劉 波，芮 雪，方 翟，黃 飛，陶維昆，趙建清，李宏健，高慶華,3*

（1.新疆塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；4.新疆烏魯木齊畜牧獸醫(yī)總站，新疆烏魯木齊 830000）

多浪羊有較高的繁殖能力，性成熟早，且為常年發(fā)情，一般兩年產(chǎn)三胎，而且雙羔率較高，繁殖成活率在220%左右；卡拉庫爾羊繁殖率較低，一般發(fā)情受季節(jié)影響，產(chǎn)羔率在110%左右[1]。生殖激素受體基因是影響繁殖率的因素之一，促卵泡素受體（FSHR）基因介導(dǎo)促卵泡激素（FSH）作用于卵巢，是卵泡發(fā)育、成熟以及最終引發(fā)排卵的必需物質(zhì)[2]。研究FSHR基因如何加快卵泡的生長分化、促進(jìn)優(yōu)勢卵泡的形成以及提高低繁殖家畜的繁殖率具有重要意義。王惠娥等[3]研究多浪羊和卡拉庫爾羊卵巢FSHR基因發(fā)現(xiàn)多浪羊?qū)SH的敏感性高于卡拉庫爾羊，表明FSHR 含量越高繁殖率越高。早期的研究表明缺乏FSH 或FSH 受體的卵泡未能進(jìn)展到排卵前階段，導(dǎo)致不孕[4]。目前認(rèn)為，F(xiàn)SHR基因的組織特異性表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子的作用、DNA 甲基化、染色體的重建、染色體組蛋白的修飾及mRNA、蛋白的轉(zhuǎn)換有關(guān)[5]，其中DNA 甲基化對基因表達(dá)水平的調(diào)控尤其受到關(guān)注。Priya 等[6]對大鼠FSHR基因啟動子研究中觀察到了FSHR基因啟動子區(qū)甲基化帶，且研究DNA 甲基化可能有助于更好地理解綿羊生殖能力的表觀遺傳調(diào)控。DNA 甲基化是調(diào)節(jié)FSHR基因細(xì)胞特異性沉默的主要因素之一，但是目前DNA 甲基化與FSHR基因表達(dá)的研究尚處于早期，還不完全了解其調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過亞硫酸氫鹽測序（Bisulfite Genomic se-quencing PCR，BSP）技術(shù)檢測不同綿羊FSHR基因啟動子區(qū)DNA 甲基化水平差異來探究綿羊FSHR基因啟動子區(qū)DNA 甲基化水平與繁殖性狀的關(guān)系，為進(jìn)一步研究綿羊FSHR基因啟動子區(qū)DNA 甲基化水平與FSHR基因表達(dá)量的關(guān)系提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 血液/ 組織/ 細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304）、RNaseA（100 mg/mL）溶液（RT405-12）、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（CB101）、紅細(xì)胞裂解液（RT122）、10×Loading Buffer、DL 2000（8000）Marker 分子量標(biāo)記、快捷性瓊脂凝膠DNA 回收試劑盒、pMD19-T 載體、Hot Start Taq 聚合酶、瓊脂、瓊脂糖、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、無水乙醇等均購自天根生化科技有限公司。甲基化處理試劑盒（D5005）購置于ZYMO RESEARCH 公司。

1.1.2 主要儀器 PCR 儀（BIO RAD，C100）；核酸濃度檢測儀（Thermo，ND-One）；-80℃超低溫冰箱（Thermo，ExF24086V）；低溫高速冷凍離心機(jī)（Sigma，3K30）；高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY，SX-500）；超凈工作臺（Boxum，SHC-CT-22）；恒溫水浴鍋（上海博訊，HHS-21-4）；電泳儀；凝膠成像儀。

1.1.3 試劑配制 試劑配制均以滅菌蒸餾水為溶劑，高壓滅菌條件：高壓蒸汽滅菌30 min。其余參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版李載平等[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集 本實(shí)驗(yàn)使用的動物分別為多浪羊和卡拉庫爾母羊各3 只，均為1 歲母羊，且同品種間無血緣關(guān)系。血液采自塔里木大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)站，使用一次性采集容器（EDTA-K2）靜脈采血后送回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA 的提取與檢測 使用試劑盒DP304按照步驟提取不同綿羊血液組織基因組DNA。提取前所用器具高溫高壓滅菌并做烘干處理；使用DNA 提取試劑盒時，應(yīng)該按照使用說明提取DNA；提取完成后使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測質(zhì)量，使用凝膠成像儀觀察基因組DNA 的片段大小及亮度情況，使用核酸濃度檢測儀檢測提取的綿羊血液組織DNA 濃度和純度，并拍照記錄。

