鄭子良 曲波濤 楊曉榮 劉 玲 張瑞平

(山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，山西白求恩醫(yī)院，山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，太原 030032)

0 引言

惡性腫瘤的全球發(fā)病率和死亡率逐年攀升，在許多國(guó)家已成為民眾第一大致死原因，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。近年來(lái)，惡性腫瘤被認(rèn)為是精準(zhǔn)醫(yī)療(precision medicine)主要應(yīng)用的重大疾病之一，利用分子影像技術(shù)(molecular imaging)可進(jìn)行腫瘤的早期診斷與邊界精確化，構(gòu)建個(gè)性化治療，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的高效精準(zhǔn)診療[2]。目前，臨床對(duì)于腫瘤治療的方法主要包括手術(shù)、化療、放射治療以及免疫治療等，但這些治療方式存在對(duì)正常組織器官的損傷、腫瘤治療效果有限、增加腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移幾率等諸多不足，嚴(yán)重影響腫瘤的診斷與治療效果[3]。

光熱治療(photothermal therapy，PTT)作為一種高效的腫瘤治療手段，由于其侵襲性小和時(shí)空選擇性高等優(yōu)勢(shì)在近年來(lái)受到廣泛關(guān)注[4]。與傳統(tǒng)治療方式相比，PTT具有操作簡(jiǎn)單、微創(chuàng)、安全、治療時(shí)間短等特點(diǎn)，通過光熱劑將照射激光的光能以非熱輻射形式轉(zhuǎn)化為熱能，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷[5]。目前已開發(fā)用于PTT的納米光熱劑包括有機(jī)材料和無(wú)機(jī)材料2大類[6]，如吲哚菁綠[7]、聚吡咯[8]、多巴胺[9]等有機(jī)材料具有良好的光熱性能，但光熱穩(wěn)定性差，光漂白現(xiàn)象嚴(yán)重，限制了其在腫瘤PTT中的應(yīng)用。因此，科學(xué)家將研究重心轉(zhuǎn)向更加穩(wěn)定且結(jié)構(gòu)易于控制的無(wú)機(jī)納米材料，這些材料主要包括金屬納米顆粒(金納米棒[10]、鈀納米片[11]、合金納米顆粒[12]等)、碳納米材料(碳量子點(diǎn)[13]、碳球[14])、半導(dǎo)體納米材料(硫化銅[15]、硫化銀[16])等。無(wú)機(jī)納米材料擁有生物毒性低、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、光熱靈敏度高、光轉(zhuǎn)換效率高等優(yōu)勢(shì)，極具臨床應(yīng)用前景。PTT實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療離不開影像學(xué)技術(shù)的有效引導(dǎo)。光聲(photo?acoustic，PA)成像作為一種新型的光學(xué)成像技術(shù)，同樣是利用光熱效應(yīng)，將光轉(zhuǎn)化為聲波實(shí)現(xiàn)成像[17]。光聲成像結(jié)合了光學(xué)成像和超聲成像，具有較深的組織穿透性，可以利用高的分辨率精準(zhǔn)定位腫瘤、清晰勾勒腫瘤輪廓，從而有效引導(dǎo)光熱治療[18]。特別是第二近紅外區(qū)(the second near?infrared window，NIR?Ⅱ，1000～1700 nm)的PA成像，由于該區(qū)域人體各組織器官對(duì)光子的吸收、散射顯著降低，無(wú)背景信號(hào)干擾，與常規(guī)近紅外一區(qū)PA成像相比，有效改善了成像質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)了良好的空間分辨率、組織穿透力和高信噪比PA成像性能[19]。因此，利用具有NIR?Ⅱ光學(xué)吸收性能的納米藥物可有效結(jié)合PA成像與PTT治療性能，實(shí)現(xiàn)高效的腫瘤診療一體化作用效果。

