吳正明，邱丙姍，李志勛，程 娜，翁亞煩，李再磊，趙桂英*

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

我國很多地區(qū)都分布有獨(dú)具特色的地方豬種資源，它為我國養(yǎng)豬生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，也是滿足人類需求的一份重要基因庫。近年來，隨著組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，地方豬種資源的保護(hù)及開發(fā)利用越來越受到重視。有相關(guān)研究表明，大多數(shù)中國地方豬具有肉質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)和繁殖力高等特性[1]。研究調(diào)控中國地方豬種優(yōu)質(zhì)性狀的分子機(jī)制，發(fā)掘和鑒定中國地方豬種優(yōu)質(zhì)性狀的主效基因?qū)χ袊胤截i種資源的保護(hù)及開發(fā)利用具有重要意義。轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）指某一物種在某一特定生理狀態(tài)下的單個細(xì)胞或細(xì)胞群體內(nèi)幾乎全部轉(zhuǎn)錄本，即轉(zhuǎn)錄后所有mRNA 的總稱[2]，它不僅是研究基因結(jié)構(gòu)、功能和不同基因間表達(dá)差異的基礎(chǔ)，也是探索未知功能基因的方法之一[3]。轉(zhuǎn)錄組測序即RNASeq（Ribonucleic Acid Sequencing），是一種與高通量測序技術(shù)相結(jié)合從而對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析的技術(shù)[4]，其具有高靈敏度、成本低和不受物種限制等特點(diǎn)，是一種被運(yùn)用在轉(zhuǎn)錄組學(xué)上比較精確的測定分析方法[5]?，F(xiàn)今RNA-Seq 普遍運(yùn)用在各種畜禽重要分子機(jī)制和鑒定相關(guān)功能基因的研究領(lǐng)域?；赗NA-Seq 技術(shù)，研究者采用了不同的策略開展了不同品種豬各組織間存在的差異表達(dá)基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）的鑒定和篩選，并對不同豬種間的種質(zhì)差異進(jìn)行相關(guān)分析。Liu 等[6]利用RNA-Seq 技術(shù)對民豬和大白豬背最長肌建立了轉(zhuǎn)錄組文庫，通過基因表達(dá)圖譜鑒定了1 371 個DEGs，為研究不同品種豬肉質(zhì)差異的形成機(jī)制提供了參考。Ropka 等[7]通過對5 個品種944 個樣本的RNA-Seq 數(shù)據(jù)分析，找到了2 個與肌纖維直徑和密度極顯著相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），說明基于RNA-Seq數(shù)據(jù)的SNPs 分析可用于尋找和定位基因。Liu 等[8]采用RNA-Seq 技術(shù)分別對妊娠期不同日齡（40、55、63、70、90 d）通城豬與約克夏豬的骨骼肌轉(zhuǎn)錄圖譜進(jìn)行了綜合比較，分別檢測到了1 317 個和691 個DEGs，結(jié)果顯示55 d 是導(dǎo)致通城豬和約克夏豬發(fā)育差異的關(guān)鍵階段，并闡明了2 個品種間發(fā)育差異的6 個關(guān)鍵候選基因。Huang 等[9]比較了金華豬和長白豬肝臟中環(huán)狀RNA 的差異表達(dá)情況，挖掘到336 個DEGs，結(jié)合GO（Gene Ontology）分析發(fā)現(xiàn)其宿主基因大部分與代謝途徑相關(guān)。上述研究為轉(zhuǎn)錄組層次闡明豬種間的差異表達(dá)奠定了分子基礎(chǔ)。盡管通過RNA-Seq 技術(shù)挖掘了大批與生產(chǎn)和肉質(zhì)性狀相關(guān)的候選基因，但只在國外豬種和我國少數(shù)地方豬種的研究中有相關(guān)報道，而云南地方豬種的相關(guān)研究更是鮮有報道，大量優(yōu)良地方豬種的遺傳基礎(chǔ)仍很薄弱，仍需深入研究。本研究擬選用生產(chǎn)性能和肉質(zhì)性能存在較大差異的云南地方豬——撒壩豬（肉脂兼用型品質(zhì)）和國外引進(jìn)的杜洛克豬（瘦肉型品種）為材料，采用RNA-Seq 技術(shù)篩選撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織的DEGs，并對篩選的DEGs 進(jìn)行GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析和可變剪接分析，對調(diào)控撒壩豬生長性狀和肉質(zhì)性狀的相關(guān)候選基因進(jìn)行挖掘，為進(jìn)一步闡明中國地方豬種生產(chǎn)及肉質(zhì)性能遺傳機(jī)制及探索肝臟組織的轉(zhuǎn)錄譜提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和樣品制備 選擇胎次、產(chǎn)仔日齡相近的撒壩豬和杜洛克豬肥豬各4 頭，飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)習(xí)豬場，在相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)至260日齡（撒壩豬體重近90 kg，杜洛克豬體重近110 kg）后屠宰，屠宰后用無RNA 酶的凍存管采集肝臟樣品，樣品在低溫條件下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并存于-80℃的冰箱中。

