劉振方,孟祥彩,武 玉,劉曉飛,米永鵬

(1.石家莊市中醫(yī)院普外科,石家莊 050051;2.秦皇島市第一醫(yī)院普外科,河北秦皇島 066000)

結(jié)腸癌是常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著患者的身心健康。 國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的《全球癌癥報告》數(shù)據(jù)顯示,2018 年結(jié)腸癌發(fā)病率全球第三,而死亡率高居第二[1]。 在我國,結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢并趨于年輕化[2]。 因此,如何有效預(yù)防和治療結(jié)腸癌是臨床需要解決的迫切問題。 目前,結(jié)腸癌的治療仍以傳統(tǒng)手術(shù)、化學(xué)治療和放射治療為主[3]。 隨著醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,新興的生物治療也逐漸應(yīng)用于臨床。 但仍有部分結(jié)腸癌患者治療效果不佳。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類高度保守的功能性非編碼RNA。 miRNA 在細(xì)胞分化、組織形成及個體發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]。 同時,miRNA 也與眾多疾病密切相關(guān),如在腫瘤[5]、糖尿病[6]、阿爾茨海默癥等[7]。 miR-574-3p 是 miRNA 家族中的一員,研究顯示,miR-574-3p 參與胃癌[8]、乳腺癌[9]及肝癌[10]的惡性進(jìn)展。 最近的研究報道,miR-574-3p可靶向抑制結(jié)腸癌SW480 和HT29 細(xì)胞周期蛋白D2 表達(dá),從而抑制細(xì)胞生長和遷移[11]。 提示,miR-574-3p 可能影響結(jié)腸癌細(xì)胞周期進(jìn)程。 但 miR-574-3p 在結(jié)腸癌中的作用還不是十分清楚,有待于進(jìn)一步研究。 本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 為研究對象,通過轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic 外源性過表達(dá)miR-574-3p 水平,觀察后者對細(xì)胞增殖的影響,并對相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640 培養(yǎng)基(批號:8120357)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(批號:2132094P)和磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer solution,PBS)(批號:AE29561133),購自美國 Gibco 公司;CCK-8 試劑盒(批號:D03062005),購自美國 MedChemExpress 公司;細(xì)胞周期染色分析試劑盒(批號:20-15183),購自美國Abbkine 公司;miR-574-3p mimic 轉(zhuǎn)染試劑盒(批號:20191225),購自上海艾博思公司;RNAiso for Small RNA 試劑盒(批號:9753A)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(批號:AK4102)和Mir-X miRNA qRTPCR TB Green?Kit(批號:638314) 購自大連TaKaRa 公司;細(xì)胞裂解液(批號:20191029)和結(jié)晶紫染色液(批號:20191025)購自北京索萊寶公司;CyclinA1 抗體(批號:9)、CDK2 抗體(批號:8)、PCNA 抗體(批號:3)、Cdc25A 抗體(批號:12)及P53 抗體(批號:8)及 GAPDH 抗體(批號:21),購自美國 Cell Signaling Technology 公司;羊抗兔 IgGHRP 抗體(批號:abs132004-06),購自上海愛必信公司。

Multiskan Sky 全波長酶標(biāo)儀和QuantStudio 3 型實(shí)時熒光定量PCR 系統(tǒng),美國Thermo Fisher 公司產(chǎn)品;TS100 倒置顯微鏡,日本尼康公司產(chǎn)品;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽及轉(zhuǎn)印夾,美國Bio-Rad 產(chǎn)品;Accuri C6 Plus 流式細(xì)胞儀,美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116 細(xì)胞以 RPMI 1640 培養(yǎng)基(含 10%FBS 和1%青鏈霉素)置于 37℃、5% CO2、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic 以上調(diào)細(xì)胞 miR-574-3p 表達(dá)