理想的NIR?Ⅱ納米光熱劑不僅具備良好的診療性能，還要在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)有效聚集才能達(dá)到最佳效果。眾所周知，由于納米藥物在腫瘤部位的吸收和代謝速率是動(dòng)態(tài)平衡的，只有當(dāng)沉積量達(dá)到一定數(shù)量時(shí)才能進(jìn)行診斷和治療[20]。然而，僅利用高滲透長(zhǎng)滯留(enhanced permeability and retention，EPR)效應(yīng)促使納米藥物向腫瘤區(qū)域遞送，易出現(xiàn)積累與滯留不足，影響最終的診療效果[21]。因此，如何增強(qiáng)納米藥物在腫瘤部位的有效富集，是提升診療性能至關(guān)重要的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。惡性腫瘤細(xì)胞不受周圍細(xì)胞因子影響與機(jī)體調(diào)控，從而導(dǎo)致形態(tài)、細(xì)胞代謝、分化能力及組織血供等方面的顯著差異，促使腫瘤區(qū)域呈現(xiàn)個(gè)性化微環(huán)境特性[22]。研究表明，帶正電荷的納米顆粒易于通過特殊的胞吞途徑穿透深層腫瘤，但帶正電的納米粒子在循環(huán)期間很容易被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)(reticuloendothelial system，RES)清除，通過表面修飾，可使得納米顆粒在腫瘤微環(huán)境作用下，實(shí)現(xiàn)電荷翻轉(zhuǎn)，正電荷特異性表達(dá)[23]?；谀[瘤區(qū)域諸多特點(diǎn)，研究者致力于開發(fā)電荷翻轉(zhuǎn)的刺激響應(yīng)型納米平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)腫瘤部位表面電荷和顆粒大小等物理化學(xué)性質(zhì)的響應(yīng)性改變，以提升納米藥物的靶向性和富集量，減少毒副作用[24]。因此，通過簡(jiǎn)單高效的方式將正、負(fù)電性優(yōu)勢(shì)結(jié)合，開發(fā)特異性腫瘤診療藥物極具臨床應(yīng)用前景。

綜上所述，我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)筑一種腫瘤微環(huán)境響應(yīng)性翻轉(zhuǎn)表面電荷納米平臺(tái)Pt?Cu@PLL@HA(圖1，PLL=聚賴氨酸，HA=透明質(zhì)酸)，通過腫瘤特異性靶向聚集，實(shí)現(xiàn)在NIR?ⅡPA成像引導(dǎo)下對(duì)腫瘤的精準(zhǔn)NIR?ⅡPTT治療。選取具有良好NIR?Ⅱ光學(xué)吸收性能的Pt?Cu合金納米材料作為核相，通過層層(layer?by?layer，LBL)自組裝技術(shù)，在其表面依次均勻包覆帶正電荷的PLL和帶負(fù)電荷的HA。利用HA的負(fù)電性增加納米平臺(tái)體內(nèi)循環(huán)過程，結(jié)合EPR效應(yīng)與HA的主動(dòng)靶向性在腫瘤部位高效富集。由于腫瘤組織中的透明質(zhì)酸酶(HAase)可將Pt?Cu@PLL@HA外部HA層(-)快速降解，暴露出內(nèi)部PLL層(+)，納米平臺(tái)發(fā)生響應(yīng)性電荷翻轉(zhuǎn)。帶有正電荷的Pt?Cu@PLL在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞過程中，易呈現(xiàn)溶酶體逃逸現(xiàn)象，增加納米平臺(tái)的腫瘤細(xì)胞攝取量，從而大幅提升腫瘤診療效果，為構(gòu)筑NIR?Ⅱ診療一體化納米平臺(tái)提供新思路。

圖1 Pt?Cu@PLL@HA納米平臺(tái)的構(gòu)筑及其診療機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic illustration for preparation and therapeutic mechanism of Pt?Cu@PLL@HA nanoplatform

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 藥品及試劑

聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Mw=30 000)、硝酸銅(Cu(NO3)2·3H2O)、六 水 合 氯 鉑 酸 (H2PtCl6·6H2O，37.5%)、甘氨酸、PLL(Mw=150 000)、HA 均購(gòu)于阿拉丁生化科技有限公司(中國(guó)上海)；臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)于Sigma?Aldrich公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒Cell Counting Kit?8(CCK?8)購(gòu)于博斯特生物技術(shù)有限公司。所有試劑均未進(jìn)行進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(ρ>18 MΩ)。