1.2.3 基因啟動區(qū)引物設(shè)計(jì)合成與預(yù)測 參考綿羊FSHR基因序列（Gene ID：443299），根據(jù)FSHR基因啟動子區(qū)，使用MethPrimer 在線網(wǎng)站（www.bioon.com.cn/sub/showarticle.asp）預(yù)測FSHR基因啟動子序列存在的CpG 島檢測區(qū)域是否符合實(shí)驗(yàn)要求，根據(jù)符合要求的區(qū)域設(shè)計(jì)FSHR基因啟動子區(qū)的引物，上游引物：5'-GTGTTTTTGTTTGGAGAATTTTAGG-3'，下游引物：5'-TCAATCAAAAAACCATCTACTTTCA-3'，送往廣州伯信生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.4 基因啟動子區(qū)的擴(kuò)增及回收純化 以BSP 處理后的綿羊血液DNA 為模板，對FSHR基因設(shè)置最佳PCR擴(kuò)增體系，PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，68～53℃退火，每個循環(huán)降3℃，10 個循環(huán)；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30 次；72℃終延伸10 min；4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增完成后，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，舍棄擴(kuò)增失敗引物，并拍照做好記錄。按瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒說明進(jìn)行產(chǎn)物回收純化。

1.2.5 T-A 克隆及熱激轉(zhuǎn)化 將綿羊FSHR基因啟動子區(qū)PCR 擴(kuò)增后回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，加DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選。

1.2.6 陽性克隆鑒定 過夜培養(yǎng)后會產(chǎn)生藍(lán)白色菌斑。吸取1 mL 的LB 液體培養(yǎng)基加入到1.5 mL 離心管內(nèi)，用滅菌處理過的牙簽或者槍頭挑取飽滿的白色菌落放于離心管中，放置于恒溫?fù)u床（37℃，200 rpm）中振蕩培養(yǎng)8 h 左右。參照DNA 模板PCR 擴(kuò)增體系將DNA模板換成菌液進(jìn)行PCR 鑒定，2%凝膠電泳檢測，挑選優(yōu)質(zhì)（單一清晰，片段大小與目的片段一致的條帶）對應(yīng)菌液送至測序。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 CpG 位點(diǎn)的甲基化水平=各CpG 位點(diǎn)的甲基化/ 克隆數(shù)；應(yīng)用QUMA（http://quma.cdb.riken.jp/）在線軟件分析克隆測序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpG 島在線預(yù)測 預(yù)測結(jié)果為：CpG 島長度>100 bp，GC 含量>50%，期望值>0.6，檢測區(qū)域符合實(shí)驗(yàn)要求，預(yù)測結(jié)果如圖1 所示。

圖1 FSHR 基因啟動子區(qū)CpG 島預(yù)測結(jié)果

2.2 基因組DNA 的提取 利用基因組提取試劑盒按照操作步驟提取基因組DNA，使用1% 的瓊脂糖凝膠電泳以及核酸濃度檢測儀分別檢測其濃度、純度。提取的基因組DNA 濃度均可達(dá)到200 ng/μL 以上，OD260/OD280值均在1.8～2.0 之間。因此，提取的血液組織基因組DNA 質(zhì)量較好，滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件，電泳檢測結(jié)果如圖2 所示。

圖2 綿羊基因組DNA

2.3 基因組DNA 甲基化BSP 擴(kuò)增 分別以重亞硫酸鹽修飾處理過的多浪羊與卡拉庫爾羊血液組織基因組DNA 為模板，對FSHR基因啟動子區(qū)進(jìn)行BSP-PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段長度為189 bp，擴(kuò)增片段大小均與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符（圖3）。

圖3 BSP 處理后FSHR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 DNA 甲基化BSP 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收 對FSHR基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，回收純化的DNA 產(chǎn)物片段長度為189 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖4）。

