陳 霞，葛永怡，張小丹，陳 磊，劉緣園，吳 娟

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550025)

0 引言

冠突曲霉(Aspergilluscristatus)是茯磚茶“發(fā)花”過(guò)程的優(yōu)勢(shì)菌種，它的產(chǎn)孢特性可通過(guò)滲透壓調(diào)節(jié)，在低滲條件下產(chǎn)生子囊孢子，被稱為有性型，高滲條件下產(chǎn)生分生孢子，被稱為無(wú)性型[1-2]。冠突曲霉能利用茶葉提供的養(yǎng)分產(chǎn)生豐富的天然活性物質(zhì)，從而賦予茯磚茶獨(dú)特的風(fēng)味及功效[3-5]。

莽草酸(Shikimic acid，SA)是高等植物及微生物次生代謝的起始物，為芳香族類化合物的前體，奎寧酸(Quinic acid QA)為其生物合成代謝通路中的中間產(chǎn)物，莽草酸和奎寧酸在醫(yī)藥、食品等行業(yè)均有著廣泛的應(yīng)用[6]。目前，莽草酸獲取方法主要依靠化學(xué)合成及植物提取，這些方法的不足之處是成本高昂，前體化合物具有毒性[7-8]。因此，莽草酸的生物合成具有顯著的優(yōu)勢(shì)，CHEN Xiaozhang等[7]的研究中，通過(guò)敲除大腸桿菌中莽草酸脫氫酶基因ydiB等多個(gè)基因定點(diǎn)突變aroG基因及優(yōu)化發(fā)酵，將莽草酸的產(chǎn)量提高了6.9倍。相較于莽草酸途徑，奎寧酸途徑的研究?jī)H在細(xì)菌中有相關(guān)報(bào)道[9]。在莽草酸途徑中，aroF基因表達(dá)3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤蘚糖-4-磷酸(E4P)合成3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)，quiB基因表達(dá)奎寧酸脫氫酶催化奎寧酸生成3-脫氫奎寧酸，而脫氫奎寧酸脫水酶(aroD)催化脫氫奎寧酸脫水形成3-脫氫莽草酸，它們是其他化合物進(jìn)入莽草酸的關(guān)鍵酶。此后，莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroK)、3-磷酸5-烯醇式丙酮酰莽草酸(aroA)、分支酸合酶(aroC)等基因編碼的多種酶類催化3-脫氫莽草酸經(jīng)過(guò)莽草酸、磷酸莽草酸等形成分支酸并進(jìn)入芳香族氨基酸形成途徑。

冠突曲霉的全基因組測(cè)序顯示該菌基因組中不僅存在莽草酸途徑相關(guān)基因，也同時(shí)存在奎寧酸途徑相關(guān)基因，這表明該菌具有執(zhí)行莽草酸途徑和奎寧酸途徑并形成相關(guān)化合物的潛力。本研究將對(duì)冠突曲霉不同發(fā)育階段aroF、脫氫奎寧酸合成酶(quiB)和aroD的表達(dá)量及3個(gè)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)酶活開(kāi)展檢測(cè)，獲得3個(gè)基因不同發(fā)育階段的表達(dá)量，獲得3個(gè)基因?qū)?yīng)蛋白的酶活，獲得3個(gè)基因表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)蛋白酶活的相關(guān)性，從而幫助探索冠突曲霉中莽草酸途徑和奎寧酸途徑運(yùn)行的初步狀況，為探索冠突曲霉的莽草酸途徑、奎寧酸途徑存在與運(yùn)轉(zhuǎn)情況提供了證據(jù)，也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化改造該菌生產(chǎn)莽草酸奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株為冠突曲霉(Aspergilluscristatus)，分離于湖南益陽(yáng)茯磚茶，現(xiàn)保存于中科院菌種保藏中心和貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中科院菌株保藏號(hào)為CGMCC 7.193。