1.2 總RNA 的提取和文庫的構(gòu)建 用Trizol 試劑分別提取每頭撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織中的總RNA；Nanodrop、瓊脂糖凝膠電泳、Qubit、Aglient 2100 等軟件檢測總RNA 的濃度、純度和完整性，提取完整性和純度檢測符合要求后的總RNA 樣本。向Oligo（dT）的磁珠富集過的mRNA 中加入fragmentationbuffer，把mRNA 打斷片段。以mRNA 為模板、六堿基為隨機(jī)引物合成第1 鏈cDNA；加入dNTPs、緩沖液、DNA polymerase I 和RNase H 合成第2 鏈cDNA。先 對cDNA 進(jìn)行純化并洗脫、做末端修復(fù)和連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增富集cDNA 即完成文庫制備。

1.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控 為了知曉測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的優(yōu)劣，對在Illumina 測序平臺上完成測序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下機(jī)后進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控包含3 個方面：堿基質(zhì)量的分布、堿基平衡性和重復(fù)序列水平。對原始序列進(jìn)行質(zhì)量評估的目的是通過評估數(shù)據(jù)質(zhì)量的情況來引導(dǎo)是否有必要進(jìn)行下游分析。堿基平衡性分析可以清晰檢測到數(shù)據(jù)中是否具有AT、GC 分散情況，正常情況下4 種堿基出現(xiàn)頻率是一致的，并且位置上也沒有差異，當(dāng)個別位置堿基的比例發(fā)生偏斜現(xiàn)象時，往往提示有超出比例的核酸污染。測序深度越高，越容易產(chǎn)生一定程度的重復(fù)，這屬于正?，F(xiàn)象；但如果重復(fù)的程度很高，可能有大量核酸受到了污染。

1.4 基因差異表達(dá)與富集分析 以每百萬序列中來自于某基因每千堿基長度的序列數(shù)（Reads Per Kilobase per Million reads，RPKM）作為基因表達(dá)量的衡量水平，計算公式如下：

為了對假陽性率（False Positive rate）的控制，需結(jié)合假發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）即P-value和RPKM 值倍數(shù)變化（Fold Change，F(xiàn)C）對DEGs 進(jìn)行篩選。以|logFC|>1 且FDR<0.05 為條件篩選出撒壩豬與杜洛克豬肝臟組織表達(dá)量顯著差異的基因。為了比較2 個豬種間基因表達(dá)量的差異，以lgRPKM 值進(jìn)行聚類分析。使用edgeR[7]對撒壩豬與杜洛克豬肝臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，并利用DESeq[8]軟件對DEGs進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路顯著富集分析。

