樊東哲,張曉斌,牟淑敏

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病診療中心,濟(jì)南 250000;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,濟(jì)南 250000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致終末期腎疾病的主要原因,其發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重危害人類的健康[1]。 在中國(guó),DN 已經(jīng)成為我國(guó)公共衛(wèi)生的主要問(wèn)題之一,給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)。 腎小球肥大增生、基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)增多是DN 的病理特征,隨著DN 的進(jìn)展,逐漸發(fā)展為腎小球硬化、間質(zhì)纖維化,導(dǎo)致腎功能的喪失。 DN 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全闡明,并且目前尚無(wú)有效的治療方法。

目前隨著研究的深入,微小RNA(miRNAs)被發(fā)現(xiàn)對(duì)包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展均有著重要的調(diào)控作用[2-3]。 miR-122 定位于人染色體18q21.31 上,在肝中高表達(dá),與精子發(fā)生、肝細(xì)胞發(fā)育、脂質(zhì)代謝、膽固醇合成以及惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[4]。 近期研究發(fā)現(xiàn) DN 患者血清miR-122 水平明顯升高,并且血清miR-122 水平與蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率顯著相關(guān),提示miR-122 可能參與了DN 的發(fā)生進(jìn)展,但具體作用機(jī)制尚不明確[5]。 因此,本研究中,我們通過(guò)建立 DN 小鼠模型,觀察miR-122 在DN 小鼠腎組織的表達(dá)變化,并進(jìn)一步觀察沉默miR-122 對(duì)DN 小鼠腎組織的影響及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠50 只,鼠齡8~9 周,體重(24.5±1.6)g,購(gòu)自山東斯科貝斯生物科技公司[SCXK(魯)2016-0001],在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境[SYXK(魯)2018-0015]常規(guī)飼養(yǎng)。 本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC2019081501),所有操作均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)“3R”原則。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó) Sigma 公司,批號(hào):S0130);TRIzol 試劑(美國(guó) Invitrogen 公司,批號(hào):15596018);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒(北京全式金生物公司,批號(hào):AH341-01、AQ321-01);過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色試劑盒(北京索萊寶公司,批號(hào):G1280);antagomir-122、antagomir-NC(上海吉瑪制藥公司);谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物公司,批號(hào):A005-1-1、A003-1-2、A001-3-1);一抗 Sirt1、fibronectin、GAPDH 抗體(英國(guó) Abcam 公司,批號(hào):ab189494、ab268021、ab8245);一抗α-SMA、HPR 標(biāo)記的二抗 (武漢博士德公司,批號(hào):BM0002、BA1050)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DN 模型制備及動(dòng)物分組

50 只C57BL/6 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)選取40 只小鼠采用STZ 腹腔注射聯(lián)合高糖高脂飲食建立DN 小鼠模型,剩余10 只小鼠作為正常對(duì)照組。 建立DN 模型的小鼠首先給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周,給予STZ(30 mg/kg)單次腹腔注射一次后,繼續(xù)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4 周后,選取空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L,24 h 尿蛋白定量≥20 mg 的小鼠作為DN 模型小鼠[6-7],最終成功造模30 只。正常對(duì)照組給予正常飼料常規(guī)喂養(yǎng),給予腹腔單次注射等量的檸檬酸緩沖液。 將30 只DN 小鼠隨機(jī)分成分為模型組、antagomir-NC 組、antagomir-122組,每組 10 只。 antagomir-122 組和 antagomir-NC 組造模后,每7 d 分別給予尾靜脈注射antagomir-122(30 mg/kg)和antagomir-NC(30 mg/kg)進(jìn)行干預(yù),模型組和正常對(duì)照組給予尾靜脈注射等量生理鹽水代替。 干預(yù)8 周后,取得小鼠血、24 h 尿液后處死小鼠,獲取腎標(biāo)本。

1.3.2 腎功能檢測(cè)

取小鼠血,3000 r/min 離心15 min 取得上層血清,使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平;取小鼠24 h 尿液,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠24 h 尿蛋白定量。

1.3.3 組織病理學(xué)分析

小鼠處死后,取出左腎,應(yīng)用10%中性甲醛固定,經(jīng)石蠟包埋后,連續(xù)切4 μm 切片,應(yīng)用PAS 試劑盒進(jìn)行染色,光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變,每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)不同視野,參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行腎小球硬化評(píng)分[8]。