1.2 主要培養(yǎng)基

MYA培養(yǎng)基：麥芽提取物2 g，酵母提取物0.5 g，蔗糖3 g，瓊脂粉2.5 g，蒸餾水定容至100 mL。121 ℃滅菌15 min。

高滲MYA培養(yǎng)基：麥芽提取物2 g，酵母提取物0.5 g，蔗糖3 g，NaCl 17 g，瓊脂粉2.5 g，加蒸餾水定容至100 mL。121 ℃滅菌15 min。

1.3 菌絲體的培養(yǎng)與收集

MYA平板活化保藏于甘油管中的冠突曲霉，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后，利用無(wú)菌水洗下分生孢子制備分生孢子懸液，調(diào)整孢子濃度為1.0×105CFU/mL，分別吸取20 μL接種到MYA和高滲MYA固體培養(yǎng)基中，涂布均勻。有性階段分別收集營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段、閉囊殼形成階段、子囊和子囊孢子形成階段的菌體；無(wú)性階段收集分生孢子萌發(fā)階段及分生孢子大量形成階段的菌體，液氮速凍后于-70 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酶活測(cè)定

1.4.1 制備粗酶液

取對(duì)應(yīng)5個(gè)生長(zhǎng)階段的菌體，液氮充分研磨成粉，準(zhǔn)確稱取1 g菌粉加入5 mL pH值為7.5、濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，混勻后4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清即為待測(cè)粗酶液。

1.4.2 aroF酶活測(cè)定

準(zhǔn)確量取50 μL濃度為5 mmol/L的E4P，25 μL濃度為10 mmol/L的PEP，0.5 mL pH值為6.4、濃度為0.1 mol/L的Tris-HCL混勻于試管中，加入步驟1.4.1中制備的粗酶液100 μL，37 ℃水浴10 min，加入0.2 mL體積比為10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，1 000 r/min離心5 min后取上清0.25 mL于1.5 mL離心管中，加入0.25 mL濃度為25 mmol/L的高碘酸溶液，室溫下放置45 min后加入0.5 mL體積比為2%的亞砷酸鈉溶液，室溫靜置2 min，加入2 mL體積比為0.3%的硫巴比妥溶液，沸水浴5 min后于549 nm處測(cè)定吸光度。

1.4.3 quiB酶活測(cè)定

在0.1 mol/L甘氨酸緩沖液(pH值=9.8)中進(jìn)行，分別取100 μL濃度為20 mmol/L的NAD+溶液、14 mmol/L 2-巰基乙醇溶液、200 mmol/L莽草酸溶液于1.5 mL的EP管中，以pH值為9.8、濃度為0.1 mol/L的甘氨酸緩沖液補(bǔ)足至900 μL，加入100 μL酶粗提液，30 ℃反應(yīng)10 min，沸水浴5 min，1 000 r/min離心2 min后于340 nm處測(cè)定吸光度。

1.4.4 aroD酶活測(cè)定

取不同生長(zhǎng)階段菌體，按照1.4.1方法分別制取對(duì)應(yīng)時(shí)期菌體的粗酶液，參照脫氫奎尼酸脫水酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.5 aroF、quiB、aroD基因表達(dá)量的檢測(cè)

1.5.1 不同生長(zhǎng)階段總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

分別取1 g步驟1.3中收集的各階段菌體，按照真菌總RNA提取試劑盒(生工生物，上海)說(shuō)明書(shū)提取菌體總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取得總RNA濃度、純度及完整性。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，美國(guó))反轉(zhuǎn)錄，獲得菌體各時(shí)期的cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 待測(cè)基因的實(shí)時(shí)熒光引物設(shè)計(jì)與篩選

從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取aroF、quiB、aroD基因序列，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)aroF、quiB、aroD基因的特異性引物，并利用BioEdit軟件中的Local BLAST程序與已建立的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)已設(shè)計(jì)引物的特異性，共設(shè)計(jì)引物6對(duì)，根據(jù)各對(duì)引物的Tm值，對(duì)上述引物進(jìn)行特異性篩選。