1.2 Pt-Cu合金的制備

室溫條件下，將80 mg PVP加入2.5 mL超純水中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，加入預(yù)先配制的1 mL H2PtCl6(20 mmol·L-1)溶液和 1 mL Cu(NO3)2溶液(20 mmol·L-1)。隨后，將40.0 mg甘氨酸加入混合溶液中，25℃下高速攪拌30 min，形成均勻的黃綠色溶液。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的15 mL高壓反應(yīng)釜中，在200℃下反應(yīng)6 h，冷卻至室溫。將混合溶液以4 500 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心，用超純水洗滌3次，固體產(chǎn)物真空冷凍干燥得到Pt?Cu合金。

1.3 Pt-Cu@PLL@HA的制備

采用LBL自組裝技術(shù)制備樣品。將5 mL Pt?Cu合金水溶液(2 mg·mL-1)分散于10 mL超純水中，超聲 15 min，滴加 2 mL PLL(10 mg·mL-1)水溶液，在37℃下攪拌1 h，離心收集固體Pt?Cu@PLL。隨后，將得到的Pt?Cu@PLL分散在5 mL去離子水中，緩慢加入10 mL HA(2 mg·mL-1)水溶液。反應(yīng)1 h后離心收集Pt?Cu@PLL@HA，用超純水洗滌數(shù)次，固體沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得到Pt?Cu@PLL@HA。

1.4 表征分析儀器

采用JEM 2100F(200 kV)型透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)材料的形貌及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用Rigaku D/max?2500 型衍射儀測(cè)定樣品在 5°～80°范圍內(nèi)的X 射線衍射(XRD)圖，工作條件：CuKα輻射(λ=0.154 059 8 nm)、管電壓50 kV、管電流200 mA、掃描速度 5(°)·min-1。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)的尺寸分布和樣品的ζ電位在Malvern電位分析儀上測(cè)試。X射線光電子能譜(XPS)的測(cè)定使用Thermo?VG Scientific ESCALAB250光譜儀，以AlKα為射線源(150 W)。FT?IR光譜在Vertex PerkinElmer 580 BIR分光光度計(jì)(Bruker)上采集，使用KBr壓片進(jìn)行制樣分析。樣品的UV?Vis光譜采用TU?1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(PerkinElmer)測(cè)定。熱重-差熱(TG?DTA)分析采用Rigaku的TG 8101D型儀器，在空氣氣氛中以10℃·min-1的加熱速率，從室溫升溫至800℃。

1.5 體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

以購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(中國(guó)上海)的小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)為細(xì)胞模型，以RPMI 1640為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)10%的滅活胎牛血清(FBS)，加入1%雙抗(青霉素/鏈霉素)防止細(xì)菌污染。細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的氣氛條件下培養(yǎng)。采用標(biāo)準(zhǔn)CCK?8方法分別測(cè)定Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA的體外細(xì)胞毒性以及激光照射后細(xì)胞殺傷性能。將4T1細(xì)胞懸液以每孔8 000個(gè)的密度均勻播種在96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的條件下培養(yǎng)24 h，貼壁后，棄去培養(yǎng)液，向孔中加入100 μL含不同濃度Pt?Cu或Pt?Cu@PLL@HA(0、12.5、25、50、100、200和400 μg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基。孵育 24 h后，去除含有樣品的培養(yǎng)基，加入 10 μL CCK?8 溶液(5 mg·mL-1)與培養(yǎng)液混合，共孵育2 h，使用酶標(biāo)儀(BioTek Epoch 2)在450 nm處測(cè)量吸光度。

對(duì)于體外細(xì)胞光熱性能分析，將1×105個(gè)4T1細(xì)胞置于直徑35 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h。經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH=7.4)沖洗后，用含不同濃度的Pt?Cu或Pt?Cu@PLL@HA(0、12.5、25、50、100、200和 400 μg·mL-1)溶液孵育 4 h。隨后用 PBS 沖洗細(xì)胞，并浸泡在300 μL的介質(zhì)中，在強(qiáng)度為1.0 W·cm-2的1 064 nm激光下照射5 min，細(xì)胞在37℃下再培養(yǎng)30 min。加入CCK?8溶液共孵育2 h，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞殺傷情況；同樣條件下，采用臺(tái)盼藍(lán)染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.6 活體PA成像