1.5 差異剪接事件檢測 rMATS 軟件具有對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行自動檢測和差異可變剪接分析的優(yōu)點(diǎn)，因此可用該軟件對成對樣品進(jìn)行可變剪接事件分析，主要通過rMATS 統(tǒng)計模型的方式檢測不同樣品的可變剪切類別及相應(yīng)的表達(dá)量（ψ），并設(shè)定|Δψ|=|ψ1 ? ψ2|<0.05 為差異表達(dá)閾值。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù) 利用RNA-Seq 進(jìn)行撒壩豬和杜洛克肝臟組織轉(zhuǎn)錄組測序，每個文庫產(chǎn)生1 億多個原始序列，過濾掉低質(zhì)量、帶接頭和重復(fù)的原始序列后，8 個RNA-Seq 文庫中均獲得8 900 萬個以上的過濾序列，經(jīng)過濾處理后，約有97.13%的序列被定位到杜洛克豬的參考基因組（Sus scrofa 11.1），低于撒壩豬的97.34%。杜洛克豬的外顯子、內(nèi)含子和基因組間區(qū)域分別占85.83%、3.62%和10.28%。而約克夏豬區(qū)域的外顯子、內(nèi)含子和基因組區(qū)間分別占89.56%、4.23% 和0.588%。2 種豬所比對到參考基因組上的序列比例錯誤率小于0.001（Q30）的均大于99%。結(jié)果表明：RNASeq 得到的數(shù)據(jù)利用率高，所選擇的參考基因組能夠滿足本實(shí)驗(yàn)后續(xù)分析的需求。

2.2 篩選DEGs 從差異基因火山圖（圖1）中可以非常直觀并且合理地篩選出撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織的DEGs。其中x 軸為lgFC 值，y 軸為lgFDR 值。結(jié)果顯示從撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織間共鑒定出2 326 個差異表達(dá)基因，在撒壩豬上調(diào)顯著表達(dá)基因有1 049 個，在杜洛克豬顯著上調(diào)表達(dá)的基因有1 277 個。

本研究同時還通過熱圖顯示了撒壩豬和杜洛克豬差異表達(dá)基因的表達(dá)水平（圖2），可以清楚地觀察到這2 個品種豬肝臟組織的基因表達(dá)量存在差異。

圖2 差異表達(dá)基因熱圖

2.3 DEGs 的功能分析 將2 豬種篩選到的2 326 個表達(dá)顯著差異的基因與GO 數(shù)據(jù)庫和KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比。在2 個數(shù)據(jù)庫中共有926 個DEGs 被注釋，其中在GO 數(shù)據(jù)庫中共檢測到521 個差異表達(dá)基因，在KEGG數(shù)據(jù)庫中共檢測到651 個差異表達(dá)基因。

2.3.1 GO 富集分析 將521 個DEGs 注釋到GO 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類，分類內(nèi)容包括：分子功能（Molecular Function，MF）、生物過程（Biological Process，BP）及細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）3 個方面。其中MF 分成7 個小類，BP 分成33 個小類，CC 分成12 個小類。在BP 分類中參與代謝過程的DEGs 最多；在CC分類中參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞外環(huán)境的DEGs 最多；在MF 分類中調(diào)控催化活性的DEGs 最多（圖3）。

圖3 差異表達(dá)基因GO 注釋

首先，通過與整個基因組背景相比并應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，挑選出撒壩豬與杜洛克豬肝臟組織的DEGs 顯著富集的GO 條目。圖4 為按P-value 值排序選擇的20 個最顯著GO 條目作出的GO 富集分析散點(diǎn)圖。用-log10（P-value）表示富集的顯著性（橫軸），該值越大富集得越顯著，縱軸表示富集到的GO 條目數(shù)。圓點(diǎn)大小及顏色的深淺表示該GO 條目包含的差異基因數(shù)目和富集程度。

