徐先洲，祝 苑，胡 瑞，李建芬，何 贠，申文娟

（武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430024 ）

近年來，隨著生活水平的提高，國(guó)人對(duì)雞肉及其附屬品的需求量大幅增加。我國(guó)是肉雞消費(fèi)大國(guó)，據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，2019 年，我國(guó)禽蛋產(chǎn)量為308.98 萬t，較2018 年增加5.78%[1]。一只成年雞每天產(chǎn)糞量是80 g，以一個(gè)10 萬只養(yǎng)殖規(guī)模的現(xiàn)代化養(yǎng)雞場(chǎng)為例，每天的產(chǎn)糞量在8 t 左右[2]。雞的直腸較短，消化能力有限，排出的糞便中含有較多未被及時(shí)消化吸收的有機(jī)物質(zhì)以及一定量的抗菌藥和抗生素殘留[3]，若處理不妥當(dāng)，將會(huì)造成較大的資源浪費(fèi)和環(huán)境問題。

自1958 年氨基酸分析實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化至今[4]，紫外-可見分光光度法[5]、氣相色譜法[6-7]、高效液相色譜法[8]、液相色譜法和質(zhì)譜聯(lián)用法[9-11]以及毛細(xì)管電泳法[12]檢測(cè)氨基酸相繼被報(bào)道。其中，紫外-可見分光光度法可檢測(cè)總量氨基酸，但準(zhǔn)確度相對(duì)不高；其他方法可得到氨基酸各組分定性定量分析，但成本較高。茚三酮-可見光光度法可快速低成本檢測(cè)總量氨基酸，并且檢測(cè)上限高[13]。

茚三酮法檢測(cè)氨基酸難點(diǎn)在于還原性茚三酮的生成[14,15-19]，為解決這一問題，常用通過加氯化亞錫和抗壞血酸等還原性物質(zhì)，結(jié)合避免檢測(cè)時(shí)雜質(zhì)粒子的干擾[15]，本研究通過添加抗壞血酸的方法成功解決了這一問題。本文通過蛋白酶水解法提高總游離氨基酸的產(chǎn)率，利用雙水相萃取法提取氨基酸，運(yùn)用改進(jìn)的茚三酮法對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，為雞糞的資源化提一條較合理的路線。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)器材與設(shè)備

1.1.1 原料及試劑 雞糞發(fā)酵液來源于湖北迪匯科技有限公司，該公司將收集的新鮮雞糞進(jìn)行初步殺菌處理，過濾去除D ≥2 mm 殘?jiān)?，剩余液?jīng)過蛋白酶發(fā)酵水解即得到雞糞發(fā)酵液，以提高游離氨基酸產(chǎn)量。

賴氨酸（α-Lys）、蘇氨酸（α-Thr）、硫酸銨、聚乙二醇-4000、抗壞血酸、氯化亞錫、茚三酮、三水乙酸鈉、冰乙酸、氨水、濃硫酸、硫酸銅均為分析純（國(guó)藥）；溴化鉀光譜純（國(guó)藥）；堿性蛋白質(zhì)水解酶為工業(yè)用品，實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

雞糞發(fā)酵液中揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOC）采用吹掃補(bǔ)集法測(cè)得，脂類由乙醚提取法測(cè)定，纖維素由酶發(fā)酵法測(cè)得，粗蛋白由凱氏定氮法測(cè)得[20]，發(fā)酵液中的沙石量由過濾獲得的殘?jiān)?00℃下煅燒4 h 稱重得到，無機(jī)鹽由發(fā)酵液于600℃下煅燒4 h 除去沙石的質(zhì)量稱取。經(jīng)分析，雞糞發(fā)酵液由89%的水分，9%的有機(jī)物（干重）和2%的無機(jī)物（干重）組成，有機(jī)物中揮發(fā)性有機(jī)物、脂類、粗蛋白質(zhì)、纖維素、其他有機(jī)物的質(zhì)量百分比分別為4.4%、4.2%、57.8%、31.2%、2.4%，無機(jī)物中沙石、無機(jī)鹽的質(zhì)量百分比分別為67%、33%。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器見表1。

表1 主要儀器

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞糞發(fā)酵液前處理 取200 mL 雞糞發(fā)酵液真空抽濾4 h 除臭，取過濾液50 mL 加入0.50 g 蛋白酶（堿性），在44℃的磁攪拌油浴鍋以200 r/min 轉(zhuǎn)速水解，水解后的樣品3 200 r/min 離心12 min，取上清液快速過0.45 μm 濾膜待用。