雌性BALB/c裸鼠(6～8周齡，17～19 g)購(gòu)自北京維通麗華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，所有動(dòng)物操作規(guī)程均符合《中國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用條例》的標(biāo)準(zhǔn)。動(dòng)物協(xié)議經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物使用與關(guān)愛委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2016LL141，中國(guó)太原)。將小鼠馴化至少7 d后，在小鼠左腿背皮下注射4T1細(xì)胞(3×106個(gè))建立瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到75 mm3以上時(shí)，在尾靜脈注射Pt?Cu@PLL@HA材料(15 mg·kg-1)，利用實(shí)時(shí)多光譜光聲層析成像系統(tǒng)(MSOT)，分別于注射前及注射后 1、4、8、12、24 h麻醉小鼠進(jìn)行PA成像，研究材料在腫瘤部位的聚集特性。

1.7 活體光熱治療

將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組(每組4只)進(jìn)行不同治 療 ：(1)PBS+laser、(2)Pt?Cu+laser、(3)Pt?Cu@PLL@HA+laser。在尾靜脈分別注射樣品(15 mg·kg-1)，用1 064 nm激光(1.0 W·cm-2)照射整個(gè)腫瘤區(qū)域5 min。采用紅外熱成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腫瘤區(qū)域平均溫度。用公式(ab)2/2計(jì)算腫瘤體積，其中a和b分別表示腫瘤長(zhǎng)度和寬度。12 d后，處死所有小鼠，收集腫瘤進(jìn)行蘇木精和伊紅(H&E)染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(S.D.)的形式記錄。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pt-Cu@PLL@HA的形貌與理化特性

對(duì)Pt?Cu@PLL@HA的形貌、結(jié)構(gòu)及物化性能進(jìn)行分析，如圖2所示。利用水熱合成的Pt?Cu合金納米顆粒(圖2A)呈花簇狀結(jié)構(gòu)，粒徑均一，平均粒度為56.2 nm。通過LBL自組裝過程，在Pt?Cu顆粒表面包覆 PLL 和 HA，從 TEM 圖 可以看出(圖 2B)，Pt?Cu@PLL@HA納米顆粒外部具有明顯的殼層結(jié)構(gòu)包覆，殼層厚度約為10.9 nm，表明利用LBL技術(shù)在Pt?Cu顆粒表面成功構(gòu)筑包覆殼層。Pt?Cu@PLL@HA的元素映射圖(圖2C)顯示所含Pt、Cu元素以及殼層C、N等元素在樣品顆粒中呈現(xiàn)均勻分布。通過XRD對(duì)樣品中Pt、Cu元素的存在形式進(jìn)行分析，由圖2D可以看出，在41.1°、47.7°、69.3°處出現(xiàn)的特征衍射峰介于金屬Pt(PDF No.04?0802)與金屬Cu(PDF No.04?0836)的衍射峰之間，表明 Pt?Cu 是合金相。經(jīng)PLL和HA修飾后，Pt?Cu晶體結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，說明Pt?Cu合金具備良好的穩(wěn)定性，有利于生物活體應(yīng)用。進(jìn)一步，利用XPS探究Pt?Cu@PLL@HA中Pt、Cu元素的價(jià)態(tài)。圖2E為樣品的Pt4f能級(jí)光譜，結(jié)合能為70.65和74.06 eV處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)Pt0的Pt4f7/2和Pt4f5/2軌道[25]。71.67和75.06 eV處出現(xiàn)的較弱吸收峰是表面Pt氧化導(dǎo)致。此外，由于樣品中含有Cu元素，出現(xiàn)在75.74 eV的吸收峰可歸屬于Cu3p峰。圖2F為Pt?Cu@PLL@HA的Cu2p譜圖，分析表明，在932.13和951.85 eV處的峰與Cu02p峰相吻合[26]。由此證明樣品中 Pt、Cu元素以 Pt?Cu合金形式存在。

