黃千千，趙琦琪，張美琳，盧詩雨，于 睿，杜梓桓 ,劉 振，羅生浩，王紅衛(wèi)，石國華，劉先策，劉 海，周 磊*，劉劍鋒

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.北京黑六牧業(yè)科技有限公司，北京 102211）

氟烷基因（Halothane，Hal）又被稱作骨骼肌蘭尼定受體基因（Ryanodine Receptor Gene 1，RYR1），位于豬的6 號常染色體上，對豬的應(yīng)激綜合征（Porcine Stress Syndrome，PSS）起主要效應(yīng)[1]。PSS 產(chǎn)生的原理是豬RYR1基因的cDNA 發(fā)生C1843 →T1843 突變，成為氟烷敏感基因（Haln）。當(dāng)豬只基因型為隱性純合（HalnHaln）時，蘭尼定受體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，應(yīng)激情況下使肌肉組織異常釋放大量Ca2+，從而導(dǎo)致電解質(zhì)代謝紊亂，肌肉嚴重收縮、pH 值變化異常等[2]，產(chǎn)生PSS，同時形成PSE（Pale,Soft and Exudative）或DFD（Dark,Firm and Dry）劣質(zhì)肉，嚴重時可以導(dǎo)致豬只的死亡。

Haln基因頻率在不同豬種群體有所差異，我國地方品種的Haln基因頻率普遍低于國外豬種。有研究[3]顯示，杜洛克豬、長白豬和英系大約克豬中Haln基因頻率分別為0.10、0.15 和0.20，而我國多數(shù)地方豬種Haln基因頻率經(jīng)報道為0，少數(shù)如民豬[4]、豫西黑豬[2]等Haln基因頻率為0.166 7、0.340 9。有研究[5-6]表明，HalNHalN基因型和HalNHaln基因型豬的肉品質(zhì)和繁殖性能相比于HalnHaln基因型豬更加優(yōu)良。HalnHaln基因型豬即使在最優(yōu)條件下仍有80%或以上的比率產(chǎn)生PSE 肉，HalNHaln基因型豬產(chǎn)生劣質(zhì)肉的比率為36.8%，而HalNHalN基因型豬產(chǎn)生PSE 肉的比率僅為22.5%，因此氟烷敏感基因會導(dǎo)致生產(chǎn)效益的降低[7]。本研究采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)檢測了氟烷敏感基因在北京黑豬純種種豬中的分布，為進一步提升北京黑豬的肉質(zhì)及其生產(chǎn)效益、合理利用北京黑豬遺傳資源以及指導(dǎo)豬場更新淘汰計劃提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 由北京黑六牧業(yè)科技有限公司提供660頭北京黑豬純種種豬的耳組織樣，其中包括141 頭公豬，519 頭母豬。在不影響豬耳號的地方用耳號鉗剪取約0.5 g的耳組織，置于裝有1 mL 75%乙醇的1.5 mL 離心管中，帶回實驗室，-20℃保存。

1.2 主要儀器及試劑 小型高速離心機（Eppendorf，德國）、梯度PCR 儀（Biometra Tgradient，德國）、電泳儀（JY300C，北京君意）、高通量組織研磨器（Scientz-48，寧波新芝）。

TIANamp Genomic DNA Kit 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型，北京天根生化科技有限公司）、75%酒精消毒液（利爾康）、2×TransTaq?HiFi PCR SuperMix（Mix II，北京全式金生物技術(shù)有限公司），Takara QuickCut 限制酶HhaI、Takara 10×QuickCut Green Buffer、TaKaRa DL2000 DNA Marker（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA 提取使用TIANamp Genomic DNA Kit 血液/ 細胞/ 組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取DNA，取耳組織30 mg 左右于2 mL 離心管剪碎、研磨，加入300 μL 緩沖液和20 μL 蛋白酶K，在56℃分子雜交爐中消化過夜，然后按照試劑盒說明書中提取組織基因組DNA 的方法提取660 頭北京黑豬的DNA。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 本實驗所用引物為Fujii 等[1]設(shè)計，上游引物：5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTACC A-3'；下游引物：5'-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCTGA G-3'，引物由北京生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 PCR 擴增擴增含Hal基因cDNA 第1 843 突 變位點的長度為660 bp 的目的片段產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系共25 μL：12.5 μL 2×TransTaq?HiFi PCR SuperMix（Mix II），上、下游引物各0.75 μL（10 μmol/L），1 μL DNA 模板，10 μL 滅菌水。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，然后循環(huán)94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸45 s共31 次，接著72℃延伸5 min，最后置于4℃下保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