1.5.3 qRT-PCR檢測(cè)待測(cè)基因不同生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量

以不同生長(zhǎng)階段菌體的cDNA為模板，引物序列如表1所示，優(yōu)化獲得的反應(yīng)體系為SYBR Green I 10 μL、Primer F 0.8 μL、Primer R 0.8 μL、cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，優(yōu)化獲得的PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 篩選獲得的特異引物信息Tab.1 Screening results of specific primers

1.6 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法，以GAPDH為內(nèi)參基因，計(jì)算每個(gè)基因在冠突曲霉不同生長(zhǎng)階段的相對(duì)表達(dá)量；運(yùn)用SPSS 22、Microsoft Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)和最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行方差分析與多重比較(α=0.05)，采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，所有結(jié)果均為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 aroF、aroE、quiB、aroD蛋白的酶活測(cè)定

冠突曲霉在其5個(gè)生長(zhǎng)階段，即營(yíng)養(yǎng)階段(S-1)、閉囊殼形成階段(S-2)、子囊和子囊孢子階段(S-3)、分生孢子萌發(fā)階段(S-4)、分生孢子大量形成階段(S-5)所呈現(xiàn)的菌落形態(tài)均有顯著差異(圖1)。莽草酸途徑中關(guān)鍵酶在不同階段的活性不同(圖2)，結(jié)果表明，在菌株生長(zhǎng)的所有階段aroF的酶活顯著高于quiB與aroD(P<0.05)，aroF在S-5階段酶活最低，為(60.65±0.33)U/L，但仍高于其他酶的最高酶活。在冠突曲霉的有性生長(zhǎng)階段，隨著菌體閉囊殼的形成，aroF、quiB、aroD的酶活均出現(xiàn)升高的趨勢(shì)，分別由(62.08±0.43)U/L升至(68.60±0.19)U/L，(5.37±0.58)U/L升至(19.56±0.67)U/L，(33.76±0.03)U/L升至(34.30±0.10)U/L；在該菌子囊和子囊孢子形成階段，aroF和aroD的酶活呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，quiB的酶活呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。無(wú)性生長(zhǎng)階段，隨著菌體的生長(zhǎng)，aroF、quiB、aroD的酶活均顯著(P

注：同種酶不同字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。圖2 酶活測(cè)定Fig.2 Enzyme activity determination

圖1 不同生長(zhǎng)時(shí)期冠突曲霉的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Aspergillus cristatus in different growth stages

<0.05)下降，分別由(64.37±0.53)U/L降至(60.65±0.33)U/L，(36.74±1.42)U/L降至(18.87±0.75)U/L，(31.42±0.70)U/L降至(26.59±3.13)U/L，這表明冠突曲霉aroF、quiB、aroD蛋白可能與有性發(fā)育過(guò)程中閉囊殼的形成相關(guān)，與無(wú)性發(fā)育過(guò)程中分生孢子形成相關(guān)性差，quiB蛋白可能與有性發(fā)育的子囊孢子形成最相關(guān)，與無(wú)性發(fā)育過(guò)程中分生孢子形成相關(guān)性差。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物篩選及擴(kuò)增效率結(jié)果

選取冠突曲霉的cDNA作為模板，設(shè)計(jì)并篩選出用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，結(jié)果如表1所示，后用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件分別對(duì)GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)、aroF、quiB、aroD基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，各基因擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。試驗(yàn)結(jié)果表明：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，誤差較小，說(shuō)明試驗(yàn)得到的Ct值可以準(zhǔn)確確定起始cDNA拷貝數(shù)，試驗(yàn)誤差較小，可信度較高。

圖3 待測(cè)基因的擴(kuò)增效率檢測(cè)Fig.3 Detection of amplification efficiency of gene to be tested