圖4 差異表達(dá)基因GO 富集分析散點(diǎn)圖

2.3.2 KEGG 富集分析 首先，通過與整個基因組背景相比并應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，篩選出撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織DEGs 中顯著性富集的通路。共有47 條顯著富集的通路，其中有24 條通路發(fā)生上調(diào)，有23 條通路發(fā)生下調(diào)。對DEGs 做KEGG 通路富集后，統(tǒng)計出它們參與的KEGG 代謝通路，如圖5 所示：橫軸表示富集的顯著性，P值越高表示富集得越顯著，縱軸表示富集的KEGG 通路數(shù)。圓點(diǎn)大小表示KEGG 通路包含的差異基因數(shù)目，顏色深淺表示KEGG 富集因子富集的程度。這里按P值進(jìn)行排序，挑選顯著性最高的前20 個KEGG 條目作出相應(yīng)的KEGG 通路富集散點(diǎn)圖；20 條有關(guān)生產(chǎn)和肉質(zhì)性能的代謝通路具體情況如表1 所示。

表1 撒壩豬與杜洛克豬之間表達(dá)差異顯著的有關(guān)生產(chǎn)性能及肉質(zhì)性能的相關(guān)通路

圖5 差異表達(dá)基因KEGG 富集分析散點(diǎn)圖

2.4 可變剪接分析 本研究通過對撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織DEGs 可變剪接事件的檢測發(fā)現(xiàn)，共有5 種可變剪接事件類型：外顯子互斥（Mutually Exclusive Exons，MEX）、外顯子跳躍（Skipped exon，SE）、內(nèi)含子保留（Retained intron，RI）、5'端可變剪接（Alter native 5’splice site，A5SS）和3'端可變剪接（Alternative 3'splice site，A3SS）。交叉點(diǎn)讀數(shù)（Junction reads）中檢測到總可變剪接事件數(shù)分別為21 487、3 489、438、746 和1 319；交叉點(diǎn)讀數(shù)檢測到的撒壩豬和杜洛克豬差異可變剪接事件比例分比為369:266、820:498、21:20、7:24 和14:22；目標(biāo)讀數(shù)（Reads on target）和交叉點(diǎn)讀數(shù)檢測到的總可變剪接事件數(shù)分別為21 491、3 489、439、747 和1 329；目標(biāo)讀數(shù)和交叉點(diǎn)讀數(shù)檢測到的撒壩豬和杜洛克豬存在差異可變剪接事件比例為389:282、817:495、20:20、9:29 和13:20（表2）。

表2 可變剪接事件分析

3 討 論

本研究通過對GO 數(shù)據(jù)庫和KEGG 數(shù)據(jù)庫顯著富集通路的分析，初步篩選出PPAR 信號通路等20 條有關(guān)生產(chǎn)和肉質(zhì)性能的代謝通路，撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織間共鑒定出2 326 個差異表達(dá)基因，其中大部分通路內(nèi)富集的DEGs 與脂類代謝調(diào)控有關(guān)，包含脂蛋白酯酶（Lipoprotein Lipase,LPL）、長鏈脂酰輔酶A 合成酶3（Long-chain Acyl-CoA Synthetase3，ACSL3）、6-磷酸果糖激酶（6-phesphofructokinase,PFKL）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4,FABP4）、瘦素（Leptin，LEP）、脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（Latty Acid Trans port Proteins 4，F(xiàn)ATPs4）、脂聯(lián)素（Adiponectin，ADIPOQ）、脂肪酸結(jié)合蛋白1（Fatty Acid Binding Protein1，F(xiàn)ABP1）、長鏈輔酶A 脫氫酶（Long-chain Acyl-CoA dehydrogenase，ACADL）等。

肝臟是研究脂質(zhì)代謝的重要組織，也是脂肪酸合成最主要的場所，因此肝臟是研究代謝過程、免疫、生長和肉質(zhì)的首選組織[10]。李建平等[11]通過對育成豬飼喂不同脂肪源飼料飼養(yǎng)屠宰后,采肝臟組織樣品做轉(zhuǎn)錄組差異分析，結(jié)果表明對肝臟組織差異基因的GO 富集分析和KEGG 富集分析中均有與脂類代謝相關(guān)基因被注釋；Ge 等[12]選取低肌內(nèi)脂肪酸和高肌內(nèi)脂肪酸的巢湖鴨肝臟組織為實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出9 個與脂肪沉積的相關(guān)基因；本研究結(jié)果和以往的研究結(jié)果大致相同，表明肝臟確實(shí)是研究脂質(zhì)代謝的重要組織。