1.3.4 qRT-PCR 檢測(cè)腎組織中 miR-122 的表達(dá)水平

取小鼠部分右腎皮質(zhì)組織,TRIzol 試劑提腎皮質(zhì)組織總RNA,鑒定總RNA 濃度和純度后,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 按照qRT-PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)配置擴(kuò)增反應(yīng)體系,miR-122 引物序列,正向:5’-GGGTGGAGTGTGACAATGG-3’,反向:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’,以 U6 作為內(nèi)參照,引物序列, 正 向: 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA AT-3’,反向:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。 反應(yīng)條件:95℃ 30 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s,共40 個(gè)循環(huán)。 miR-122 表達(dá)水平用 2-△△Ct法表示。

1.3.5 Western blot 檢測(cè)腎組織 Sirt1、α-SMA、fibronectin 蛋白的表達(dá)水平

小鼠處死后,取部分右腎皮質(zhì)組織,RIPA 裂解液裂解組織,提取組織總蛋白,Bradford 法測(cè)得總蛋白濃度,取得 30 μg 蛋白樣本,行 10% SDS-PAGE 凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF 膜,室內(nèi)封膜1 h,分別加入一抗Sirt1(稀釋度 1 ∶1000)、α-SMA(稀釋度 1 ∶2000)、fibronectin(稀釋度 1 ∶1000)和 GAPDH(稀釋度 1 ∶5000)抗體,4℃孵育過(guò)夜,加入二抗后,37℃孵育1 h,曝光,顯影,最后使用Image-J 軟件分析各組蛋白的條帶灰度值。

1.3.6 氧化應(yīng)激水平檢測(cè)

小鼠處死后,取部分右腎皮質(zhì)組織,裂解勻漿后測(cè)定蛋白濃度,分別應(yīng)用 GSH-Px、MDA、SOD 試劑盒參照說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)各組小鼠腎組織GSHPx、MDA、SOD 的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎功能的比較

與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠血清Cr、BUN水平及24 h 尿蛋白定量水平均明顯增高(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠血清 Cr、BUN 水平及 24 h尿蛋白定量水平均明顯降低(P<0.05)。 見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腎功能的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 1 Comparison of renal function in each group

2.2 各組小鼠腎小球硬化的比較

與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠腎小球硬化評(píng)分明顯增高(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與antagomir-NC組比較,antagomir-122 組小鼠腎小球硬化評(píng)分明顯降低(P<0.05)。 見(jiàn)圖 2。

圖2 各組小鼠腎小球硬化的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 2 Comparison of glomerulosclerosis in each group

2.3 各組小鼠腎組織miR-122 和Sirt1 蛋白表達(dá)的比較

與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織miR-122 的表達(dá)水平明顯增高(P<0.05),而Sirt1 蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織miR-122 的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),而Sirt1蛋白的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。 見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠腎組織miR-122 和Sirt1 蛋白表達(dá)的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 3 Comparison of miR-122 and Sirt1 protein expression in renal tissue of mice in each group

2.4 各組小鼠腎組織氧化應(yīng)激水平的比較

與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織MDA水平明顯增高(P<0.05),而GSH-Px 和SOD 水平明顯降低(P<0.05);模型組與antagomir-NC 比較,各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織MDA 水平明顯降低(P<0.05),而GSH-Px 和SOD 水平均明顯升高(P<0.05)。 見(jiàn)圖 4。

圖4 各組小鼠腎組織氧化應(yīng)激水平的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 4 Comparison of oxidative stress levels in kidney of mice in each group

2.5 各組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達(dá)水平的比較

與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達(dá)水平均明顯增高(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織 α-SMA、fibronectin蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。 見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達(dá)水平的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 5 Comparison of the expression levels of α-SMA and fibronectin in renal tissues of mice in each group