分組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic 和陰性對照分別作為miR-574-3p mimic 組和陰性對照組,同時以正常HCT116 細(xì)胞作為空白對照組。 轉(zhuǎn)染:將對數(shù)期細(xì)胞以每孔3×105個接種于6 孔板中,培養(yǎng)過夜。 分別向含有2 ng miR-574-3p mimic 和陰性對照的管中加入1 mL RNase-free 水配制成母液。 各取兩種母液 2 μL 加入 98 μL 無血清 RPMI 1640 培養(yǎng)基中。 同時,將 2 μL Lipofectamine 加入 98 μL 無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基中。 靜置5 min 后將上述兩種稀釋液混合以形成復(fù)合物,室溫保溫20 min。 取出細(xì)胞,棄去舊培養(yǎng)基,加入1 mL 無血清RPMI 1640培養(yǎng)基。 將兩種復(fù)合物分別加入細(xì)胞中,將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 以RT-qPCR 檢測細(xì)胞miR-574-3p 表達(dá)水平。

1.3.3 RT-qPCR 檢測細(xì)胞miR-574-3p 表達(dá)水平

收集miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細(xì)胞,采用RNAiso for Small RNA 試劑盒提取細(xì)胞總RNA,檢測總RNA 濃度并將各組濃度調(diào)整一致。 各取 1 μg RNA 以 PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,將 cDNA 稀釋備用。 同時,將miR-574-3p 和內(nèi)參U6 的特異性引物稀釋備用。 利用 Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green ? Kit 在QuantStudio 3 型實(shí)時熒光定量PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增,每組設(shè)置 3 個重復(fù)孔。 2-△△CT法計(jì)算 miR-574-3p 的相對表達(dá)水平。

1.3.4 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活力

取對數(shù)期miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細(xì)胞以每孔9×103個/孔接種于96 孔板中,分別培養(yǎng) 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h 進(jìn)行檢測。 檢測時每孔加入10 μL CCK-8 溶液,培養(yǎng)箱中孵育4 h。 使用酶標(biāo)儀測定 450 nm 光的吸光度值。

1.3.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力

將對數(shù)期miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細(xì)胞以每孔300 個接種于6 孔板中,細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。 細(xì)胞以PBS 洗去培養(yǎng)基,每孔加入5%多聚甲醛溶液固定10 min。 PBS 洗去多聚甲醛,各加入結(jié)晶紫染色液1 mL,染色10 min。 清水洗去染色液,用相機(jī)拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細(xì)胞生長至對數(shù)期時以PBS 洗一遍,1000 r/min離心5 min 收集細(xì)胞,用預(yù)冷的75%乙醇對細(xì)胞進(jìn)行固定。 細(xì)胞以 2000 r/min 離心 5 min,加入 400 μL 溴化乙錠(PI,50 μL/mL)和 100 μL RNase A(100 μg/mL ),4℃避光孵育 30 min。 以 Accuri C6 Plus 流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測并分析細(xì)胞周期。

1.3.7 蛋白印跡檢測各組CyclinE 蛋白表達(dá)變化

miR-574-3p mimic 組、陰性對照組及空白對照組細(xì)胞生長至對數(shù)期時以PBS 洗一遍,用總蛋白提取試劑RIPA 細(xì)胞裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解細(xì)胞10 min。 蛋白刮刀刮下細(xì)胞并收集于1.5 mL EP 管中,12000 r/min 離心20 min,吸取上清液至新的EP 管備用。 用BCA 蛋白定量試劑盒對各上清進(jìn)行定量。 制備 30 μg/10 μL 的蛋白樣品,100℃變性5 min。 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離蛋白,并將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上,5%的脫脂牛奶封閉PVDF 膜4 h,用 CyclinA1(1 ∶1000)、CDK2(1 ∶2000)、PCNA(1∶1000)、Cdc25A(1 ∶1000)、P53(1 ∶2000)及 GAPDH(1 ∶1000)抗體于 4℃ 孵育過夜。 TBST 洗 PVDF 膜 3次,羊抗兔 IgG-HRP 抗體室溫孵育 1 h,PBS 洗PVDF 膜3 次,以 ECL 化學(xué)發(fā)光液對 PVDF 膜進(jìn)行顯色,Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影,讀取相應(yīng)蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 15.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。 多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,事后兩兩多重比較以LSD-t檢驗(yàn)分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染 miR-574-3p mimic 增強(qiáng) HT-29 細(xì)胞miR-574-3p 表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示,空白對照組、陰性對照組、miR-574-3p mimic 組 miR-574-3p 表達(dá)水平分別為(0.12±0.01)%、(0.13±0.01)%及(1.53±0.14)%,空白對照組與陰性對照組比較無明差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組miR-574-3p 表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。 見圖 1。