1.3.4 酶切反應(yīng) 酶切反應(yīng)體系共20 μL ：2 μL 10×Quick Cut Green Buffer，5 μL PCR 產(chǎn)物，1 μL 限制性內(nèi)切酶HhaI，12 μL 滅菌水?；靹蛞陨显噭┖笏矔r離心，37℃酶切15 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。

1.4 統(tǒng)計分析 PCR-RFLP 標記是共顯性遺傳的，基因型和表型一致。根據(jù)酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果能直接推斷出基因型，通過簡單計算可得到基因頻率及基因型頻率。哈迪-溫伯格（Hardy Weinberg）平衡檢驗采用卡方檢驗的適合性檢驗，不同性別豬群中基因型頻率分布的差異顯著性檢驗采用獨立性檢驗。

2 結(jié)果

2.1Hal基因PCR 擴增結(jié)果 由圖1 可知，Hal基因PCR 擴增產(chǎn)物的條帶大小為660 bp，擴增所得條帶與目的條帶一致，且不存在非特異性條帶。

圖1 Hal 基因的PCR 擴增電泳結(jié)果

2.2Hal基因PCR-RFLP 酶切結(jié)果 PCR 所得產(chǎn)物是長度為660 bp 的片段，其中包含Hal基因cDNA 第1 843位點，即C1843 →T1843 突變位點。已知5'-GCG ↓C-3'為HhaI 內(nèi)切酶的識別位點，因此HalNHalN基因型豬的擴增產(chǎn)物為2 條條帶，長度分別為494 bp 和166 bp。而HalnHaln基因型豬由于發(fā)生基因突變?nèi)鄙傧鄳?yīng)的酶切識別位點，酶切后依然是660 bp 長度的1 條條帶。HalNHaln基因型豬則會有3 條長度分別為494、166、660 bp 的條帶。

酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖2 所示，其中4 號個體的基因型為HalNHaln，其余個體基因型均為HalNHalN。

圖2 Hal 基因的PCR-RFLP 酶切結(jié)果

2.3 部分豬Hal基因測序結(jié)果 隨機抽取2 個個體進行Hal基因測序，測序由睿博興科（北京）測序部完成，測序結(jié)果如圖3、4。結(jié)果顯示2 個個體C1843 →T1843突變位點均未發(fā)生突變，說明其基因型均為HalNHalN，與本實驗中這2 個個體的酶切結(jié)果一致。

圖3 14 034 836 號個體Hal 基因測序結(jié)果

圖4 18 060 418 號個體Hal 基因測序結(jié)果

2.4Hal基因的基因型頻率及基因頻率 本研究對北京黑豬保種群中660 頭豬（公豬141 頭，母豬519 頭）進行了檢測。其中HalNHaln基因型豬45 頭（公豬14 頭，母豬31 頭），其余均為HalNHalN基因型，未檢測出HalnHaln基因型豬。表1 展示了Hal基因的基因型頻率及基因頻率。經(jīng)適合性檢驗，證明公豬群體、母豬群體及總?cè)后w在此位點均處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)。獨立性檢驗結(jié)果表明，基因型頻率的分布在不同性別豬群中差異不顯著（χ2=2.144<（1）=3.84）。