圖4 純化后FSHR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.5 DNA 甲基化BSP 克隆 回收純化的DNA 片段分別進(jìn)行TA 克隆和菌液PCR 檢測，菌液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度都為189 bp（圖5），表明重組克隆載體pGM-T 構(gòu)建成功。

圖5 重組克隆載體菌液PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.6 測序結(jié)果及分析 如圖6 所示，非甲基化位點(diǎn)中的非甲基化的“C”均轉(zhuǎn)化為“T”，而其余堿基完全一致。

圖6 DNAMAN 序列比對結(jié)果

運(yùn)用QUMA 在線網(wǎng)站（http://quma.cdb.riken.jp/）對6 個測序序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，目的片段中的4 個位點(diǎn)為甲基化位點(diǎn)，如圖7 所示，多浪羊中28、49、71位點(diǎn)均不發(fā)生甲基化，61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化?？ɡ瓗鞝栄蛑?-3、1-4 羊在28、71 位點(diǎn)不發(fā)生甲基化，在49、61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化。1-5 號卡拉庫爾羊在28 位點(diǎn)不發(fā)生甲基化，而在49、61、71 位點(diǎn)均發(fā)生甲基化（圖7）。

圖7 甲基化位點(diǎn)QUMA 分析結(jié)果

由圖8 可知，多浪羊FSHR基因啟動子區(qū)中的目的序列甲基化位點(diǎn)低于卡拉庫爾羊。

圖8 甲基化位點(diǎn)QUMA 分析結(jié)果

如圖9 所示，多浪羊組與卡拉庫爾羊組FSHR基因在啟動子區(qū)目的片段中的28 位點(diǎn)都不發(fā)生甲基化；在49 位點(diǎn)只有卡拉庫爾羊發(fā)生甲基化，甲基化率100%，而多浪羊組不發(fā)生甲基化；61 位點(diǎn)多浪羊組與卡拉庫爾羊組全部發(fā)生甲基化，甲基化率100%；71 位點(diǎn)只有卡拉庫爾羊發(fā)生甲基化，甲基化率33.3%，多浪羊組的平均甲基化率為25.0%，卡拉庫爾羊組的平均甲基化率為58.3%。

圖9 甲基化位點(diǎn)QUMA 分析結(jié)果

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過DNA 甲基化檢測的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”BSP檢測了多浪羊與卡拉庫爾羊FSHR基因啟動子區(qū)甲基化水平，結(jié)果顯示在多浪羊和卡拉庫爾羊FSHR基因啟動子區(qū)目的片段中發(fā)現(xiàn)4 個甲基化位點(diǎn)，且多浪羊甲基化發(fā)生率顯著低于卡拉庫爾羊，推測在多浪羊與卡拉庫爾羊中FSHR基因表達(dá)與DNA 甲基化水平及甲基化位點(diǎn)具有一定的相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中，DNA 甲基化模式似乎在分化和分化細(xì)胞的基因調(diào)控方面起著關(guān)鍵作用[8]。DNA 甲基化通過圖式和數(shù)量的改變對生物信息學(xué)進(jìn)行調(diào)節(jié)，在基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[9]?；騿幼訁^(qū)及附近區(qū)域CpG 島的甲基化是許多基因完成表達(dá)與沉默的調(diào)控方式，通過對啟動子區(qū)CpG 島甲基化狀態(tài)檢測來反映出基因表達(dá)情況。通過對大鼠FSHR基因的核心啟動子區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，7 個CpG 二核苷酸位點(diǎn)與小鼠FSHR基因啟動子區(qū)的4 個CpG 二核苷酸位點(diǎn)，經(jīng)BSP 測序發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)FSHR的大鼠/小鼠細(xì)胞中這些潛在甲基化位點(diǎn)均未被甲基化，而在不表達(dá)FSHR的大鼠/ 小鼠的組織細(xì)胞中這些位點(diǎn)的CpG 二核苷酸均被甲基化[10]。盡管大鼠/ 小鼠FSHR啟動子中CpG 二核苷酸并不豐富，但啟動子中非特定位點(diǎn)的DNA 甲基化與基因失活相關(guān)，DNA 甲基化在大鼠/ 小鼠FSHR基因的調(diào)節(jié)過程中起著主要作用[11]。蔣曹德等[12]利用甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)技術(shù)（MSAP）分析了甲基化與生長性狀的關(guān)系，在檢測到的1 274 個甲基化位點(diǎn)中，有252 個多態(tài)性甲基化位點(diǎn)，其中有81 個位點(diǎn)對1 個或多個生長性狀有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)在綿羊血液FSHR基因啟動子區(qū)目的片段中找到4 個甲基化潛在位點(diǎn)，其中在多浪羊組中只有在61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化，而卡拉庫爾羊組中分別在49、61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化，71 位點(diǎn)部分卡拉庫爾羊發(fā)生甲基化，推測在不同位點(diǎn)發(fā)生甲基化可能對FSHR基因的表達(dá)與繁殖力具有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)，源自睪丸腫瘤的小鼠睪丸支持細(xì)胞株（MSC-1）具有非活性的FSHR啟動子[13]，并且MSC-1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的非活性狀態(tài)與FSHR基因核心啟動子的胞嘧啶甲基化相關(guān)[14]。張燕麗等[15]對綿羊卵巢與多產(chǎn)性相關(guān)的DNA甲基化譜進(jìn)行全基因組分析，發(fā)現(xiàn)一些與激素功能相關(guān)的差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因，如FSHR和FST，高繁殖力群體組與低繁殖力群體組相比卵巢組織中的甲基化水平（FSHR和FST上調(diào)，LHCGR下調(diào)）有顯著差異，這可能會影響這些基因的mRNA 表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高繁殖力的多浪羊與低繁殖力的卡拉庫爾羊中FSHR基因啟動子區(qū)的目的片段中49 位點(diǎn)差異極顯著，這可能是影響FSHR基因表達(dá)量的因素之一，這一甲基化位點(diǎn)與FSHR基因的表達(dá)量是否相關(guān)還需進(jìn)一步研究。

