陳志強(qiáng)，邵 帥，王 建，李 利

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江 哈爾濱 150001)

血腦屏障(Blood Brain Barrier，B.B.B.)是由血管內(nèi)皮和星形細(xì)胞的足突構(gòu)成，通過調(diào)節(jié)活性物質(zhì)來維持腦部功能，當(dāng)腦血流中斷超過1h，其通透性增加，進(jìn)而引發(fā)梗死區(qū)域的水腫，而再灌注過程中可引起血腦屏障持續(xù)的開放，大量液體進(jìn)入組織間隙，加重腦水腫[1-2]。在腦梗塞過程中，會(huì)引起血管病變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和無法逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞凋亡[3-4]。最新研究表明，在大鼠模型中，壞死中心區(qū)域miR21表達(dá)比周邊明顯低，表明其在腦血管疾病中發(fā)揮著重要作用[5]。另外證實(shí)miR-21可保護(hù)神經(jīng)元免受缺血導(dǎo)致的損傷，通過PTEN-MMP-2抑制基質(zhì)降解和炎癥反應(yīng)[6]。因此，本文擬探究miR-21對(duì)缺血/再灌注后血腦屏障的保護(hù)作用和機(jī)制，為miR-21應(yīng)用于血腦屏障的治療奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性SD大鼠，60只，體重220～250 g，2.5月齡，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2008-0016。飼養(yǎng)環(huán)境為濕度45%～65%，溫度22～25 ℃，光照周期12 h開/12 h。

1.2 主要試劑與材料超純水系統(tǒng)(德國Millipore公司)；低溫離心機(jī)(美國Thermal公司)；蛋白電泳儀(美國Bio-RAD公司)；anti-Bax(Abcam公司)；LC3抗體(Cell signaling)；GAPDH抗體(康成公司)；Alexa Fluor 800 二抗(Jackson公司)。

1.3 大鼠腦缺血再灌注模型的構(gòu)建大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后開始實(shí)驗(yàn)。參照Zea-Longa法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型[7]，大鼠經(jīng)過麻醉(10%水合氯醛，0.35 mL/100 g，腹腔注射)后，頸部常規(guī)消毒，取頸部正中切口剪開皮膚，分離皮膚下軟組織并暴露頸動(dòng)脈鞘。仔細(xì)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，后于枕動(dòng)脈以上結(jié)扎ECA，ECA靠近分叉處放置一備用線，動(dòng)脈夾分別夾閉ICA、CCA。電凝刀離斷枕動(dòng)脈及ECA遠(yuǎn)心端，用顯微剪在ECA上剪一缺口，將備好的栓線經(jīng)ECA插入ICA至栓線頭部達(dá)到MCA起始處，備用線打結(jié)固定栓線。栓線固定1 h后，將栓線拔出頸內(nèi)動(dòng)脈，對(duì)其進(jìn)行再灌注。4 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，評(píng)分在1～3分為建模成功，排除死亡和不符合標(biāo)準(zhǔn)的模型。

1.4 神經(jīng)功能缺損評(píng)分再灌注4 h后進(jìn)行評(píng)分，溫和對(duì)待大鼠，避免其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。采用Zea-longa5分制法，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無明顯的神經(jīng)損傷癥狀；1分：前爪不能完全伸展；2分：行走時(shí)向?qū)?cè)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，無自主意識(shí)。

1.5 TTC染色大鼠缺血再灌注模型24 h后，大鼠經(jīng)過麻醉(10%水合氯醛，380 mg/kg，腹腔注射)。待麻醉后，取俯臥位，妥善固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。用剪刀分離大鼠頭部，將大鼠頭部單獨(dú)固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用剪刀剪開頭部皮膚，用彎鉗去除骨瓣，充分暴露并完整取出大鼠腦組織，后將小腦、部分腦干及嗅球部去除。分離過程中應(yīng)避免損傷大腦皮層組織。將腦組織放入-20 ℃冰箱冷凍20 min。取出后使用薄刀片將大鼠腦組織均勻切為6片，厚度約為2 mm。將切開后腦片置于盛有2% TTC溶液中，在37 ℃恒溫環(huán)境下避光保存15 min，期間將腦片組織翻面2～3次，使腦片組織染色均勻。將染色后的腦片組織擺放于一次性醫(yī)用藍(lán)色中單上，拍照備用。