圖2 (A)Pt?Cu與(B)Pt?Cu@PLL@HA的TEM圖;(C)Pt?Cu@PLL@HA的元素映射圖像;Pt?Cu@PLL@HA的(D)XRD圖、(E)Pt4f和(F)Cu2p的XPS譜圖Fig.2 TEM images of(A)Pt?Cu and(B)Pt?Cu@PLL@HA;(C)Corresponding elemental mappings of Pt?Cu@PLL@HA;(D)XRD patterns,high?resolution XPS spectra of(E)Pt4f and(F)Cu2p of Pt?Cu@PLL@HA

2.2 Pt-Cu@PLL@HA的構(gòu)筑分析和響應(yīng)性能

Pt?Cu@PLL@HA的合成是利用正負(fù)電荷間相互作用的LBL技術(shù)，由于Pt?Cu合金帶負(fù)電荷，通過靜電結(jié)合，將帶正電性的PLL和帶負(fù)電性的HA依次包覆在Pt?Cu納米顆粒上。在LBL包覆過程中對(duì)樣品進(jìn)行ζ電位和粒徑分析。由圖3A可知，通過PLL的包覆，樣品的ζ電位從-5.5 mV翻轉(zhuǎn)為Pt?Cu@PLL的22.6 mV，隨后再次翻轉(zhuǎn)至Pt?Cu@PLL@HA的-37.9 mV。通過逐級(jí)包覆樣品的顆粒尺寸(流體力學(xué)直徑)逐漸增大，從Pt?Cu合金的粒徑64.6 nm增大至Pt?Cu@PLL@HA 的80.22 nm(圖3B)，充分證明PLL和HA依次成功包覆在Pt?Cu合金顆粒表面。此外，Pt?Cu@PLL@HA的顆粒尺寸使得樣品具有良好的EPR效果，有利于樣品在腫瘤部位的高效富集[27]。進(jìn)一步對(duì)Pt?Cu@PLL@HA的穩(wěn)定性進(jìn)行分析(圖3C)，分別在水、PBS、生理鹽水和RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育24 h后，Pt?Cu@PLL@HA保持膠體穩(wěn)定性，粒徑與ζ電位未發(fā)生明顯變化，這表明Pt?Cu@PLL@HA具有良好的生理穩(wěn)定性和長(zhǎng)血液循環(huán)性能。當(dāng)樣品進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，樣品外部的HA被腫瘤組織中的HAase快速降解，樣品內(nèi)部的PLL暴露，發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)。Pt?Cu@PLL@HA在模擬腫瘤微環(huán)境HAase的作用下(圖3D)，樣品粒徑與電位發(fā)生明顯變化，隨著外表面HA的降解，樣品表面電位向正電荷方向變化，反應(yīng)180 min后ζ電位增大為19.31 mV，粒徑減小至65.01 nm，表明在腫瘤部位樣品表面的HA可有效降解，釋放內(nèi)部Pt?Cu@PLL納米顆粒。

圖3 Pt?Cu、Pt?Cu@PLL和Pt?Cu@PLL@HA的(A)ζ電位和(B)流體力學(xué)直徑;(C)Pt?Cu@PLL@HA在水、PBS、生理鹽水和RPMI 1640培養(yǎng)基中24 h后的流體力學(xué)直徑和ζ電位;(D)HAase作用下Pt?Cu@PLL@HA的流體力學(xué)直徑和電位變化Fig.3 (A)ζ potentials and(B)hydrodynamic diameters of Pt?Cu,Pt?Cu@PLL and Pt?Cu@PLL@HA;(C)Hydrodynamic diameters and ζ potentials of Pt?Cu@PLL@HA in water,PBS,saline and RPMI 1640 medium after 24 h;(D)Hydrodynamic diameter and ζ potential changes of Pt?Cu@PLL@HA

