王統(tǒng)苗，郭其新，白 皓,3，常國斌，陳國宏*

（1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.靖江市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇泰州 214500；3.揚州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇揚州 225009）

我國鴨產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史悠久，鴨遺傳資源豐富。然而，隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展、人口居住地的遷移和生態(tài)環(huán)境的變化，鴨種質(zhì)資源的丟失也在加快[1]。研究鴨遺傳資源群體結(jié)構(gòu)，可以為鴨遺傳資源保種工作提供科學(xué)有效的數(shù)據(jù)。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)及迅速發(fā)展可以更快速、有效取得大量的生物遺傳變異信息[2]。

基于全基因組重測序的群體遺傳進化分析是通過測序手段和生物信息分析技術(shù)相結(jié)合來探討生物群體的遺傳結(jié)構(gòu)，為育種、進化等研究工作提供了理論基礎(chǔ)。陳彬龍[3]利用全基因組重測序技術(shù)對不同地理位置的藏雞的群體結(jié)構(gòu)進行了分析，系統(tǒng)發(fā)育進化樹和主成分分析（PCA）結(jié)果顯示，6 個具有地理代表性的藏雞群體至少存在3 個明顯的分支，這些獨特的分布模式顯示藏雞可能與其他家雞一樣是多起源的；章雙杰等[4]利用全基因組測序技術(shù)對婁門鴨、昆山麻鴨、巢湖鴨和高郵鴨進行遺傳多樣性分析，通過群體系統(tǒng)進化樹分析和CNV 交集分析發(fā)現(xiàn)婁門鴨和昆山麻鴨為一類，巢湖鴨和高郵鴨為一類；Haile[5]利用全基因組重測序?qū)ΠＨ肀葋喓椭袊窖蛉后w的群體結(jié)構(gòu)進行分析，通過系統(tǒng)發(fā)育分析將山羊品種按照其起源地分成了4 個分支。本研究基于全基因組重測序，利用主成分分析、群體結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)發(fā)育樹分析研究了我國部分地方鴨遺傳資源的群體結(jié)構(gòu)，旨在為地方鴨遺傳資源開發(fā)利用和保種提供科學(xué)有效的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取國家級水禽基因庫（福建）鴨遺傳資源縉云麻鴨、中山麻鴨、山麻鴨、金定鴨、麻旺鴨、臺灣褐色菜鴨、連城白鴨、龍勝翠鴨、莆田黑鴨、莆田白鴨、攸縣麻鴨、三穗鴨、吉安紅毛鴨、紹興鴨和巢湖鴨300 日齡公母鴨各10 只，其遺傳資源基本信息如表1 所示，翅靜脈采血約3 mL 置于含有EDTA 抗凝劑的采血管中，混合均勻之后-20℃保存，用于后續(xù)實驗。

表1 本研究所用鴨遺傳資源的基本信息

1.2 全基因組重測序

1.2.1 文庫構(gòu)建 文庫構(gòu)建流程如圖1，檢驗合格的DNA 樣品被Covaris 超聲波破碎儀隨機打斷成350 bp長度的片段。DNA 片段經(jīng)末端修復(fù)、添加ployA、添加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個文庫制備。所構(gòu)建的文庫通過Illumina 測序儀進行測序。構(gòu)建完文庫后，先使用Qubit 2.0 進行初步定量，將文庫稀釋至1 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 檢測文庫的插入片段大小，一旦插入片段大小符合預(yù)期，使用Q-PCR 確定文庫的有效濃度，準(zhǔn)確定量以確保文庫質(zhì)量（有效文庫濃度>2 nM）。

圖1 文庫構(gòu)建流程

1.2.2 PCA PCA 是一種純數(shù)學(xué)的操作方法，它允許通過對相關(guān)變量進行線性轉(zhuǎn)換來選出較少個數(shù)的重要變量，實現(xiàn)了使用少量變量就可以對復(fù)雜的樣本數(shù)據(jù)進行分類[6]。在遺傳學(xué)當(dāng)中，PCA 主要用于聚類分析以對不同群體進行分類。

1.2.3 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 使用MEGA 軟件包、鄰近法（Neighbor-Joining Methods）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。鄰近法是依據(jù)最小進化原理，在20 世紀(jì)90 年代提出的一種有效的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建方法[7]，bootstrap 運行1 000 次。

1.2.4 群體結(jié)構(gòu)分析 群體結(jié)構(gòu)分析能夠?qū)ο到y(tǒng)發(fā)育進化樹、PCA 分析的群體關(guān)系結(jié)果進行驗證，使用Admixture 軟件進行群體結(jié)構(gòu)的計算，每個K 值重復(fù)5次，計算完成后使用pophelper 軟件計算?K 值并對多次重復(fù)的結(jié)果進行合并，根據(jù)?K 確定最優(yōu)K 值，合并后的結(jié)果使用barplot 展示其群體結(jié)構(gòu)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 檢測結(jié)果 檢測所有基因組DNA 樣品的質(zhì)量、濃度和純度，以滿足全基因組重測序的要求。首先，瓊脂糖凝膠電泳用于分析DNA 降解程度和RNA污染的程度；其次，Nanodrop 檢測DNA 的純度（OD260/280比值）；最后，Qubit 準(zhǔn)確定量OD 值在1.8 和2.0 之間的DNA 濃度，用超過1.5 μg 以上的DNA 樣品構(gòu)建文庫。本研究對提取的樣本DNA 濃度和純度檢測結(jié)果表明，所有DNA 均符合樣品重測序的要求，可以進行后續(xù)實驗?；蚪MDNA 檢測結(jié)果見圖2。