3 討論

DN 是糖尿病患者晚期的一個(gè)主要并發(fā)癥,以腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化為主要病理特點(diǎn),據(jù)研究報(bào)道,至少大約1/3 的1 型糖尿病和1/2 的2型糖尿病會(huì)出現(xiàn)不同程度的腎功能不全,是終末期腎疾病的主要原因[9]。 DN 發(fā)生發(fā)展進(jìn)展復(fù)雜,涉及多種基因的異常表達(dá)和多種信號(hào)通路的異常改變,至今尚不完全明確[10]。 研究證據(jù)表明,miR-31[11]、miR-124a[12]、miR-320a[13]等許多 miRNA 在DN 中異常表達(dá),這些異常表達(dá)的miRNAs 及其靶基因在DN 發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[14],為DN 的靶向治療提供了新的研究方向。 文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-122 在DN 患者血清中表達(dá)升高,并且患者腎功能密切相關(guān)[5],但具體作用機(jī)制尚不清楚。 為了研究miR-122 在DN 中可能的作用機(jī)制,本研究采用目前國(guó)內(nèi)外常用的STZ 腹腔注射聯(lián)合高糖高脂飲食的方法建立小鼠DN 模型,我們發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腎組織中miR-122 表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高。 我們通過(guò)給予小鼠尾靜脈注射antagomir-122,抑制DN 小鼠腎組織中miR-122 的表達(dá),結(jié)果顯示,隨著DN 小鼠腎組織中miR-122 表達(dá)的降低,antagomir-122 組小鼠腎小球硬化評(píng)分、血清 Cr、BUN 水平、24 h 尿蛋白定量水平明顯降低,提示沉默miR-122 表達(dá)能夠?qū)N 小鼠腎組織起到明顯的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是病理狀態(tài)下機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)被抑制,過(guò)量的ROS 聚積而無(wú)法及時(shí)清除,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)變性,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、腎小球肥大硬化和腎纖維化。 氧化應(yīng)激是DN 的發(fā)病發(fā)展的重要機(jī)制之一,抗氧化治療在DN 的防治中有著廣泛的前景[15-16]。 MDA 是組織細(xì)胞過(guò)氧化損傷過(guò)程中的中間產(chǎn)物,可以反映出細(xì)胞的氧化損傷程度,MDA 水平檢測(cè)可以有效反應(yīng)機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[17]。 GSH-Px 和SOD 是氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要抗氧化酶,其水平可以反應(yīng)出細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力[18]。 研究中我們也發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,模型組腎組織MDA 水平明顯增高,GSH-Px 和SOD水平明顯降低,提示氧化應(yīng)激在DN 發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。 進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn),與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織MDA 水平明顯降低,腎組織GSH-Px 和SOD 水平明顯升高,提示沉默miR-122 表達(dá)能夠減輕DN 小鼠腎組織的氧化應(yīng)激從而起到保護(hù)作用。 α-SMA、fibronectin 蛋白異常增高是反應(yīng)腎纖維化程度的標(biāo)志性蛋白[19],研究中我們發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達(dá)水平均明顯增高,提示DN 小鼠腎組織存在明顯纖維化。 進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn),與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達(dá)水平均明顯降低,提示沉默miR-122 表達(dá)能夠減輕DN 小鼠腎組織的纖維化。

Sirt1 是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?屬于Sirtunis 家族之一,在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)較高[20]。 Sirt1 在DN 發(fā)生進(jìn)展中作用的研究較多,Sirt1 能夠通過(guò)抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、抗炎及調(diào)控自噬從而對(duì)DN 的產(chǎn)生保護(hù)作用已經(jīng)得到公認(rèn)[21]。 本研究中我們也發(fā)現(xiàn),與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠腎組織Sirt1 蛋白表達(dá)水平明顯降低。 近期研究發(fā)現(xiàn),miR-122 能夠靶向調(diào)控Sirt1 參與機(jī)體多種重要的生理活動(dòng)[22-23],為了探討miR-122 對(duì)DN 影響是否與Sirt1 有關(guān),我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織Sirt1 蛋白表達(dá)水平明顯升高,提示沉默miR-122 表達(dá)對(duì)DN 小鼠腎組織的保護(hù)作用可能與其對(duì)Sirt1 的調(diào)控有關(guān)。

總之,miR-122 在DN 小鼠腎組織中表達(dá)升高。沉默miR-122 能夠通過(guò)抗氧化應(yīng)激和纖維化對(duì)DN小鼠腎組織起到明顯的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與其調(diào)控Sirt1 有關(guān),為DN 的治療提供新的研究方向。