曹 育,安玉蘭,張卓銘,翟春濤,武峻艷

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院推拿科,山西晉中 030619;2.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)醫(yī)學(xué)史教研室,山西晉中 030619;3.山西中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院針灸科,山西晉中 030619;4.山西中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床學(xué)院腦病一科,山西晉中 030619)

阿爾茨海默癥(Alzheimer disease,AD)是以記憶力障礙、執(zhí)行功能損害和人格改變等全面性癡呆表現(xiàn)為特征的神經(jīng)退行性疾病。 AD 占癡呆診斷的80%,自2010 年以來,AD 的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。 許多研究表明,線粒體功能障礙、Tau 蛋白異常磷酸化、氧化應(yīng)激損傷等均與AD 的發(fā)生密切相關(guān)[2]。 遺憾的是,目前還沒有藥物能夠有效治療AD。 針灸作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),為AD 的預(yù)防和治療提供了思路[3-4]。 中醫(yī)認(rèn)為,AD 的發(fā)生以本虛為主,患者腎虛精虧,不能上充于腦,最終腦髓空虛導(dǎo)致靈機使用,引發(fā)癡呆。 依據(jù)“腎腦相濟”理論,針刺百會、腎俞和太溪穴可以改善癡呆大鼠的認(rèn)知功能[5]。 然而針刺治療AD 的生物學(xué)機制目前尚未明確。

有研究顯示,癡呆患者的海馬神經(jīng)軸突營養(yǎng)不良,并且存在樹突棘丟失和樹突復(fù)雜性降低等現(xiàn)象[6]。 可溶性Aβ 蛋白可破壞突觸超微結(jié)構(gòu)和馬神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)、減少棘突密度,引起癡呆認(rèn)知功能障礙[7]。 海馬CA1 區(qū)椎體細(xì)胞損傷與神經(jīng)認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)[8]。 為了探討針刺治療AD 的機制,本研究以SAMP8 快速老化小鼠為研究對象,觀察針刺百會、腎俞和太溪穴后小鼠海馬CA1 區(qū)樹突結(jié)構(gòu)及認(rèn)知功能的變化。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

24 只SPF 級快速老化雄性SAMP8 小鼠和12只SPF 級雄性正常老化SAMR1 小鼠,均7 月齡,體重(32.23±5.09)g,購于至善(北京)健康醫(yī)學(xué)研究院[SCXK(京)2017-0001]。 在溫度 20℃ ~25℃、濕度為40%~60%的環(huán)境中,明暗周期為12 h/12 h 條件下于山西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SYXK(晉)2018-0002]飼養(yǎng),允許所有小鼠自由進(jìn)食和進(jìn)水,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行后續(xù)實驗。 本研究所有操作嚴(yán)格遵循中國實驗動物福利法,符合3R 原則。動物實驗經(jīng)過山西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(SZLLSC2019-0160)。

1.2 主要試劑與儀器

Golgi 染色試劑盒(批號HTKNS1125)購于北京博蕾德科技發(fā)展有限公司; 戊巴比妥(批號2017089)和多聚甲醛(批號2017087)購于北京邁瑞達(dá)科技有限公司;免疫組化檢測試劑盒(批號074K00)、BCA 蛋白檢測試劑盒(批號 L2800)、SDSPAGE 凝膠制備試劑盒(批號67H04)均購于美國Sigma 公司;Tau(批號 ab109302)、Aβ1-40(批號ab00109)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)(批號ab223354)、突觸素(Synaptophysin,SYN)(批號321207)、微管相關(guān)蛋白2(Microtubule-associated protein 2,MAP2) (批號ab870921)和GAPDH 內(nèi)參抗體(批號ab204276)均購于英國Abcam 公司;水迷宮設(shè)備購于上海軟隆科技發(fā)展有限公司;針灸針購于泰興市天和醫(yī)療器械有限公司;KH-LQ3800 冰凍切片機購于湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司;CX31 光學(xué)顯微鏡為日本奧林巴斯公司生產(chǎn);WD-9413B 型凝膠成像分析系統(tǒng)購于濟南東儀實驗室設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及治療

