趙雨農(nóng)，李 盼，段夢(mèng)琪，商 鵬，張 博

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室/高原畜禽遺傳資源研究中心，北京 100193；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000）

我國(guó)是豬肉生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，目前豬肉市場(chǎng)大多被瘦肉型三元雜交豬占據(jù)[1-2]。此類(lèi)豬種具有生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高的特點(diǎn)，但其肉品質(zhì)遠(yuǎn)不如我國(guó)許多地方豬種，比如民豬、金華豬、藏豬等[3-5]。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)畜禽種業(yè)越來(lái)越重視，對(duì)本土種質(zhì)資源的普查、保存、開(kāi)發(fā)及利用已是當(dāng)前遺傳育種的重要任務(wù)之一。藏豬是我國(guó)特有的小型高原豬種，具有生長(zhǎng)速度慢、肉質(zhì)風(fēng)味佳的特點(diǎn)，深受廣大民眾喜愛(ài)[6-7]，但其出欄周期長(zhǎng)、養(yǎng)殖成本高，通過(guò)分子育種技術(shù)對(duì)藏豬生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)性狀開(kāi)展研究是推動(dòng)本地品種更好地進(jìn)入市場(chǎng)、最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的重要手段。

PGM1（Phosphoglucomutase1）是一個(gè)有效的磷酸葡萄糖變位酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)。豬PGM1基因位于6 號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端，與多個(gè)肌肉生長(zhǎng)或肉品質(zhì)相關(guān)基因位于同一區(qū)域[8-11]。PGM1基因在豬組織中廣泛表達(dá)，其中骨骼肌中的表達(dá)最豐富[12]，該基因缺乏可能直接影響糖原代謝、糖酵解和蛋白質(zhì)糖基化。PGM1基因與肌肉形成過(guò)程有密切聯(lián)系，能夠影響肌肉發(fā)育[13]。

本研究選擇中國(guó)地方豬種藏豬和引進(jìn)豬種約克夏豬為研究對(duì)象，采用Sanger 測(cè)序?qū)GM1基因5'端上游3 000 bp 的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行篩選，通過(guò)熒光定量檢測(cè)藏豬和約克夏豬的肝臟、背最長(zhǎng)肌、背脂組織中PGM1基因mRNA 水平表達(dá)量，分析PGM1基因?qū)Σ刎i生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控功能，為藏豬資源保護(hù)和品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究選擇飼養(yǎng)在西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)牧場(chǎng)的180 日齡大小體重相近、性別均為公豬、飼喂方式相同、健康狀況良好的藏豬（TP）和約克夏豬（YY）各6 頭，屠宰采集肝臟、背最長(zhǎng)肌、背脂等組織，液氮速凍，-80℃保存，用于總RNA 提取。另外，采集80份耳組織（藏豬40 頭，約克夏豬40 頭），放入75%酒精中，-20℃保存，用于基因組DNA 提取。

1.2 DNA、RNA 提取與cDNA 合成 采用苯酚/ 氯仿抽提法從耳組織中提取基因組DNA[14]，用1% 瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 質(zhì)量和濃度，RNase-Free ddH2O 溶解，-20℃保存。

利用RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，CW0584S）提取實(shí)驗(yàn)豬背最長(zhǎng)肌、背脂和肝臟組織的總RNA。用Nano Drop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 質(zhì)量和濃度，-80℃保存。

采用cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒（北京天根生化科技有限公司，KR180123）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SNPs 篩選與轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI 網(wǎng)站下載PGM1基因組序列（登錄號(hào)：NC_010448.4），使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)5'側(cè)翼區(qū)3 000 bp 序列的特異性引物（表1）。由北京六合華大基因科技有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。

1.3.2 SNPs 篩選 利用驗(yàn)證成功的特異性引物對(duì)藏豬和約克夏豬分別進(jìn)行特異性片段擴(kuò)增，每個(gè)品種準(zhǔn)備10 個(gè)個(gè)體，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行混池，并由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用Chromas Pro