表1 Hal 基因的基因型頻率及基因頻率

3 討 論

3.1 氟烷敏感基因?qū)ωi生產(chǎn)的影響Hal基因有正負雙重效應(yīng)，其正效應(yīng)表現(xiàn)為帶有Haln基因的豬對環(huán)境中的刺激因素表現(xiàn)敏感，因此肌肉收縮也更持久、強烈，從而使得肌肉生長及脂肪消耗快于HalNHalN基因型豬，相對提高了瘦肉率。負效應(yīng)則表現(xiàn)為當(dāng)環(huán)境因素刺激壓迫或驟變時，容易引發(fā)PSS，產(chǎn)生PSE 肉，嚴重時甚至導(dǎo)致死亡，同時也會對豬的繁殖性能造成一定負面影響[8]。Cobanovic 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，雖然豬中存在的Haln基因?qū)﹄伢w瘦肉率產(chǎn)生積極影響，但同時也會對豬只健康、福利和肉質(zhì)產(chǎn)生有害影響，例如含有突變Haln基因的豬對肺炎的易感性較高并且更易感染傳染病。

大量研究結(jié)果表明，3 種基因型豬之間的肉色、pH和失水率等性狀存在顯著或極顯著差異。Pommier 等[10]發(fā)現(xiàn)HalnHaln基因型豬的肉質(zhì)劣于HalNHaln基因型豬，產(chǎn)生PSE 肉的概率大于HalNHaln基因型豬；HalNHaln基因型豬的肉質(zhì)又顯著劣于HalNHalN基因型豬，產(chǎn)生PSE 肉的概率大于HalNHalN基因型豬。此外，HalnHaln基因型豬的肉中可溶性蛋白和肌間脂肪會顯著降低，從而影響肉的口感和風(fēng)味[11]。在對繁殖性能的影響方面，多個研究[12-13]指出，HalNHalN和HalNHaln基因型豬的繁殖性能優(yōu)于HalnHaln基因型豬；鞠慧萍等[14]發(fā)現(xiàn)HalNHalN基因型的經(jīng)產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于HalNHaln和HalnHaln基因型豬。

通過本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在北京黑豬引入巴克夏和約克夏等國外豬品種血緣的培育過程中，既獲得了一些有利基因，也導(dǎo)致了Haln基因的發(fā)生。北京黑豬是我國培育的一種兼具國內(nèi)外豬種優(yōu)良特性的肉用豬種,其既有中國豬種耐粗飼、早熟多產(chǎn)、肉質(zhì)香嫩的優(yōu)勢，又兼有歐美豬種體型大、生長快、瘦肉率高的特點,且肌內(nèi)脂肪含量可達3%或以上，肉質(zhì)風(fēng)味濃郁芳香、口感優(yōu)良[15]。由于培育北京黑豬品種的目標是生產(chǎn)安全、質(zhì)優(yōu)、味美的黑豬肉，且北京黑豬本身生長性能較好，對于生長速度、日增重、飼料報酬率和瘦肉率等沒有過高要求。因此，根據(jù)本項目結(jié)果，建議直接剔除或慎重選用HalNHaln基因型種豬及其后代，選育不含隱性有害基因的HalNHalN基因型純合子種群，減少Haln基因?qū)е碌膽?yīng)激和經(jīng)濟損失。

3.2 基因型和等位基因頻率與分析 本研究中660 頭北京黑豬均為HalNHalN或HalNHaln基因型，無HalnHaln基因型豬，其中共45 頭（6.8%）豬基因型為HalNHaln，分別是14 頭（9.9%）公豬和31 頭（6.0%）母豬。公豬群體中Haln基因頻率為0.050，大于母豬群體中0.030 的基因頻率，總?cè)后w中平均Haln基因頻率為0.034。