圖2 金定鴨基因組DNA 1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 群體結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 PCA 分析 PCA 分析結(jié)果如圖3 所示，可見15個鴨遺傳資源分為7 個集簇，莆田白鴨、褐色菜鴨、連城白鴨和龍勝翠鴨都單獨聚為一類，中山麻鴨和巢湖鴨聚為一類，距離較近；吉安紅毛鴨、三穗鴨和紹興鴨聚為一類；金定鴨、麻旺鴨、山麻鴨、攸縣麻鴨聚為一類，莆田黑鴨和縉云麻鴨聚為一類，遺傳距離較近。

圖3 PCA 分析

2.2.2 系統(tǒng)進化樹分析 如圖4 所示，15 個鴨遺傳資源除了中山麻鴨其中一個個體和巢湖鴨聚為一類，其他13 個品種均獨立分成一類。其中褐色菜鴨單獨聚為一類；攸縣麻鴨、山麻鴨和縉云麻鴨聚為一類；連城白鴨、莆田白鴨和莆田黑鴨聚為一類；三穗鴨和金定鴨聚為一類再與紹興鴨、吉安紅毛鴨、龍勝翠鴨、中山麻鴨、巢湖鴨聚為一大類；麻旺鴨單獨聚為一類。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.2.3 群體結(jié)構(gòu)分析 群體結(jié)構(gòu)是群體遺傳分析的重要內(nèi)容。本研究對300 個樣本進行Admixture 檢測分析。通過假設(shè)群體可以分成K=1～n 個亞群，圖5 表示本研究假定的群體個數(shù)從2 到9。當(dāng)K=2 時，莆田白鴨首先分離出來，K=4 時，連城白鴨分離出來，K=5 時，褐色菜鴨從15 個鴨遺傳資源分離出來，K=6 時，中山麻鴨分離出來，K=7 時，吉安紅毛鴨和龍勝翠鴨分離出來，K=8 時，巢湖鴨分離出來，K=9 時，有7 個群體能分離出來。

圖5 群體結(jié)構(gòu)圖

3 討 論

3.1 15 個鴨遺傳資源群體結(jié)構(gòu)關(guān)系分析 PCA 的中心思想是“降維”，是由Hotelling[8]于1933 年首先提出的。通過PCA 發(fā)現(xiàn)，吉安紅毛鴨、三穗鴨和紹興鴨聚為一類，金定鴨、麻旺鴨、紹興鴨、山麻鴨、攸縣麻鴨聚為一類，莆田黑鴨和縉云麻鴨聚為一類，遺傳距離較近，這與群體結(jié)構(gòu)圖的結(jié)果相似，通過系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果發(fā)現(xiàn)麻旺鴨單獨聚為一類，攸縣麻鴨、山麻鴨和縉云麻鴨聚為一類；連城白鴨、莆田白鴨和莆田黑鴨聚為一類，這與張揚等[9]利用微衛(wèi)星標(biāo)記進行聚類的研究結(jié)果一致，這3個鴨遺傳資源都是福建地方鴨資源，遺傳距離較近；三穗鴨和金定鴨聚為一類；紹興鴨、吉安紅毛鴨、龍勝翠鴨、中山麻鴨、巢湖鴨聚為一大類，褐色菜鴨聚為一類，這與PCA 和群體結(jié)構(gòu)分析有相似的地方，如褐色菜鴨在3 種方法中都是單獨聚為一類的。

3.2 15 個鴨遺傳資源的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系 本研究通過鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，來研究15 個鴨遺傳資源的遺傳距離。有研究表明，鄰近結(jié)合法優(yōu)于非加權(quán)組對算術(shù)平均法，它是最有效的基于距離數(shù)據(jù)重建系統(tǒng)發(fā)生樹的方法之一[10]。系統(tǒng)發(fā)育進化樹研究發(fā)現(xiàn)只有中山麻鴨其中一個個體與巢湖鴨聚為一類，其他13 個遺傳資源均獨立分布。中山麻鴨原產(chǎn)地為廣東省中山縣，而巢湖鴨原產(chǎn)地為安徽省廬江縣，2 個品種的地理遺傳距離相隔較遠，但是聚為一類可能是它們歷史上曾有過基因交流。攸縣麻鴨先與山麻鴨聚為一類，然后和縉云麻鴨聚為一類；山麻鴨和縉云麻鴨都是福建地方鴨品種，地理距離較近，親緣關(guān)系近，所以聚為一類，而攸縣麻鴨和山麻鴨聚為一類，可能是它們都是蛋鴨品種，且歷史上血緣關(guān)系較近；莆田白鴨和莆田黑鴨聚為一類，它們都是福建地方鴨遺傳資源，且是同一個品種的兩個品系；浙江省的蛋用型品種紹興鴨、江西省的兼用型鴨品種吉安紅毛鴨、廣西龍勝的兼用型鴨品種龍勝翠鴨、廣東省蛋用型鴨品種中山麻鴨和安徽省巢湖市的巢湖鴨聚為一類，但是除龍勝翠鴨和中山麻鴨距離較近，其他的鴨遺傳資源均相隔較遠，他們雖然聚為一大類，但品種間差異也較大，各具特色，具有重要的保種價值。褐色菜鴨單獨聚為一類，它是臺灣地方鴨品種，首先地理距離與其他鴨遺傳資源相隔較遠，然后因為兩地隔海，可能沒有發(fā)生過基因交流，所以單獨聚為一類，也間接表明了國家級水禽基因庫（福建）的保種效果較好，依然為純種資源。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過國家級水禽基因庫（福建）的保種，每個鴨遺傳資源的個體和其他品種沒有過多的基因交流，雖然有的品種間遺傳距離較近，但依然保持純種，說明設(shè)立基因庫進行保種繁育是很有必要的。