2.1.3 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，篩選SNPs 位點(diǎn)。利用PCR-RFLP 法擴(kuò)大檢測(cè)個(gè)體數(shù)量，統(tǒng)計(jì)分析基因型和基因頻率。使用限制性?xún)?nèi)切酶Kpnl（GGTAC^C）進(jìn)行酶切，酶切體系總體積為20 μL：Kpnl 1 μL，PCR 產(chǎn)物3.5 μL，NEB buffer 2 μL，ddH2O 13.5 μL，37℃酶切過(guò)夜。藏豬和約克夏豬各做40 個(gè)個(gè)體酶切。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 定量引物 本實(shí)驗(yàn)以RNF7基因?yàn)閮?nèi)參基因，RNF7和PGM1基因引物序列分別來(lái)自Wang 等[15]、于江宇等[16]（表2），由北京華大基因科技有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。

表2 豬RNF7、PGM1 基因RNA 引物序列

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA 為模板，每個(gè)個(gè)體設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，選擇SYBR Green Mix 定量PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)P171206）對(duì)PGM1基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的mRNA 表達(dá)水平。

樣品目的基因的表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算：

ΔCt（樣品）=Ct（樣品目的基因）–Ct（樣品內(nèi)參基因）

ΔCt（標(biāo)準(zhǔn)樣）=Ct（標(biāo)準(zhǔn)樣目的基因）–Ct（標(biāo)準(zhǔn)樣內(nèi)參基因）

ΔΔCt=ΔCt（樣品)–ΔCt（標(biāo)準(zhǔn)樣）

目的基因表達(dá)量=2-ΔΔCt

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用χ2檢驗(yàn)分析基因型分布和基因型頻率差異。利用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，SigmaPlot 10.0 軟件作圖，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著，P>0.05 無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型頻率和等位基因頻率分布 通過(guò)Sanger 測(cè)序發(fā)現(xiàn)藏豬PGM1基因在5' 側(cè)翼區(qū)1 636 bp 處有1 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，記為A-1636G（圖1）。利用PCR-RFLP法分別將藏豬和約克夏豬各40 個(gè)個(gè)體產(chǎn)物進(jìn)行酶切，共計(jì)產(chǎn)生3 種基因型即AA、AG、GG（圖2）。當(dāng)酶切的2 條片段長(zhǎng)度分別為840 bp 和165 bp 時(shí)，該基因型記為AA 型；當(dāng)酶切片段切成2 個(gè)片段，長(zhǎng)度分別為1 005 bp 和840 bp 時(shí)，該基因型記為雜合型AG 型；當(dāng)酶切片段切成一個(gè)片段，長(zhǎng)度為1 005 bp，該基因型記為GG 型。

圖1 A-1636G 突變測(cè)序峰圖

圖2 PGM1 基因酶切檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)酶切結(jié)果計(jì)算基因型頻率和基因頻率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，約克夏豬PGM1基因酶切位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型為AA；而藏豬的優(yōu)勢(shì)基因型為GG，約克夏豬的A 基因頻率明顯高于藏豬。經(jīng)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該酶切位點(diǎn)在藏豬及約克夏豬中均符合哈迪-溫伯格平衡定律，在2 個(gè)品種間呈極顯著差異。

表3 PGM1 基因PCR-RFLP 基因型頻率及卡方檢驗(yàn)

2.2PGM1基因mRNA 表達(dá)PGM1基因在藏豬肝臟中表達(dá)量極顯著高于約克夏豬，在藏豬背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量顯著高于約克夏豬，在藏豬背脂中表達(dá)量極顯著低于約克夏豬（圖3）。

圖3 PGM1 基因在肝臟、背最長(zhǎng)肌和背脂組織中的表達(dá)量

3 討 論

藏豬產(chǎn)業(yè)是我國(guó)西藏地區(qū)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)的重要組成部分，如何進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用藏豬這一重要種質(zhì)資源對(duì)西藏自治區(qū)的發(fā)展有積極作用。藏豬的生長(zhǎng)周期及脂肪的過(guò)度沉積直接影響了藏豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。PGM1是肌糖原分解代謝的關(guān)鍵酶，與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、脂肪沉積有著密切聯(lián)系[17]。Shang 等[18]通過(guò)組學(xué)數(shù)據(jù)的篩選及分析鑒定了PGM1基因在表達(dá)量高時(shí)對(duì)豬骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育具有抑制作用。