研究表明，基因的啟動子區(qū)域和外顯子的低甲基化和高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即甲基化密度高抑制基因表達(dá)，密度低促進(jìn)基因表達(dá)[16]。梁慧慧等[17]對綿羊下丘腦GNAQ基因研究發(fā)現(xiàn)適量的葉酸濃度使DNMT1基因表達(dá)上調(diào)，GNAQ啟動子區(qū)CpG 位點(diǎn)甲基化水平上調(diào)，引起GNAQ表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而間接調(diào)控了GnRH的分泌。羅榮松等[18]對奶綿羊與蒙古羊全基因組DNA 甲基化研究中發(fā)現(xiàn)，奶綿羊和蒙古羊肌肉和尾脂組織具有一致的DNA 甲基化動態(tài)；尾脂組織的甲基化水平高于肌肉組織。啟動子區(qū)的GC 含量從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向側(cè)翼區(qū)域逐漸降低隨后趨于穩(wěn)定，并與DNA 甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，GC 含量越高甲基化水平越低。王小莉等[19]通過對大鼠不同細(xì)胞的研究，得到大鼠胰島和INS-1細(xì)胞中INS-1基因高表達(dá)，啟動子區(qū)域的甲基化程度非常低，然而在大鼠其他組織和WB 細(xì)胞中INS-1基因不表達(dá)，啟動子區(qū)域的甲基化程度很高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為在卡拉庫爾羊血液中FSHR基因甲基化水平顯著高于多浪羊，而基因的甲基化一般對基因的表達(dá)量有負(fù)調(diào)控作用，推測多浪羊與卡拉庫爾羊DNA 甲基化水平可能與FSHR基因的表達(dá)呈一定負(fù)相關(guān)。FSHR基因的DNA 甲基化水平及位點(diǎn)差異可能是影響繁殖力的重要因素之一，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究FSHR基因在綿羊卵巢中的表達(dá)與DNA 甲基化水平的關(guān)系提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

多浪羊FSHR基因啟動子區(qū)中目的片段平均甲基化水平為25%，卡拉庫爾羊FSHR基因啟動子區(qū)目的片段平均甲基化水平為58.3%，多浪羊與卡拉庫爾羊在目的片段CpG 島上49 號位點(diǎn)甲基化水平差異較大，2 個品種間FSHR基因啟動子區(qū)目的片段DNA 甲基化水平差異顯著，推測FSHR基因甲基化水平與綿羊FSHR基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。