1.2.2 雙水相萃取 配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%的硫酸銨和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的聚乙二醇（PEG）-4000 作為雙水相萃取劑，萃取過濾液，溶液分為有機(jī)相和無機(jī)相，氨基酸大量分布于有機(jī)相PEG-4000 中。此雙水相萃取游離氨基酸，可更好地保留其活性[21-23]。

1.2.3 氨基酸提取 萃取得到的有機(jī)相過強(qiáng)酸處理的離子交換柱后，用蒸餾水洗至出水無色，經(jīng)收集后，用1 mol/L 的氨水洗脫至出液無色的洗脫液，于72℃水浴鍋中蒸發(fā)至5 mL 待測(cè)。

1.2.4 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液 準(zhǔn)確稱取0.500 0 gα-Lys 和0.500 0 gα-Thr 定容至1 L，得到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液，取40 mL 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至100 mL 得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.5 氨基酸檢測(cè)液 顯色劑：配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% 的茚三酮溶液A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的抗壞血酸溶液B，5份A 與1 份B 充分混勻后即得顯色劑。

緩沖液：配置1 mol/L 的乙酸鈉和乙酸溶液，取60 mL 乙酸鈉溶液和40 mL 乙酸溶液配成pH=4.8 的緩沖溶液。

氨基酸檢測(cè)原理及測(cè)試：游離氨基酸上的氨基會(huì)與具有還原性的茚三酮溶液在沸水浴下反應(yīng)生成紫色化合物，該化合物在570 nm 處有最大吸光度。記錄石英比色皿中樣品的吸光度，每組樣品做3 個(gè)平行樣。

1.2.6 不同溫度下游離總氨基酸產(chǎn)率的測(cè)定方法 在50 mL原樣中加入5 g 堿性蛋白酶，分別在38、40、42、44、46、48、50、52℃水解2 h，測(cè)其總游離氨基酸濃度。

1.2.7 水解時(shí)間對(duì)氨基酸產(chǎn)率 雞糞發(fā)酵液分別在42、44、46℃下水解48 h，前24 h 每隔1 h 取1 次樣，24～48 h間歇取樣，測(cè)定游離氨基酸濃度。雞糞發(fā)酵液為實(shí)驗(yàn)用到的原液，經(jīng)過蛋白酶水解后，原液中以多肽和蛋白質(zhì)存在的非游離氨基酸水解成游離氨基酸，增加產(chǎn)率。

1.2.8 總游離氨基酸檢含量隨月份的變化規(guī)律 在實(shí)驗(yàn)室條件下，對(duì)原樣中的總游離氨基酸按月份進(jìn)行測(cè)試，分別檢測(cè)7、8、9 月和10 月雞糞水解液中總游離氨基酸含量，查詢不同月份的白天最高平均氣溫繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶水解溫度對(duì)氨基酸產(chǎn)率的影響 蛋白酶在不同水解溫度下水解蛋白質(zhì)2 h 后，對(duì)總游離氨基酸產(chǎn)率的影響如表2 所示。氨基酸產(chǎn)率在38～44℃時(shí)隨著蛋白酶水解溫度的升高而逐步提高，46～52℃時(shí)氨基酸產(chǎn)率逐步降低。在溫度為44℃時(shí)，蛋白水解酶水解蛋白質(zhì)2 h蛋白質(zhì)產(chǎn)率達(dá)65.08 mg/mL。