撒壩豬LPL基因表達(dá)量較高，是杜洛克豬的28.3倍，提示它和脂肪沉積能力較高的性狀有關(guān)。脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL）位于豬14 號染色體上，屬于水解酶家族，LPL對脂質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的代謝及相關(guān)代謝物的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮重大作用，它能將血乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的三酰甘油分解為脂肪酸和甘油，并將脂肪酸和甘油轉(zhuǎn)運(yùn)至機(jī)體相應(yīng)組織中儲存[13]。Wang 等[14]對藏豬和滇南小耳豬兩個中國地方豬與大白和長白豬兩個外來豬背最長肌進(jìn)行同位素標(biāo)記的相對和絕對定量，找到LPL等10 個與脂肪沉積能力相關(guān)的基因，其中藏豬-滇南小耳豬組LPL基因表達(dá)量是大白豬-長白豬組的2.84 倍，從而LPL被認(rèn)為與藏族和滇南小耳豬較高的脂肪沉積能力有關(guān)；本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果具有一致性。

ADIPOQ基因是被人們所發(fā)現(xiàn)唯獨(dú)與肥胖呈負(fù)相關(guān)的激素，ADIPOQ基因通過受體1（AdipoR1）、受體2（AdipoR2）以及T-黏鈣蛋白相結(jié)合來調(diào)控機(jī)體內(nèi)脂肪的含量，當(dāng)生物體內(nèi)脂肪含量過高時，就會減少ADIPOQ基因的表達(dá)量和ADIPOQ在血液中的含量[15]。Cirera 等[16]分別采集哥本哈根迷你豬和杜洛克豬背最長肌、背部脂肪、肝臟組織，測定ADIPOQ基因在2豬種間3 個組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示：ADIPOQ基因哥本哈根迷你豬和杜洛克豬背最長肌、背部脂肪、肝臟組織中的表達(dá)量并沒有明顯差異，但ADIPOQ基因在杜洛克豬中表達(dá)量稍高于哥本哈根迷你豬；而本研究表明ADIPOQ基因在杜洛克豬中的表達(dá)量極顯著高于撒壩豬，可能是撒壩豬脂肪沉積能力高于哥本哈根迷你豬所導(dǎo)致的。

PPAR 信號通路可能是影響撒壩豬脂肪沉積能力的關(guān)鍵通路。過氧化物酶體增值激活受體是甾體激素受體超家族成員，通過與類色素x 受體相結(jié)合而轉(zhuǎn)變?yōu)楫惗垠w，它是調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥以及調(diào)節(jié)糖代謝等的相關(guān)基因[17-18]。PPARα、PPARβ和PPARγ是PPAR 的3 種不同亞型；其中PPARα和PPARβ主要在肝臟及脂肪酸氧化水平較高的組織中發(fā)揮作用，PPARγ主要作用于脂肪細(xì)胞，影響其分化和生長，也是I 型糖尿病藥物治療的靶點(diǎn)[19]。

4 結(jié) 論

本研究對撒壩豬和杜洛克豬肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定出2 326 個DEGs，結(jié)合GO 分析和KEGG通路富集分析，本研究初步認(rèn)為LPL、ACSL3、DIPOQ等9 個基因和PPAR 信號通路等16 條代謝通路在撒壩豬的肉質(zhì)形成中發(fā)揮了重要作用，研究結(jié)果為揭示撒壩豬肉質(zhì)和生長性狀的形成機(jī)制提供了重要的參考數(shù)據(jù)，并提高了對脂質(zhì)沉積相關(guān)分子機(jī)制的認(rèn)識。