1.6 大鼠立體定位顱內(nèi)注射將建模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表發(fā)分三組：即miR-con組、miR-21-mimic組和miR-21 inhibitor組，每組6只。過量麻醉(5 mL的3.6%水合氯醛)后固定，頭部備皮、用碘伏徹底消毒、剪開皮膚，剝離骨膜，根據(jù)《大鼠立體定位圖譜》在右側(cè)大腦中線右1 mm、矢狀線后0.5 mm處，顱鉆開顱，利用微量注射器從顱骨進(jìn)入4 mm，分別取5 μL空質(zhì)粒，miR-2l-mimic和miR-21inhibitor，5 min注射完畢，靜置5 min，取出注射器，碘伏消毒，縫合皮膚，待清醒后，放回鼠籠飼養(yǎng)，24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7 腦梗死體積測定上述1.6大鼠飼養(yǎng)24 h，采用9.4T磁共振(布魯克)獲取MRI數(shù)據(jù)。使用優(yōu)化的參數(shù)獲取三維梯度回波，二維多層自旋回波和T2序列，以實(shí)現(xiàn)解剖學(xué)細(xì)節(jié)以及高T1和T2/T2*對(duì)比度。使用MRI斷面的T1圖，并將T2*圖像與同一坐標(biāo)系配準(zhǔn)用于感興趣區(qū)域分析，分別于不同層面圈腦梗死的區(qū)域，由軟件計(jì)算出腦梗死的體積。

1.8 Western Blot檢測上述1.6大鼠飼養(yǎng)24 h，腹腔注射10%水合氯醛320 mg/kg對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后快速斷頭，在提前預(yù)冷的培養(yǎng)皿中取大腦皮層組織蛋白上樣質(zhì)量50 μg，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶(博士德)封閉處理，孵育一抗anti-Bax抗體(Abcam 公司)，以GAPDH為內(nèi)參。

1.9 免疫熒光檢測標(biāo)本準(zhǔn)備：4%多聚甲醛心臟灌注后，取大鼠大腦皮層，以4%多聚甲醛固定過夜，依次用15%、30%蔗糖脫水24 h。OCT包埋后液氮冷凍1 min后，-80 ℃冰箱保存。染色步驟：8 μm冰凍切片，室溫干燥30 min，0.01M PBS洗滌5 min，1X(蒸餾水稀釋)碧云天抗原修復(fù)液，室溫孵育10 min，洗滌3 次/5 min，0.1% tritonX-100室溫通透15 min，0.01 MPBS染缸中洗滌3次/5 min，放入濕盒，10%山羊血清(PBS稀釋)37 ℃封閉1 h，孵一抗，濃度1:200，用PBS稀釋，4 ℃過夜。室溫放置30 min，0.01 M PBS染缸中洗滌3次/10 min，孵二抗，操作步驟同上。避光染核，0.1% DAPI室溫染核1 min后洗滌5次/3 min，封片，抗熒光淬滅劑封片，加蓋玻片，熒光顯微鏡觀察。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)的比較。如果ANOVA分析有差異，再通過Bonferroni修正的t檢驗(yàn)或Dunnett檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較。Western免疫條帶的灰度通過Odyssey 3.0軟件分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 大鼠腦缺血再灌注模型構(gòu)建的分析大鼠于再灌注4 h進(jìn)行行為學(xué)觀察，其中Longa評(píng)分為2的模型表現(xiàn)為行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，見圖1。

圖1 大鼠腦缺血再灌注行為學(xué)觀察

2.2 大鼠腦缺血再灌注模型構(gòu)建的TTC染色分析經(jīng)TCC染色，正常腦組織部位染色顯紅色，腦梗死部位顯白色。隨機(jī)選取6只大鼠，通過TTC染色對(duì)腦梗死部位進(jìn)行觀察分析，可見白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ啦课?，表明已完成大鼠腦缺血再灌注模型的構(gòu)建，見圖2。

圖2 TTC染色大鼠腦缺血再灌注腦組織切片

2.3 miR-21 對(duì)腦缺血/再灌注后大鼠大腦皮層組織中Bax蛋白表達(dá)的影響Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白質(zhì)粒組比較，miR-21-inhibitor組大腦皮層組織中Bax蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，miR-21-mimic組大腦皮層組織中Bax蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，說明miR-21能夠有效抑制Bax的表達(dá)，見圖3。