2.3 Pt-Cu@PLL@HA的光熱性能

圖4 A為Pt?Cu@PLL@HA的吸收光譜圖。Pt?Cu@PLL@HA在600～1 400 nm范圍存在廣譜光吸收能力，特別是在1 000 nm之后的NIR?Ⅱ依舊保持較高的光吸收強(qiáng)度，表明Pt?Cu@PLL@HA可作為光熱腫瘤治療潛在的候選材料。基于良好的吸光性能，將不同濃度的Pt?Cu@PLL@HA溶液(25、50、100、200 和 400 μg·mL-1)分別在 1 064 nm(1.0 W·cm-2)近紅外激光下照射5 min，分析材料的光熱性能。如圖4B所示，當(dāng)Pt?Cu@PLL@HA溶液在激光照射下，即使在低濃度(25 μg·mL-1)時(shí)溫度也會(huì)迅速升高，而純水在照射后溫度變化可忽略不計(jì)。并且隨著Pt?Cu@PLL@HA濃度提高，其升溫速率不斷增加，表明Pt?Cu@PLL@HA的光熱效應(yīng)具有濃度依賴性。此外，從紅外熱像圖(圖4C)也可直觀地看出Pt?Cu@PLL@HA在不同條件下的升溫差異。眾所周知，納米光熱劑的光熱穩(wěn)定性是其未來(lái)應(yīng)用的關(guān)鍵[28]。 將 Pt?Cu@PLL@HA 溶 液 (400 μg·mL-1)在1 064 nm激光開/關(guān)循環(huán)照射5次后，檢測(cè)其光熱穩(wěn)定性(圖4D)。5次循環(huán)過程中升溫效果沒有明顯的偏差，光熱性能也沒有明顯的衰退，表明Pt?Cu@PLL@HA納米材料具有優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。綜上分析，Pt?Cu@PLL@HA在NIR?Ⅱ的1 064 nm激光照射下表現(xiàn)出良好的光熱特性，表明此材料適合作為NIR?Ⅱ納米光熱劑實(shí)現(xiàn)腫瘤高效光熱治療。

圖4 (A)Pt?Cu@PLL@HA的吸收光譜圖;不同濃度Pt?Cu@PLL@HA溶液(0、25、50、100、200和400 μg·mL-1)在1 064 nm(1 W·cm?2)激光照射300 s的(B)升溫曲線圖和(C)熱成像圖;(D)Pt?Cu@PLL@HA的光熱穩(wěn)定性Fig.4 (A)Absorption spectra of Pt?Cu@PLL@HA;(B)Photothermal heating curves and(C)infrared thermal images of Pt?Cu@PLL@HA solution with different concentrations(0,25,50,100,200 and 400 μg·mL-1)under laser irradiation(1 064 nm,1 W·cm-2)as a function of time(0?300 s);(D)Photothermal stability of Pt?Cu@PLL@HA

2.4 Pt-Cu@PLL@HA的細(xì)胞毒性

采用CCK?8法檢測(cè)Pt?Cu@PLL@HA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和4T1細(xì)胞(小鼠乳腺癌細(xì)胞)的細(xì)胞活性影響。如圖5A所示，即使在高濃度Pt?Cu@PLL@HA(400 μg·mL-1)中孵育 24 h 后，細(xì)胞活力仍保持在95%以上，表明Pt?Cu@PLL@HA細(xì)胞毒性較低，具有良好的生物相容性?；谝陨霞?xì)胞毒性，利用1 064 nm激光輻照，分析Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA對(duì)4T1細(xì)胞的殺傷性能。圖5B表明，Pt?Cu@PLL@HA孵育的4T1細(xì)胞存活率明顯低于Pt?Cu處理組，并且2組細(xì)胞存活率隨溶液濃度增加變化趨勢(shì)基本一致，這一現(xiàn)象說明聚合物包覆可有效提升細(xì)胞對(duì)材料的攝取量，并且包覆層對(duì)Pt?Cu光熱性能影響較小。利用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞染色觀察Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA在1 064 nm激光照射下的細(xì)胞活性(圖5C)。Pt?Cu@PLL@HA組細(xì)胞無(wú)明顯死亡，細(xì)胞存活率高，這與圖5A的CCK?8細(xì)胞活性相吻合，進(jìn)一步證實(shí)該材料良好的細(xì)胞相容性。在1 064 nm激光照射下，Pt?Cu@PLL@HA+Laser組細(xì)胞的死亡率明顯高于Pt?Cu+Laser組，呈現(xiàn)出大量細(xì)胞死亡現(xiàn)象，表明Pt?Cu@PLL@HA是一種極具應(yīng)用前景的NIR?Ⅱ光熱劑。

