響，每間隔100 s連續(xù)添加葡萄糖對0.45、0.50和0.55 V三個電位進(jìn)行測試，最終獲得最佳電位，結(jié)果如圖7a所示?？煽闯鲭娏髅芏入S所添葡萄糖濃度的增加而變化，與此同時，隨著工作電位的增加，電流增量先增大后減小，0.50 V時增量達(dá)到最大，因此選擇0.50 V為最佳工作電位。

在最佳電位下，測定了Ni(HCO3)2NPs/CP隨葡萄糖濃度不斷變化的時間-電流響應(yīng)曲線(圖7b)，圖7b插圖部分展示了葡萄糖在較低濃度范圍內(nèi)(2.95～8.45 μmol·L-1)的測試結(jié)果。通過記錄相鄰濃度間穩(wěn)態(tài)電流的階躍時間，研究了Ni(HCO3)2NPs/CP對葡萄糖的響應(yīng)時間。如圖7c所示，電流密度的階躍只需3.1 s，表明Ni(HCO3)2NPs/CP對葡萄糖具有快速的響應(yīng)時間。圖7d為葡萄糖濃度與電流密度之間的校正曲線，在葡萄糖濃度為2.95～1.02 mmol·L-1時，線性方程為y=0.935 6x+0.060 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.996，由擬合曲線計算出該傳感器的檢測靈敏度為935 μA·L·mmol-1·cm-2。此外，根據(jù)方程 LOD=3σ/k[30]可得檢出限(LOD)為 0.98 μmol·L-1(S/N=3)。以上結(jié)果表明，Ni(HCO3)2NPs/CP修飾電極對葡萄糖的檢測具有良好的響應(yīng)，與已報道的同類型傳感器相比(表1)，表現(xiàn)出較高的靈敏度和較低的檢出限，進(jìn)一步表明該電極材料作為葡萄糖無酶傳感器的優(yōu)勢。

表1 Ni(HCO3)2NPs/CP與已報道的葡萄糖檢測電極的性能對比Table 1 Comparison of performance of Ni(HCO3)2NPs/CP and reported glucose detection electrode

圖7 Ni(HCO3)2NPs/CP對葡萄糖的檢測:(a)在不同電位下的電流響應(yīng),(b)在0.50 V下連續(xù)添加葡萄糖的電流響應(yīng)(插圖:900～1 400 s范圍),(c)響應(yīng)時間圖,(d)葡萄糖濃度與電流密度的線性關(guān)系Fig.7 Ni(HCO3)2NPs/CP for glucose detection:(a)responses at different potentials,(b)current response of Ni(HCO3)2NPs/CP with continuous addition of glucose at 0.50 V(Inset:in the range of 900?1 400 s),(c)response time diagram,(d)linear relationship between glucose concentration and current density

2.3.4 Ni(HCO3)2NPs/CP修飾電極的穩(wěn)定性能和抗干擾性能

在無酶葡萄糖傳感器的實際應(yīng)用中，其穩(wěn)定性能和抗干擾性能至關(guān)重要。為考察修飾電極對葡萄糖響應(yīng)的穩(wěn)定性，對Ni(HCO3)2NPs/CP修飾電極進(jìn)行100次循環(huán)掃描，結(jié)果表明隨循環(huán)次數(shù)的增加，電流逐漸趨于穩(wěn)定，將第20次和第80次的CV曲線進(jìn)行對比，結(jié)果如圖8a所示，可清晰看出2次掃描的氧化峰峰電流分別為7.11和7.42 mA·cm-2，相對變化率為4.2%，而還原峰峰電流的相對變化率幾乎為0，說明所制電極具有良好的穩(wěn)定性能。對于不同批次電極的重現(xiàn)性及同一電極放置一段時間后的穩(wěn)定性，考察了7支傳感器在相同條件下對葡萄糖的響應(yīng)電流強度及同一傳感器放置不同天數(shù)下對葡萄糖的響應(yīng)電流強度，結(jié)果如圖8b所示?？梢钥闯?支不同傳感器之間的電流強度值相差不大，通過計算得出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.24%。此外，在相同的測試環(huán)境下，連續(xù)7 d考察該電極對等量葡萄糖的響應(yīng)電流強度值，由圖8c可看出Ni(HCO3)2NPs/CP電極在儲存7 d后響應(yīng)電流強度值下降較小，相對于第1天仍保持約89%的響應(yīng)電流強度。以上結(jié)果均表明Ni(HCO3)2NPs/CP電極在無酶催化檢測葡萄糖時具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。通過時間-電流法對Lac、Fru、AA、NaCl和L?Cys等一些常見干擾物進(jìn)行測試評估，結(jié)果如圖8d所示。添加葡萄糖時獲得明顯的電流響應(yīng)，而Lac、Fru和NaCl的電流響應(yīng)非常微弱，AA和L?Cys的電流響應(yīng)僅為葡萄糖的12%。由于在奶制品樣品中AA和L?Cys的添加量遠(yuǎn)低于葡萄糖的含量，因此其對電極的影響可忽略不計，當(dāng)再次添加葡萄糖時仍能觀察到較強的電流響應(yīng)。因此基于Ni(HCO3)2NPs/CP所構(gòu)建的無酶葡萄糖傳感器具有良好的專一性以及一定的抗干擾性能。

圖8 (a)Ni(HCO3)2NPs/CP在含有5 mmol·L-1葡萄糖的0.1 mol·L-1NaOH溶液中第20圈和第80圈的CV曲線;(b)不同批次電極的重現(xiàn)性;(c)同一電極不同時間的穩(wěn)定性;(d)Ni(HCO3)2NPs/CP在0.5 V電壓下對0.1 mol·L-1葡萄糖和 0.01 mol·L-1干擾物的電流響應(yīng)Fig.8 (a)CV curves of Ni(HCO3)2NPs/CP in 0.1 mol·L-1NaOH solution containing 5 mmol·L-1glucose at the 20th and 80th cycle;(b)Reproducibility of different batches of electrodes;(c)Stability of the same electrode at different times;(d)Current response of Ni(HCO3)2NPs/CP to 0.1 mol·L-1glucose and 0.01 mol·L-1interference at 0.5 V voltage

2.3.5 奶制品樣品分析

通過對奶制品樣品的加標(biāo)回收來評估所制電極的性能。樣品的初始濃度值由GB/T 5009.8?2016[25]中的高效液相色譜法獲得。然后用Ni(HCO3)2NPs/CP工作電極對3個奶制品樣品的葡萄糖含量進(jìn)行測定，每個樣品測量3次，結(jié)果如表2所示。檢測結(jié)果表明Ni(HCO3)2NPs/CP工作電極檢測到的樣品中葡萄糖濃度加標(biāo)回收率在99%～101%之間，證明了用該修飾電極所制備的葡萄糖無酶傳感器在實際應(yīng)用中的可行性。

表2 部分奶制品樣品的檢測結(jié)果Table 2 Detection results for some dairy product samples

3 結(jié)論

以導(dǎo)電碳紙作為基底采用一步水熱法原位合成碳酸氫鎳納米顆粒，制備出Ni(HCO3)2NPs/CP工作電極構(gòu)建無酶葡萄糖電化學(xué)傳感器。電化學(xué)測試表明該電極對葡萄糖表現(xiàn)出優(yōu)異的催化性能，Ni(HCO3)2NPs大大提高了復(fù)合材料的導(dǎo)電性，并為催化反應(yīng)提供更多的反應(yīng)位點。該傳感器具有高靈敏度和低檢出限，同時還具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和抗干擾能力，在奶制品樣品檢測中應(yīng)用良好。