圖1 各組細(xì)胞miR-574-3p 表達(dá)變化(n=6)Note. Compared with the negative group, **P<0.01.Figure 1 Changes of miR-574-3p expression in each group

2.2 轉(zhuǎn)染 miR-574-3p mimic 抑制 HT-29 細(xì)胞增殖

CCK-8 結(jié)果顯示,12~72 h,空白對照組和陰性對照組細(xì)胞生長曲線相類似,而miR-574-3p mimic組細(xì)胞生長較為緩慢。 與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組細(xì)胞在36~72 h 細(xì)胞活力均明顯降低(P<0.01)。 見圖 2。

圖2 各組細(xì)胞12~72 h 生長曲線(n=3)Note. Compared with negtive group, **P<0.01.Figure 2 12~72 h growth curve of cells in each group

2.3 轉(zhuǎn)染 miR-574-3p mimic 抑制 HT-29 細(xì)胞克隆形成

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,空白對照組、陰性對照組、miR-574-3p mimic 組細(xì)胞克隆形成率分別為100%、(102.60±9.60)%及(35.65±3.35)%。 空白對照組與陰性對照組比較無明差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組細(xì)胞克隆形成率顯著降低(P<0.01)。 見圖 3。

圖3 各組細(xì)胞克隆形成能力比較(n=3)Note. Compared with the negative group,**P<0.01.Figure 3 Comparison of cell clone formation ability in each group

2.4 轉(zhuǎn)染 miR-574-3p mimic 誘導(dǎo) S 期 HT-29 細(xì)胞比例增加

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,空白對照組、陰性對照組、miR-574-3p mimic 組S 期細(xì)胞比例分別為(13.86 ± 2.65)%、 (15.12 ± 2.88)% 及 (35.36 ±4.50)%。 空白對照組與陰性對照組比較無明差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組S 期細(xì)胞比例顯著增加(P<0.01)。 見圖4。

圖4 各組細(xì)胞周期變化(n=3)Figure 4 Cell cycle changes in each group

2.5 轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic 誘導(dǎo)S 期相關(guān)蛋白表達(dá)變化

Western blot 結(jié)果顯示,空白對照組、陰性對照組及miR-574-3p mimic 組細(xì)胞CyclinA1 蛋白表達(dá)為100%、(96.32±7.80)%及(35.36±4.50)%,CDK2 蛋白 表達(dá) 為 100%、 (103.90 ± 8.92)% 及(33.30±3.56)%,PCNA 蛋白表達(dá)為100%、(105.25±9.85)%及(18.98±1.60)%,Cdc25A 蛋白表達(dá)為100 %、(100.80±8.65)%及(35.66±3.28)%,P53蛋白表達(dá)分別為100%、(97.68±9.28)%及(563.50±36.67)%。 空白對照組與陰性對照組比較各蛋白表達(dá)無明顯差異,與陰性對照組相比,miR-574-3p mimic 組 CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),P53 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。 見圖 5。

圖5 各組細(xì)胞S 期相關(guān)蛋白表達(dá)變化(n=3)Note. A, Blank group. B, Negative group. C, miR-574-3p mimic group. Compared with the negative group,**P<0.01.Figure 5 Changes in the expression of S-phase related proteins in each group

3 討論

miR-574-3p 作為miRNA 的一種,在包括腫瘤在內(nèi)的多疾病中發(fā)揮一定作用[12-13]。 miR-574-3p 已被證實(shí)涉及胃癌、乳腺癌及肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[8-10]。 研究顯示,miR-574-3p 可通過靶向FAM3C 和MAPK1 抑制食道癌的增殖和侵襲[13]。 還有研究通過轉(zhuǎn)染 miR-574-3p mimic 或miR-574-3p inhibitor 調(diào)控 miR-574-3p 表達(dá)發(fā)現(xiàn),miR-574-3p 能抑制MMP3 表達(dá)從而在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用[14]。 Yang 等[15]同樣通過轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic 或 miR-574-3p inhibitor 發(fā)現(xiàn),miR-574-3p能通過靶向IL6/JAK/STAT3 途徑誘導(dǎo)慢性髓樣白血病細(xì)胞增殖抑制和凋亡。 這些提示,miR-574-3p在惡性腫瘤中可能發(fā)揮抑癌作用。 結(jié)腸癌相關(guān)報道顯示,miR-574-3p 通過靶向抑制結(jié)腸癌細(xì)胞周期蛋白D2 表達(dá)而抑制細(xì)胞生長和遷移[11]。 但miR-574-3p 在結(jié)腸癌中的作用還不是十分清楚,有待于更多研究探討。 本研究通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的miR-574-3p mimic 成功誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞過表達(dá) miR-574-3p。 進(jìn)一步研究顯示,miR-574-3p mimic 能明顯誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞活力和克隆形成能力降低。 提示,miR-574-3p 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 增殖,這與研究報道[11]結(jié)果相類似。 但miR-574-3p 抑制結(jié)HCT116 細(xì)胞增殖的信號機(jī)制還不完全清楚。