圖5 (A)不同濃度Pt?Cu@PLL@HA分別孵育HUVEC和4T1細(xì)胞的存活率;(B)經(jīng)不同濃度的Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA孵育4T1細(xì)胞后在1 064 nm(1 W·cm-2)激光照射5 min下的細(xì)胞活性;(C)不同樣品與4T1共孵育后分別進(jìn)行1 064 nm(1 W·cm-2)的激光照射,通過臺(tái)盼藍(lán)染色死細(xì)胞;***P<0.001Fig.5 (A)HUVEC and 4T1 cell viabilities after incubation with Pt?Cu@PLL@HA with various concentrations;(B)Cell viability of 4T1 cells after incubation with Pt?Cu and Pt?Cu@PLL@HA under laser irradiation(1 064 nm,1 W·cm-2,5 min);(C)Micrographs of 4T1 cells incubated with the samples before or after irradiation with 1 064 nm laser(1 W·cm-2),where dead cells are stained with trypan blue;***P<0.001

2.5 Pt-Cu@PLL@HA的光聲成像

通過體外分析Pt?Cu@PLL@HA的PA信號(hào)評(píng)價(jià)其光聲特性。如圖6A所示，觀察到在1 064 nm處PA強(qiáng)度與Pt?Cu@PLL@HA濃度呈線性關(guān)系，隨著溶液濃度的提升，PA信號(hào)呈上升趨勢(shì)，表明對(duì)體內(nèi)Pt?Cu@PLL@HA濃度定量分析的可行性?；谝陨辖Y(jié)果，對(duì)4T1荷瘤小鼠進(jìn)行Pt?Cu@PLL@HA尾靜脈注射(15 mg·kg-1)，在注射前后不同時(shí)間點(diǎn)(0、1、4、8、12和24 h)監(jiān)測(cè)Pt?Cu@PLL@HA活體PA成像性能。圖6C中腫瘤區(qū)域PA信號(hào)隨著時(shí)間的推移逐漸增強(qiáng)，在整個(gè)腫瘤內(nèi)的對(duì)比度明顯高于周圍組織，并在給藥后12 h達(dá)到最佳聚集效果，給藥24 h腫瘤部位的光聲強(qiáng)度逐步減弱。此外，通過對(duì)PA信號(hào)的半定量分析(圖6B)，給藥后12 h腫瘤部位的PA強(qiáng)度約為給藥前的13.4倍，進(jìn)一步證明Pt?Cu@PLL@HA可作為一種優(yōu)異的PA成像劑，其能夠有效識(shí)別腫瘤區(qū)域，指導(dǎo)診斷和治療。

圖6 (A)不同濃度Pt?Cu@PLL@HA的PA強(qiáng)度;4T1荷瘤鼠靜脈注射Pt?Cu@PLL@HA后在1 064 nm激光照射下不同時(shí)間點(diǎn)的(B)PA強(qiáng)度變化和(C)活體PA成像Fig.6 (A)PA intensities of Pt?Cu@PLL@HA with different concentrations;(B)PA intensity changes and(C)PA imaging of 4T1 tumor?bearing mice after Pt?Cu@PLL@HA injection under 1 064 nm laser irradiation

