楊 娟, 林佩婷, 賴瀅妮, 吳敏文, 劉新銳, 江玉姬,

(1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福州市農業(yè)農村局，福建 福州 350000；3.福建農林大學菌物研究中心，福建 福州 350002)

大型真菌的次生代謝產物豐富多樣，部分具有顯著的生物活性，是開發(fā)新藥或特效藥的重要來源[1].其中，真菌多糖廣泛存在于真菌細胞壁中，且具有良好的生物活性，已成為當今醫(yī)藥和食品工業(yè)領域共同關注的焦點[2].

硫磺菌(Laetiporussulphureus)又名硫磺多孔菌，是一種珍稀藥食兼用的大型真菌[3-4].硫磺菌含有多糖、三萜等活性成分[5].研究表明，硫磺菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等功效[6]；閆梅霞等[7]發(fā)現(xiàn)，硫磺菌菌絲體粗多糖對小鼠Lewis肺癌具有一定的體內抑制作用；王娟等[8]發(fā)現(xiàn)，硫磺菌發(fā)酵液產物有抗菌作用；胡亞平等[3]研究了硫磺菌多糖的分離純化方法，且發(fā)現(xiàn)純化后的硫磺菌多糖對胃癌有一定抑制作用.

多糖主要以熱水、微波、有機溶劑及超聲輔助等方法提取[9-11].其中，超聲輔助提取是利用超聲引起的空化效應，使原料的微顆粒發(fā)生碰撞，增加溶劑的提取面積，從而釋放出活性成分[12].超聲波提取技術具有操作簡便、提取條件溫和、提取物結構不被破壞等優(yōu)點[13].此外，各提取方法可以通過優(yōu)化工藝參數(shù)達到提高得率的目的.常見的優(yōu)化方法有正交設計法和響應面法:正交設計有局限性，選取的代表點并不能完全反映整體情況，且獲得的最佳結果只是測試水平的其中一種組合；而響應面法將數(shù)據(jù)進行多項式擬合后，以圖形表達函數(shù)關系，使結果簡單明了，易于發(fā)現(xiàn)各影響因素與得率的交互關系[14-16].目前，有關硫磺菌子實體多糖(polysaccharides from the fruiting body ofL.sulphureus, LSP)提取條件的優(yōu)化鮮見報道.本試驗以超聲輔助法提取LSP，以響應面優(yōu)化提取工藝，以期為后續(xù)的LSP結構鑒定和免疫活性的相關研究奠定基礎，同時為相關產品的進一步開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

硫磺菌子實體購買于黑龍江省雙鴨山繞河供應商.

DPPH標準品購買于北京索萊寶科技有限公司；乙醇、鄰苯三酚、Tris-HCl緩沖溶液、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、過氧化氫、磷酸鹽緩沖溶液、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、抗壞血酸(分析純)購買于國藥集團化學試劑有限公司.

RE52-99旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；離心機，Thermo Scientific ST40；KQ-500VDE超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；UV-2601紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 LSP提取 硫磺菌子實體粉末制備：將硫磺菌子實體在70 ℃烘箱中烘2 h，用植物粉碎機粉碎后，過80目篩，備用.

LSP的提取參照侯笑笑等[17]的水提醇沉法，并稍作修改.精確稱取10 g硫磺菌子實體粉末，超聲波輔助提取2次(料液比1∶20、提取時間50 min、提取溫度50 ℃ 超聲頻率55 kHz)，合并提取液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至原來體積的1/3，加入5倍體積無水乙醇，4 ℃條件下靜置12 h，以4 000 r·min-1的轉速離心10 min，棄除上清液；采用Sevage法除蛋白[18]，再用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，去離子水進行透析，真空冷凍干燥后即得到LSP.

1.2.2 單因素試驗 稱取5份10 g硫磺菌子實體粉末,依次放入1～5編號的錐形瓶中，考察料液比(1∶10、1∶15 、1∶20、1∶25、1∶30)、提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)、提取時間(30、40、50、60、70 min)對LSP得率的影響，每組試驗至少重復3次，取平均值.

1.2.3 優(yōu)化試驗 根據(jù)Box-Behnken的中心組合方法，綜合單因素試驗結果，以料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)作為考察因素設計試驗方案，每個因素設3個試驗水平(表1).

表1 Box-Behnken中心試驗因素水平Table 1 Levels of variables tested in Box-Behnken design

1.2.4 LSP得率的計算 LSP得率的計算公式[19]:LSP得率/%=LSP質量/硫磺菌粉末質量×100.

1.2.5 LSP體外抗氧化活性測定 (1)LSP對DPPH自由基的清除率:參照Tang et al[20]的方法略作修改，分別配制不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)樣品溶液.取上清液1 mL，分別加0.1 mmol·L-1DPPH(1 mL)充分混勻，避光靜置30 min，于517 nm波長下測定光密度，記為Di值；同一操作條件下，用1 mL 95%乙醇代替DPPH溶液與1 mL樣品混合均勻為樣品參比液，記為Dj值； 1 mL DPPH溶液與1 mL 95%乙醇混合液為空白對照，記為D0值.Vc為陽性對照，每組至少重復3次.按以下公式計算LSP對DPPH自由基的清除率.

DPPH自由基清除率/%=[1-(Di-Dj)/D0]×100

(1)

式中：Di為樣品管的光密度，Dj為樣品參比液的光密度，D0為空白對照的光密度.