表2 蛋白酶在不同水解溫度下對(duì)總游離氨基酸產(chǎn)率的影響 mg/mL

2.2 蛋白水解時(shí)間對(duì)氨基酸產(chǎn)率的影響 水解時(shí)間對(duì)氨基酸產(chǎn)率的影響如圖1 所示，前10 h，溫度對(duì)氨基酸的水解效率影響并不大，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度的影響逐漸顯現(xiàn)出來，不同溫度下水解效率為：η（44℃）>η（46℃）>η（42℃）。同時(shí)，不同溫度下，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解效率逐漸提高，氨基酸產(chǎn)率也隨之逐漸升高；隨后增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩；水解反應(yīng)進(jìn)行到48 h 后，氨基酸含量在44℃、46℃、42℃時(shí)分別達(dá)到133.04、129.62、123.64 mg/mL，遠(yuǎn)高于從棉粕廢水[24]中提取游離氨基酸的結(jié)果（產(chǎn)率54 mg/mL）。這是因?yàn)殡u糞水解液中蛋白質(zhì)和多肽的水解與氨基酸的脫水縮合同時(shí)進(jìn)行；剛開始時(shí)，雞糞水解液中的蛋白質(zhì)和多肽濃度較高，遠(yuǎn)高于水解液中氨基酸的量，在蛋白酶水解作用下，氨基酸生成量較高；根據(jù)水解原理和質(zhì)量作用定律，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，雞糞水解液中的蛋白質(zhì)和多肽逐漸降低，氨基酸含量逐漸升高，由于蛋白酶的加入同時(shí)加速了蛋白質(zhì)水解與氨基酸脫水縮合正逆反應(yīng)的進(jìn)行，因此隨著反應(yīng)的進(jìn)行，雞糞水解液中氨基酸含量增多，抑制了蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的正向進(jìn)行，氨基酸脫水縮合逆反應(yīng)增強(qiáng)，氨基酸的產(chǎn)生速率變緩。由于水解反應(yīng)和脫水縮合是可逆反應(yīng)，故雞糞發(fā)酵液中多肽和蛋白在蛋白酶加熱條件下，蛋白質(zhì)和多肽的水解反應(yīng)與氨基酸脫水縮合同時(shí)進(jìn)行，并隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而趨于平衡，因而氨基酸產(chǎn)率在水解開始時(shí)升高較快，水解反應(yīng)進(jìn)行到48 h 后，氨基酸含量的增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩。

圖1 水解時(shí)間對(duì)氨基酸產(chǎn)率的影響

2.3 總游離氨基酸含量隨月份的變化規(guī)律 總游離氨基酸含量隨月份的變化規(guī)律圖如圖2 所示，7 月雞糞發(fā)酵液中游離的氨基酸含量為15 mg/mL，經(jīng)過預(yù)處理后，原樣中的總游離氨基酸含量變高，排除雜質(zhì)粒子的干擾，推測(cè)蛋白質(zhì)和多肽存在自發(fā)的水解，水解效率不高，平均1 個(gè)月氨基酸含量增加1 mg/mL。

圖2 總游離氨基酸含量隨月份的變化規(guī)律

2.4 氨基酸產(chǎn)品的FTIR 分析 圖3 為44℃下經(jīng)堿性蛋白酶水解2 h 得到的游離氨基酸的FTIR 圖，3 448 cm-1處中強(qiáng)而寬的吸收帶是N-H 伸縮振動(dòng)峰，3 400～2 500 cm-1強(qiáng)且寬的吸收帶是羧酸γ（OH）的伸縮振動(dòng)峰，1 637 cm-1處較弱而尖銳的是NH 的雙鍵伸縮振動(dòng)峰與水的H-O-H彎曲振動(dòng)峰，并使得羧酸γ（C=O）的雙鍵振動(dòng)峰右移至此處，1 257 cm-1處是γ（C=O）的單鍵振動(dòng)峰，1 104 cm-1處尖銳的峰是γ（CN）（脂肪）的單鍵振動(dòng)峰，613 cm-1是NH2的單鍵伸縮振動(dòng)峰，2 923 cm-1處是-CH2-伸縮震動(dòng)峰，1 458 cm-1處是CH 單鍵振動(dòng)峰，與氨基酸的特征吸收峰一致，該物質(zhì)為游離氨基酸的混合物，其分子式為R-CH（COOH）-NH2?nH2O。

圖3 氨基酸的紅外分析

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以雞糞發(fā)酵液為原料，經(jīng)過蛋白酶水解，雙水相萃取法提取氨基酸，并運(yùn)用改進(jìn)的茚三酮法對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明蛋白酶與發(fā)酵液配比為1 g酶/10 mL 發(fā)酵液時(shí)，該雞糞發(fā)酵液最佳水解溫度為44℃，不同溫度下水解效率為η（44℃）>η（46℃）>η（42℃）。隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，水解效率逐漸提高，氨基酸產(chǎn)率也隨之升高，隨后增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩；水解反應(yīng)進(jìn)行到48 h 后，氨基酸含量在44℃時(shí)達(dá)到133.04 mg/mL。因此，本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的雞糞發(fā)酵液中提取游離氨基酸的方法不僅能提高游離氨基酸含量，還可更好地保留其活性。