細(xì)胞周期是細(xì)胞基本的生命活動過程,可分為分裂期和分裂間期,分裂間期又分為G1 期、S 期、G2 期,細(xì)胞生命活動的大部分時間是在分裂間期度過的[16-17]。 一般來說,周期進(jìn)程的速度與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。 細(xì)胞周期的有序進(jìn)行依賴于周期調(diào)控系統(tǒng)的嚴(yán)密調(diào)控。 當(dāng)這種調(diào)控系統(tǒng)的某個環(huán)節(jié)受到影響后,細(xì)胞可能停留在細(xì)胞周期的某一期而不能進(jìn)入下一周期,這種現(xiàn)象被稱為細(xì)胞周期阻滯[16-17]。 本研究顯示,HCT116 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-574-3p mimic 后S 期細(xì)胞比例明顯增加。 結(jié)合增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,miR-574-3p 可誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞 S 期阻滯。 研究顯示,人參皂苷Rg5 通過降低Cyclin A1、CDK2、PCNA 蛋白表達(dá)和升高P21 蛋白表達(dá),從而誘導(dǎo)胃癌MKN-45 細(xì)胞發(fā)生S 期阻滯[18]。 另有研究顯示,亞砷酸鈉可通過上調(diào)SH-SY5Y 細(xì)胞p53 蛋白表達(dá)和下調(diào)CDC25A、CyclinA 及CDK2 蛋白誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞 S 期阻滯,從而抑制細(xì)胞生長[19]。 提示,CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 及 P53 蛋白參與細(xì)胞 S 期調(diào)控。 為了探討 miR-574-3p 影響HCT116 細(xì)胞S 期阻滯的作用機(jī)制,本研究對上述蛋白進(jìn)行了觀察。 結(jié)果顯示,HCT116 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic 后 CyclinA1、 CDK2、 PCNA、Cdc25A 蛋白表達(dá)顯著下調(diào),P53 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。 提示,miR-574-3p 可能通過誘導(dǎo) CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 蛋白表達(dá)顯著下調(diào),及 P53 蛋白表達(dá)上調(diào),而誘導(dǎo)HCT116 細(xì)胞S 期阻滯。 而前文中miR-574-3p 抑制HCT116 細(xì)胞增殖,可能與阻滯細(xì)胞于S 期而不能進(jìn)入G2 期有關(guān)。 但本研究目前只通過轉(zhuǎn)染miR-574-3p mimic 對結(jié)腸癌中miR-574-3p 的作用進(jìn)行了研究,后續(xù)本研究還會以miR-574-3p inhibitor 進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

近年來,核酸類藥物逐漸成為生物醫(yī)藥發(fā)展的前沿領(lǐng)域,與此同時作為功能性RNA 的miRNA 已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)。 本研究發(fā)現(xiàn),miR-574-3p 可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 增殖,而該作用可能與下調(diào) CyclinA1、CDK2、PCNA、Cdc25A 蛋白表達(dá),及上調(diào)P53 蛋白表達(dá),最終誘導(dǎo)細(xì)胞S 期阻滯有關(guān)。 因此,阻遏miR-574-3p 及其下游信號靶點(diǎn)可能是結(jié)腸癌治療的潛在方法。 本研究為臨床治療結(jié)腸癌提供了基礎(chǔ)理論支持,但在結(jié)腸癌中miR-574-3p 的功能作用還未完全明了,有待于進(jìn)一步研究。