將24 只SAMP8 小鼠隨機分為模型組和針刺組,每組12 只;將12 只 SAMR1 小鼠作為對照組。針刺組采用針刺治療8 周,模型組和對照組正常飼養(yǎng),不進(jìn)行干預(yù)。 參考《普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材:針灸學(xué)(第2 版)》,選取百會穴(頂骨正中)、腎俞穴(第2 腰椎下兩旁約5 mm)、太溪穴(內(nèi)踝后方凹陷部位),用30 號針刺入,每次留針20 min,每隔5 min 行針一次,行針時捻針?biāo)俣葹槊糠昼?00 次,捻針20 次為行針1 次。 隔日針刺一次,連續(xù)針刺治療8 周。

1.3.2 Morris 水迷宮實驗檢測小鼠認(rèn)知功能

針刺治療8 周后,用Morris 水迷宮實驗檢測所有小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[9]。 該實驗分為兩個部分:(1)定位導(dǎo)航實驗:將小鼠放入水中(水深約20~25 cm,水溫約(23±1)℃)自由游泳2 min,適應(yīng)環(huán)境。 每天訓(xùn)練4 次,共訓(xùn)練5 d。 選取水迷宮其中1 個象限放置平臺,將經(jīng)過環(huán)境適應(yīng)的小鼠小心放入水池。 記錄4 次小鼠2 min 內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期),計算平均值。 (2)空間探索實驗:上述實驗完成后將平臺撤除,并將小鼠從某一象限小心放入水中,記錄小鼠2 min 內(nèi)的跨平臺次數(shù)。

1.3.3 Golgi 染色觀察海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞樹突結(jié)構(gòu)

每組隨機選取8 只小鼠,用2%戊巴比妥麻醉,劑量為10 mL/kg。 固定小鼠,開胸后暴露心臟,剪開左心室,插入灌注針至升主動脈,血管夾固定主動脈處。 灌注無菌生理鹽水,待右心耳腫大后剪破,觀察到肝肺變白,右心耳流出液澄清后,灌注4%多聚甲醛。 待全身僵硬后取腦。 每組中隨機選4 只進(jìn)行 Golgi 染色。 Golgi 染色:取完整腦組織于Golgi-Cox 中,避光放置2 周。 經(jīng)過海馬區(qū)冠狀面以厚度為100 μm 作連續(xù)切片。 無菌蒸餾水漂洗,浸泡于Golgi-Cox 溶液,去離子水漂洗。 梯度乙醇脫水,二甲苯透化,中性樹膠封片。 光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠海馬CA1 區(qū)的Golgi 染色,椎體細(xì)胞選擇的標(biāo)準(zhǔn)為:椎體細(xì)胞位于CA1 區(qū)內(nèi);細(xì)胞的形清晰,胞體及分支的染色均一致;第三分支完整。 應(yīng)用Image J 軟件(Neuron J 分析插件)量化樹突數(shù)量和長度,用Sholl 進(jìn)行樹突復(fù)雜性分析。 以神經(jīng)元胞體為中心,做間距為40 μm 的同心圓,分析樹突和同心圓的交點數(shù),以反映樹突分支數(shù)量。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色法檢測海馬 CA1 區(qū)Aβ1-40和 Tau 蛋白表達(dá)

每組隨機選4 只小鼠用于免疫組織化學(xué)染色。取腦后放置于4%多聚甲醛中固定,再放入30%蔗糖中沉淀脫水。 應(yīng)用冰凍包埋劑將腦組織包埋,行冠狀面連續(xù)切片,厚度為15 μm。 每只小鼠取4 張切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。 步驟如下:首選滅火內(nèi)源性過氧化物酶,隨后0.01% PBS 沖洗3 次,再進(jìn)行微波抗原修復(fù)。 用10%山羊血清孵育1 h,隨后吸除羊血清,加入 Aβ1-40抗體或 Tau 抗體,4℃濕盒內(nèi)孵育過夜,滴加生物素標(biāo)記的二抗,再次孵育30 min,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白工作液,最后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色15 min,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。 顯微鏡下觀察,選取海馬CA1 區(qū)10 個高倍鏡視野,對陽性表達(dá)區(qū)(染色為棕黃色)進(jìn)行圖像分析,測定光密度值。

1.3.5 Western blot 檢測海馬 CA1 區(qū) BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表達(dá)水平

選取4 只小鼠,取海馬 CA1 區(qū)檢測蛋白。 用RAPI 裂解液提取組織總蛋白,用BCA 試劑盒檢測BDNF、SYN 和 MAP2 蛋白濃度,電泳,分離蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF 膜。 5%脫脂奶粉封閉2 h,加入抗BDNF(1∶500)、抗 SYN(1 ∶200)或抗 MAP2(1 ∶500),4℃ 過夜孵育。 用TBST 緩沖液洗滌3 次后加入二抗(羊抗兔,1 ∶500),封閉 1 h。 以 GAPDH 作為內(nèi)參,用ECL 發(fā)光儀對蛋白成像,灰度值用 Image J 軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠認(rèn)知功能比較