(2)LSP對羥基(·OH)自由基的清除率:參考Liu et al[21]的方法稍作修改，配制不同濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)樣品溶液.在試管中分別加入0.3 mL水楊酸鈉(20 mmol·L-1)、1.0 mL硫酸亞鐵(1.5 mmol·L-1)、1.0 mL不同濃度的樣品溶液和0.7 mL H2O2(6 mmol·L-1)，迅速混勻，37 ℃避光反應1 h，于 510 nm波長下測定其光密度，記為Di值；同一操作條件下，以55%乙醇代替水楊酸鈉溶液為樣品參比液，記為Dj值；以55%乙醇代替樣品為空白對照，記為D0值.以Vc為陽性對照，每組至少重復3次.按照以下公式計算LSP對·OH自由基的清除率.

·OH自由基清除率/%=[1-(Di-Dj)/D0]×100

(2)

式中：Di為樣品管的光密度，Dj為樣品參比液的光密度，D0為空白對照的光密度.

(3)

式中：Di為樣品管的光密度，D0為空白對照的光密度.

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件對單因素試驗結果和抗氧化活性結果作圖，用Design Expert 8.0軟件對優(yōu)化試驗結果作響應面圖和等高線圖，用SPSS軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著,半最大效應濃度(EC50)通過Graphpad 7.0軟件計算.

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對LSP得率的影響 由圖1A可知：當料液比在1∶10～1∶20之間時，隨著料液比的增大，LSP的得率逐漸增大；當料液比為1∶20時(提取溫度50 ℃、提取時間50 min)，LSP得率達到最大值(8.42%)，顯著高于其他料液比的LSP得率(P<0.05)；當料液比大于1∶20時，LSP得率顯著降低(P<0.05).因此，選取料液比為1∶20.

2.1.2 提取時間對LSP得率的影響 設定料液比1∶20、提取溫度50 ℃，測定提取時間對LSP得率的影響.由圖1B可知：當提取時間為30～50 min時，隨著時間延長，LSP得率逐漸增大；當提取時間為50 min時，LSP得率達到最大值(8.51%)；當提取時間大于50 min時，LSP得率顯著下降.因此，選取提取時間為50 min.

2.1.3 提取溫度對LSP得率的影響 設定料液比1∶20、提取時間50 min，測定提取溫度對LSP得率的影響.如圖1C所示：當提取溫度為30～50 ℃時，隨著溫度升高，LSP得率逐漸增大；當提取溫度為50 ℃時，LSP得率達到最大值(8.53%)；當溫度大于50 ℃時，LSP得率顯著下降.因此，選取50 ℃為適宜提取溫度.

A.料液比；B.提取時間；C.提取溫度. 圖中不同字母表示在0.05水平上差異顯著，相同字母表示差異不顯著.圖1 LSP提取工藝的單因素試驗結果Fig.1 Single factor experiment results of LSP extraction

2.2 優(yōu)化試驗結果

采用Design Expert對BBD(Box-Behnken)試驗結果(表2)進行響應面二次回歸擬合分析，得到回歸方程：Y=8.2+0.13A+0.2B+0.24C-0.18AB+0.051AC-0.12BC-0.58A2-0.43B2-0.57C2，方差分析見表3.

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 Design matrix and results of Box-Behnken design experiment

表3 二次響應面回歸模型方差分析1)Table 3 Variance analysis of quadratic response surface regression model

由圖2可知，響應面均向下開口且曲面較陡，隨著各因素的水平逐漸提高，LSP得率先增加后減少，均出現(xiàn)LSP得率的最大值.料液比與提取時間、料液比與提取溫度、提取時間與提取溫度的等高線均呈橢圓形，說明各因素交互作用對LSP得率的影響顯著，這與表3中結果相符合.

圖2 各因素交互作用響應面圖和等高線圖Fig.2 Interactive response surface and contour map of various factors

應用分析軟件Design Expert 8.0，由RSM(響應曲面法)預測最優(yōu)值，給出優(yōu)化后的LSP提取條件：料液比為1∶20.46，提取時間為51.89 min，提取溫度為51.95 ℃，預測的LSP得率為8.24%.

為便于操作，將最佳提取條件設置為料液比1∶20、提取時間50 min、提取溫度50 ℃進行驗證，重復3次，LSP平均得率為8.12%.與理論預測值相比，相對誤差小于1%，說明上述模型能較好地反映LSP得率與其影響因素之間的關系.

2.3 LSP體外抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力 由圖3A可知，隨著LSP質量濃度增大，其對DPPH自由基的清除能力增強，LSP質量濃度為2.5 mg·mL-1時的清除率達到95.05%.這說明LSP對DPPH自由基有一定的清除能力，但清除率略低于Vc. LSP清除DPPH自由基率的EC50為1.26 mg·mL-1.

2.3.2 清除·OH自由基能力 由圖3B可知，LSP對·OH自由基具有一定的清除作用，且清除率隨LSP質量濃度的增大而提高，LSP質量濃度為2.5 mg·mL-1時的清除率達到98.16%.LSP清除·OH自由基的EC50為3.67 mg·mL-1.

A.DPPH自由基清除率；B.·OH自由基清除率；自由基清除率.圖3 LSP的抗氧化活性Fig.3 Antioxidant activity of LSP

3 討論與結論

本研究基于實驗室條件對LSP的提取工藝進行了優(yōu)化，但如果將其應用于大規(guī)模生產，則可能存在局限性.在工業(yè)生產中，應綜合考慮提取條件的適用性和各種因素的合理性.此外，LSP得率與各因素之間的具體作用關系尚不清楚，后續(xù)將對此進行深入研究，以為硫磺菌資源的高效利用提供更多理論依據(jù).