公母群中均有雜合子個體存在，如果兩雜合子個體交配則會在后代中產(chǎn)生隱性純合個體。若群體內(nèi)隨機交配，子一代將有0.15%的個體基因型為HalnHaln，7.7%的個體基因型為HalNHaln，假設(shè)這519 頭母豬共產(chǎn)生5 000 個后代，其中約有7.5 頭豬易表現(xiàn)PSS，約385 頭豬攜帶Haln基因。若按傳統(tǒng)的通過表型淘汰隱性純合個體的方式消除Haln基因，根據(jù)公式Fn=F0/（1+N×F0）[16]，分別需要約71、971 代才能使群體Haln基因頻率降至0.01、0.001，不僅耗時久、花費大，還無法實現(xiàn)徹底凈化。由于目前群體中氟烷敏感基因攜帶者數(shù)量較少，可淘汰全部雜合子個體，從而徹底消除隱性有害基因，實現(xiàn)群體氟烷應(yīng)激敏感基因型的凈化，保障優(yōu)質(zhì)豬肉的生產(chǎn)。如果未淘汰全部雜合子，個體則應(yīng)嚴控選配計劃，防止雜合子配種，準確記錄系譜，并對雜合子的后代進行氟烷敏感基因型的檢測。

3.3 與不同豬種Haln基因頻率比較分析 大部分中國地方豬種的氟烷基因頻率低，如黔邵花豬[17]、蒙山黑土豬[18]、寧鄉(xiāng)豬[19]、雅南豬、太湖豬、內(nèi)江豬、成華豬[20]等攜帶Haln基因頻率均為零。但某些品種培育過程引進了外來豬種如長白或大約克豬等，或是由于長期保種，導(dǎo)致群體中Haln基因頻率較高，如三江白豬7.87%[21]、東北民豬16.67%[4]、豫西黑豬34.09%[2]。我國不同地區(qū)的大白、長白和杜洛克品種的Haln基因頻率差異較大，上海地區(qū)3 個品種的Haln基因頻率依次為1.95%、0.8%、11.56%[22]，北京地區(qū)為0%、17.11%、5.56%[23]，但多數(shù)都比我國本地品種的Haln基因頻率高。

北京黑豬是我國自主培育的豬種，其血統(tǒng)源自亞洲和歐洲的多個品種，遺傳背景豐富。而本文研究發(fā)現(xiàn)北京黑豬核心育種群中的Haln基因頻率僅為0.034，低Haln基因頻率也在一定程度上保證了北京黑豬肉質(zhì)風(fēng)味濃郁。

3.4 系譜分析 通過分析45 頭HalNHaln基因型豬的系譜，共找到77 個有親緣關(guān)系的個體，其中有22 個個體在本實驗中經(jīng)氟烷基因檢測證明為HalNHalN基因型豬。根據(jù)孟德爾遺傳定律推斷出剩余的55 個個體中有5 頭豬攜帶有Haln基因，有40 頭豬有0.5 的概率攜帶Haln基因，其余10 頭豬攜帶Haln基因的概率無法判斷。再對推斷出的5 頭HalNHaln基因型豬進行系譜追蹤，發(fā)現(xiàn)9 個疑似HalNHaln基因型的個體。建議對共49 個疑似HalNHaln基因型個體進行進一步的氟烷基因檢測，找出Haln基因攜帶個體并予以淘汰。

HalNHaln基因型個體的直系親屬有大概率攜帶Haln基因，但僅通過表型信息不能很好的發(fā)現(xiàn)并淘汰雜合子，易使Haln基因在群體內(nèi)擴散。因此通過實驗檢測氟烷基因并淘汰雜合子是十分必要和可行的策略。

4 結(jié) 論

本實驗利用PCR-RFLP 法對北京某黑豬群體共660份樣本進行了Hal基因檢測，檢測的北京黑豬豬群中未發(fā)現(xiàn)HalnHaln隱性純合有害個體，HalNHaln基因型占豬群體的6.8%，建議淘汰種豬群中的HalNHaln基因型個體，從而消除氟烷應(yīng)激敏感有害基因，實現(xiàn)豬場氟烷應(yīng)激敏感基因型的凈化。研究結(jié)果表明，PCR-RFLP 法可以有效實現(xiàn)氟烷應(yīng)激敏感基因的鑒定，并為群體氟烷應(yīng)激敏感有害基因的清除提供分子依據(jù)。