三組小鼠的逃避潛伏期和跨平臺次數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為26.002 和18.734,P<0.001)。 與對照組比較,模型組水迷宮訓(xùn)練第5 天時逃避潛伏期較高,而跨平臺次數(shù)較低(P<0.001)。與模型組比較,針刺組水迷宮訓(xùn)練第5 天時逃避潛伏期較低,而跨平臺次數(shù)較高(P值分別為0.009 和0.001),見圖 1。

圖1 Morris 水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶功能(n=12)Note. A, Escape latency of mice in each group was compared on the fifth day of water maze training. B,Comparison of cross platform times of mice in each group. Compared with the control group, *P<0.05.Compared with the model group, #P<0.05. The same as below.Figure 1 Morris water maze test to detect learning and memory function in mice

2.2 三組海馬CA1 區(qū)樹突結(jié)構(gòu)比較

Golgi 染色顯示,對照組小鼠海馬CA1 區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài)良好,模型組小鼠椎體細(xì)胞受損,而8 周的針刺治療可以改善SAMP8 小鼠椎體細(xì)胞損傷(圖2A)。 三組小鼠的基底樹突長度、頂端樹突長度、基底樹突分?jǐn)?shù)數(shù)目和頂端樹突分支數(shù)目的比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為18.001、21.561 和9.089,P<0.01)。 與對照組比較,模型組基底樹突長度、頂端樹突長度、基底樹突分?jǐn)?shù)數(shù)目和頂端樹突分支數(shù)目均較低 (P值分別為 0.013、0.009、0.037 和0.010)。 與模型組比較,針刺組上述指標(biāo)均較高(P值分別為 0.022、0.016、0.013、0.032),見圖 2B。Sholl 分析中,同心圓半徑為40 μm、80 μm、120 μm、160 μm 時,模型組交點數(shù)明顯低于對照組,而針刺組明顯高于模型組(P<0.05),見圖2C。

圖2 三組海馬CA1 區(qū)樹突結(jié)構(gòu)比較(n=4)Note. A,Golgi staining to observe the morphology of vertebral neurons in hippocampal CA1 area, ①,Control group. ②,Model group. ③,Acupuncture group. B, Image J software (Neuron J analysis plug-in) analyzes the number and length of dendrites. C, Sholl analysis of dendritic branches.Figure 2 Comparison of the dendritic structure of the hippocampal CA1 area of the three groups

2.3 三組海馬CA1 區(qū)Aβ1-40表達(dá)水平比較

Aβ1-40和Tau 陽性細(xì)胞均為胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色沉淀物。 三組小鼠海馬CA1 區(qū)Aβ1-40和Tau 表達(dá)的平均光密度值的比較有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為10.890 和 7.562,P均<0.01)。 與對照組比較,模型組Aβ1-40和Tau 表達(dá)的平均光密度值較高(P均<0.001)。 與模型組比較,針刺組上述指標(biāo)較低(P均<0.05),見圖3。

圖3 免疫組織化學(xué)染色法檢測海馬CA1 區(qū)Aβ1-40和Tau 表達(dá)(n=4)Figure 3 Immunohistochemical staining method to detect the expression of Aβ1-40 and Tau in hippocampal CA1 area

2.4 Western blot 檢測海馬 CA1 區(qū) BDNF、SYN和MAP2 蛋白表達(dá)水平

三組海馬 CA1 區(qū) BDNF、SYN 和 MAP2 蛋白表達(dá)水平的比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(F值分別為8.098、5.443 和 10.023,P均<0.05)。 與對照組比較,模型組 BDNF、SYN 和 MAP2 蛋白表達(dá)水平均較低(P值分別為 0.001、0.008 和 0.003)。 與模型組比較,針刺組BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表達(dá)水平均較高(P值分別為 0.011、0.019 和0.007),見圖 4。

圖4 Western blot 檢測海馬CA1 區(qū)BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表達(dá)水平(n=4)Figure 4 Western blot detection of BDNF, SYN and MAP2 protein expression levels in hippocampal CA1 area