圖3 miR-21對(duì)大腦皮層組織中 Bax 蛋白的表達(dá)的影響

2.4 miR-21對(duì)腦缺血/再灌注后大鼠大腦皮層細(xì)胞自噬的影響與空白質(zhì)粒組相比較，miR-21 inhibitor組中LC3的分布明顯升高，而miR-21-mimic組中LC3的分布情況明顯降低，提示miR-21能夠抑制自噬蛋白LC3的表達(dá)，起到保護(hù)缺血/再灌注后血腦屏障的作用。進(jìn)一步說明了miR-21可能通過抑制細(xì)胞自噬來保護(hù)I/R后的血腦屏障，見圖4。

圖4 LC-3 在腦缺血/再灌注模型中的分布情況

2.5 miR-21對(duì)大腦皮層組織中 Bax 蛋白的表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，miR-21組腦皮質(zhì)中miR-21表達(dá)水平降低[(0.51±0.17)vs(1.06±0.27)]，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，t=3.013，P=0.039，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MR檢查結(jié)果進(jìn)行比較，經(jīng)方差分析，miR-21組和對(duì)照組的腦梗死體積有差別(F=15.71，P=0.000)，見圖5。

圖5 miR-21對(duì)大腦皮層組織中 Bax 蛋白表達(dá)的影響

2.6 miR-21對(duì)腦缺血/再灌注后腦梗死體積的影響核磁共振檢查是利用核磁共振原理，依據(jù)所釋放的能量在物質(zhì)內(nèi)部不用結(jié)構(gòu)環(huán)境中不同的衰減，通過外加梯度磁場檢測所發(fā)射出的電磁波，構(gòu)成物體原子核的位置和種類，據(jù)此繪制物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)圖像，MR結(jié)果進(jìn)行比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，miR-21-mimic組和Control組的腦梗死體積有差別(F=15.71，P=0.000)，miR-21-inhibitor組腦梗死體積小于NC組，見圖6。

圖6 腦缺血/再灌注大鼠腦梗死體積測定

3 討論

血腦屏障對(duì)維持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定、維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理狀態(tài)具有重要的生物學(xué)意義[8]。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建大鼠腦缺血/再灌注模型，研究顯示miR-21能夠顯著抑制大腦皮層組織中Bax蛋白的表達(dá)，說明了miR-21可以通過抑制細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)腦缺血/再灌注損傷過程血腦屏障的作用。

抑制自噬能夠明顯減輕神經(jīng)元細(xì)胞死亡，具有保護(hù)神經(jīng)的作用[9]。因此，抑制自噬也可能減輕血腦屏障的破壞，并減輕腦水腫[10-11]。LC3蛋白在自噬的調(diào)節(jié)過程中起重要作用，是細(xì)胞自噬的標(biāo)志性蛋白。研究表明：缺血再灌注后，活性氧含量上升，會(huì)引起細(xì)胞自噬的增加，從而引發(fā)一系列的病理生理改變。因此，采取手段干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血/再灌注后的自噬和凋亡，可能阻止血腦屏障的破壞和持續(xù)開放，防止腦水腫的進(jìn)一步發(fā)展[12-13]。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光檢測結(jié)果顯示在大鼠腦缺血/再灌注模型中，miR-21組中LC3蛋白的分布較空白質(zhì)粒組明顯減少，表明miR-21能夠顯著抑制細(xì)胞自噬，保護(hù)腦缺血/再灌注后血腦屏障。腦水腫的重要原因之一是血腦屏障破壞引起的血管通透性的增加[14]。在細(xì)胞因子的介導(dǎo)下，血腦屏障的完整性和通透性會(huì)持續(xù)被破壞，加重腦水腫[15]。我們研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-21表達(dá)后會(huì)減小腦梗死的體積。

我們建立腦缺血/再灌注模型，檢測Bax 蛋白的表達(dá)、LC3蛋白的分布等，旨在探討miR-2l對(duì)缺血/再灌注后血腦屏障保護(hù)作用與機(jī)制。結(jié)果顯示，miR-2l可能通過下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)抑制凋亡或通過抑制自噬保護(hù)血腦屏障。另外miR-2l的表達(dá)水平在保護(hù)血腦屏障的作用中具有較好的敏感性和特異性，減少腦梗死體積。本研究為miR-2l在診斷和治療腦缺血/再灌注后血腦屏障中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。