本研究通過(guò)對(duì)PGM1基因進(jìn)行SNPs 位點(diǎn)篩選分析發(fā)現(xiàn)，于5'側(cè)翼區(qū)存在A-1636G 這一突變位點(diǎn)，符合哈迪-溫伯格平衡定律，且引進(jìn)瘦肉型豬種約克夏豬的生長(zhǎng)速度快、瘦肉率高；藏豬生長(zhǎng)速度慢，瘦肉率偏低。藏豬和約克夏豬品種間該位點(diǎn)基因型頻率分布存在極顯著差異，由此初步判斷該SNP 位點(diǎn)AA 型為不利于脂肪沉積、生長(zhǎng)速度快的基因型，GG 型為有利于脂肪沉積、生長(zhǎng)速度慢的基因型。進(jìn)一步在mRNA 水平研究發(fā)現(xiàn)，在背最長(zhǎng)肌組織中，約克夏豬mRNA 表達(dá)量顯著低于藏豬；然而在脂肪組織中，約克夏豬mRNA 表達(dá)量極顯著高于藏豬，結(jié)果表明PGM1基因是增加肌內(nèi)脂肪（IMF）含量的有效基因。李慶崗[19]在對(duì)姜曲海瘦肉型豬早期發(fā)育規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)，肌肉中肌糖原的儲(chǔ)存數(shù)量隨著生長(zhǎng)發(fā)育高峰期的到來(lái)而升高。當(dāng)機(jī)體內(nèi)肌糖原過(guò)度消耗后，肝臟組織通過(guò)分解肝糖原補(bǔ)充血糖以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)，因此PGM1基因在肝臟和背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致符合機(jī)體發(fā)育機(jī)理，也由此推測(cè)PGM1基因在豬肝臟、背最長(zhǎng)肌組織中的高表達(dá)可能是通過(guò)促進(jìn)肌糖原的代謝而抑制了生長(zhǎng)發(fā)育，這與藏豬較約克夏豬生長(zhǎng)速度慢、體長(zhǎng)較短的生理特性相符。Meng 等[20]和Kim 等[21]分別通過(guò)對(duì)牛和豬的脂肪沉積、屠宰性能測(cè)定等方面進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，PGM1基因與脂肪生成、豬肉肉質(zhì)品質(zhì)等均有一定相關(guān)性。糖原的過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化為脂肪進(jìn)行儲(chǔ)能，因此，在背脂組織中，該基因的表達(dá)量表現(xiàn)為約克夏豬極顯著高于藏豬，即約克夏豬脂肪組織中該基因表達(dá)量較高，能夠進(jìn)一步促進(jìn)肌糖原的消耗，抑制脂肪沉積，這與約克夏豬為瘦肉型、藏豬為脂肪型豬種相符合。聯(lián)合SNPs 位點(diǎn)分析及RTqPCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏豬和約克夏豬的差異性在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中趨于一致，推測(cè)可能該突變位點(diǎn)與調(diào)控豬肌肉生長(zhǎng)、脂肪沉積性狀密切相關(guān)，本研究對(duì)后續(xù)開(kāi)展大群體藏豬選育工作提供了重要分子依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)PGM1基因DNA 和mRNA 水平研究發(fā)現(xiàn)，該基因5'側(cè)翼區(qū)存在1 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)A-1636G，其多態(tài)性與mRNA 表達(dá)差異性相關(guān)，即此位點(diǎn)可能是影響豬肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪沉積的功能位點(diǎn)，推測(cè)PGM1基因參與調(diào)控豬的肌肉生長(zhǎng)發(fā)育，起到負(fù)調(diào)控作用，該結(jié)論為進(jìn)一步探究豬生長(zhǎng)發(fā)育的具體調(diào)控機(jī)制提供重要依據(jù)。