3 討論

AD 嚴(yán)重影響了老年人的生存質(zhì)量,給家庭和社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)。 從中醫(yī)角度講,AD 的發(fā)生與腎虛有關(guān),腎氣推動運化無力,在腦內(nèi)形成痰淤。AD 病變部位在大腦,但是病機為本虛標(biāo)實,腎虛精虧[5]。 《醫(yī)學(xué)心悟》中也提到:“腎主智,腎虛則智不足”[10]。 本研究基于“腎腦相濟”理論,針刺快速老化SAMP8 小鼠的百會、腎俞和太溪穴進(jìn)行治療。 百會穴屬于腧穴,是調(diào)節(jié)大腦功能的重要穴位[11];腎俞穴屬足太陽膀胱經(jīng)穴,對腰膝酸軟、腎虛精虧的治療有較好的療效[12];太溪穴主治腎病,具有滋陰益腎和清熱生氣之效[13]。 本研究中,治療8 周后SAMP8 小鼠認(rèn)知功能和海馬CA1 區(qū)的Aβ1-40和Tau蛋白表達(dá)水平均明顯改善,提示針刺治療AD 有效。研究結(jié)果與王旭等[5]報道類似。

針刺治療癡呆的機制目前未完全明確,可能與改善腦內(nèi)多巴胺水平、增加抗氧化能力、降低免疫炎癥損傷、抑制神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)腦血管新生等有關(guān)[14-15]。 本研究從突觸可塑性角度對針刺治療AD的機制進(jìn)行探討。 樹突的形態(tài)對神經(jīng)元的的生理功能起到了決定性的作用,可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的信號輸入及對信息的處理速度和能力,進(jìn)而影響突觸后的輸出。 既往研究證實,樹突在學(xué)習(xí)記憶的形成中發(fā)揮重要作用[16]。 海馬CA1 區(qū)椎體細(xì)胞損傷與神經(jīng)認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)[8]。 本研究用Golgi 染色觀察了海馬CA1 區(qū)椎體細(xì)胞樹突結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果顯示SAMP8 小鼠椎體細(xì)胞基底樹突長度、頂端樹突長度、基底樹突分?jǐn)?shù)數(shù)目和頂端樹突分支數(shù)目發(fā)生異常變化,這與 Wang 等[17]報道一致。 另外,Sholl 分析結(jié)果也顯示,SAMP8 小鼠的樹突分支明顯變少。 本研究中,SAMP8 小鼠接受針刺8 周治療后,椎體細(xì)胞基底樹突長度、頂端樹突長度、基底樹突分?jǐn)?shù)數(shù)目和頂端樹突分支數(shù)目明顯增高。 提示針刺能夠改善海馬CA1 區(qū)樹突結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的。

為了驗證針刺對神經(jīng)可塑性的影響,我們檢測了海馬CA1 區(qū)BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表達(dá)水平。BDNF 是學(xué)習(xí)和記憶所必須的物質(zhì),能夠增強突觸后致密物上N-甲基-D 天冬氨酸受體1 和2B 的磷酸化,促進(jìn)長時程抑制的產(chǎn)生;另外,BDNF 可以調(diào)控樹突和軸突的生長,影響突觸可塑性[18]。 SYN 參與突觸囊泡形成和胞吐,通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,影響突觸形成和發(fā)育[19]。 MAP2 是重要的細(xì)胞骨架,存在于神經(jīng)元胞體和樹突中,是許多蛋白激酶的底物,如細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和cAMP 依賴蛋白激酶等。 MAP2 與突觸可塑性及認(rèn)知功能密切相關(guān)[20]。 既往有研究發(fā)現(xiàn),BDNF/SYN/MAP2 信號通路與神經(jīng)可塑性及認(rèn)知功能密切相關(guān)[21]。 本研究顯示,針刺8 周后 SAMP8 小鼠海馬 CA1 區(qū) BDNF、SYN 和MAP2 蛋白表達(dá)水平明顯下降。 提示針刺可能是通過BDNF/SYN/MAP2 信號通路影響海馬樹突結(jié)構(gòu)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),基于“腎腦相濟”理論,針刺百會、腎俞和太溪穴可能通過激活BDNF/SYN/MAP2 信號通路,改善海馬CA1 區(qū)樹突長度和分支數(shù)目,從而下改善快速老化SAMP8 小鼠的認(rèn)知功能。 本研究為針刺治療AD 提供了一定的理論基礎(chǔ),未來需要更深入地進(jìn)行機制學(xué)研究。