2.6 Pt-Cu@PLL@HA活體光熱治療

為進(jìn)一步闡明Pt?Cu@PLL@HA的活體PTT療效，分別對(duì) 4T1 荷瘤鼠進(jìn)行 PBS、Pt?Cu 和 Pt?Cu@PLL@HA三種尾靜脈給藥，根據(jù)PA成像的最佳滯留時(shí)間，給藥12 h后對(duì)腫瘤部位進(jìn)行1 064 nm(1 W·cm-2)激光照射5 min，用熱成像技術(shù)評(píng)價(jià)體內(nèi)抑瘤效果。如圖7A和7B所示，PBS對(duì)照組的腫瘤部位僅觀察到微小的溫度變化；而Pt?Cu組和Pt?Cu@PLL@HA組在相同的激光照射下，最終溫度分別升高至47.68和51.89℃，Pt?Cu@PLL@HA在所有光熱輻照時(shí)間點(diǎn)上都表現(xiàn)出最高的溫度值，這表明樣品由于包覆層在腫瘤微環(huán)境的HA特異性降解與PLL的細(xì)胞高效攝取，有效提升了腫瘤區(qū)域的富集量，增強(qiáng)了光熱治療性能。持續(xù)監(jiān)測(cè)PTT治療Pt?Cu和 Pt?Cu@PLL@HA 組小鼠(圖 7C)，Pt?Cu@PLL@HA組表現(xiàn)出良好的熱消融作用，光熱治療小鼠12 d后腫瘤成功消除；而Pt?Cu組小鼠出現(xiàn)明顯的腫瘤復(fù)發(fā)現(xiàn)象，光照治療區(qū)域出現(xiàn)火山形瘤體。經(jīng)Pt?Cu@PLL@HA 光熱治療后(圖 7D)，荷瘤鼠腫瘤體積顯著減小，表現(xiàn)出優(yōu)異的腫瘤抑制效果。此外，3組治療小鼠體重12 d內(nèi)均無(wú)明顯下降趨勢(shì)(圖7E)，進(jìn)一步證明Pt?Cu@PLL@HA良好的生物相容性和生物安全性。圖7F為3組治療小鼠腫瘤組織H&E分析，Pt?Cu@PLL@HA光熱治療后，腫瘤組織遭到破壞，呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，表明Pt?Cu@PLL@HA在NIR?Ⅱ光照條件下具備高效的PTT治療效果，有效消融癌細(xì)胞。此外，Pt?Cu@PLL@HA光熱治療后，小鼠的主要器官(包括心、肝、脾、肺和腎)未見明顯壞死或生理形態(tài)變化(圖7G)。綜上所述，Pt?Cu@PLL@HA具有較高的腫瘤富集與攝取能力，可實(shí)現(xiàn)高效的NIR?Ⅱ光熱治療性能。

圖7 4T1荷瘤鼠靜脈注射PBS、Pt?Cu或Pt?Cu@PLL@HA后對(duì)腫瘤區(qū)域激光輻照(1 064 nm,1 W·cm-2)的(A)紅外熱成像和(B)腫瘤溫度變化曲線;(C)光熱治療后不同治療組的小鼠照片;各治療組小鼠(D)腫瘤體積和(E)體重隨時(shí)間的變化圖;(F)治療結(jié)束后收集小鼠腫瘤組織的H&E染色;(G)Pt?Cu@PLL@HA治療組小鼠主要器官的H&E染色圖像;標(biāo)尺:100 μm;***P<0.001Fig.7 (A)IRT images and(B)corresponding temperature curves of 4T1 tumor?bearing mice injected with PBS,Pt?Cu or Pt?Cu@PLL@HA under laser irradiation(1 064 nm,1 W·cm-2);(C)Representative photographs of mice of different groups after PTT;(D)Tumor volume and(E)body weight of mice from different groups after PTT;(F)H&E staining of the tumor tissues collected from mice at the end of treatment;(G)H&E?stained images of major organs collected from mices in Pt?Cu@PLL@HA group;Scale bar:100 μm;***P<0.001

3 結(jié)論

基于Pt?Cu納米合金良好的NIR?Ⅱ吸收性能，通過LBL技術(shù)構(gòu)筑可在腫瘤部位高效富集的Pt?Cu@PLL@HA納米平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)NIR?Ⅱ PA成像引導(dǎo)下的精準(zhǔn)NIR?ⅡPTT腫瘤治療。通過表征手段對(duì)Pt?Cu@PLL@HA納米平臺(tái)的顆粒形貌、元素存在形式、體外響應(yīng)效果以及NIR?Ⅱ光熱性能進(jìn)行系統(tǒng)性分析，表明Pt?Cu@PLL@HA具有理想的光熱效應(yīng)與生物相容性?；贖A層在腫瘤區(qū)域的降解特性，促使PLL層(+)暴露，發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，增加腫瘤細(xì)胞攝取量。進(jìn)一步通過一系列細(xì)胞、活體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相比Pt?Cu納米顆粒，Pt?Cu@PLL@HA能夠有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)高效腫瘤熱消融效果。