2.3 不同生長(zhǎng)階段基因表達(dá)量

以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，分別測(cè)定aroF、quiB、aroD基因在冠突曲霉中5個(gè)階段表達(dá)量的變化(圖4)。有性發(fā)育階段，隨著有性發(fā)育的不斷進(jìn)行，aroF和quiB基因的表達(dá)量不斷升高，S-1與S-3階段相比相對(duì)表達(dá)量分別升高了114.53和95.48倍，但aroD的表達(dá)量出現(xiàn)了降低的趨勢(shì)，S-1與S-3階段相比相對(duì)表達(dá)量降低了99.34%，表明aroF、quiB基因的表達(dá)與子囊孢子的形成有關(guān)，aroD基因與菌體早期生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。無(wú)性發(fā)育階段，隨著無(wú)性發(fā)育的進(jìn)行，aroF、quiB、aroD基因的表達(dá)量均出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，S-4與S-5階段相比分別下降了55.46%、52.38%和98.03%，表明3種基因的表達(dá)均與無(wú)性生長(zhǎng)早期菌體的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，與分生孢子的形成過(guò)程相關(guān)性差。

圖4 aroF、quiB、aroD在不同階段的相對(duì)表達(dá)指數(shù)Fig.4 Relative expression difference of aroF，quiB，aroD in different stages

2.4 基因表達(dá)量和對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)酶活的相關(guān)性

為了深入探索莽草酸、奎寧酸途徑在冠突曲霉中的運(yùn)行情況，本研究后續(xù)考察3個(gè)關(guān)鍵酶的酶活與對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量，以及aroF分別與quiB和aroD的酶活及對(duì)應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性(圖5)。由圖5可知，aroF與aroD的酶活與其對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量分別表現(xiàn)出較弱的正相關(guān)和較弱的負(fù)相關(guān)，相關(guān)性方程分別為y=25.581x-1 535.1(R2=0.431)和y=-14.685x+573.84(R2=0.057)；quiB的酶活與其對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量表現(xiàn)出了較強(qiáng)的正相關(guān)(y=8.512 2x-47.151，R2=0.910)。另外，aroF與quiB酶活的相關(guān)性較弱(y=2.631x-150.77，R2=0.489)，但對(duì)應(yīng)基因之間的相關(guān)性較強(qiáng)(y=0.832 1x+18.651，R2=0.932 6)；aroF與aroD酶活的相關(guān)性較強(qiáng)(y=0.491 6x+0.301 1，R2=0.860)，但對(duì)應(yīng)基因之間的相關(guān)性較弱(y=-0.330 2x+142.03，R2=0.156)。結(jié)果表明僅有quiB的相對(duì)表達(dá)量和酶活具有顯著的一致性；aroF與aroD在冠突曲霉不同時(shí)期的酶活變化表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同性，但在對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量的變化上aroF與quiB表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同性。

圖5 關(guān)鍵酶酶活與基因相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of key enzyme activity and relative expression

3 討論與結(jié)論

莽草酸途徑現(xiàn)認(rèn)為是僅存于細(xì)菌、真菌及植物中的重要代謝途徑，其連接了生物的初生代謝與次生代謝，開(kāi)始于糖酵解途徑產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸(hosphoenolpyruvic acid，PEP)和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的赤蘚糖-4-磷酸(rythrose 4-phosphate，E4P)，在aroF基因表達(dá)的3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的催化下生成3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(Sedoheptulose 7-phosphate，DAHP)進(jìn)入莽草酸途徑，后經(jīng)多步催化反應(yīng)生成莽草酸[10]。如圖6所示，在冠突曲霉中除了莽草酸途徑還有奎寧酸途徑；以上兩種途徑均是合成芳香類化合物的必經(jīng)途徑，這些物質(zhì)對(duì)于茯磚茶的發(fā)酵及產(chǎn)香起重要的作用[11]。

圖6 莽草酸、奎寧酸途徑在冠突曲霉中的分布情況Fig.6 Distribution of shikimic acid and quinic acid pathways in Aspergillus cristatus

莽草酸是一種羥基化不飽和酸衍生物，是芳香族類氨基酸代謝途徑中的關(guān)鍵中間體，能夠抑制凝血系統(tǒng)，并具有抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥用作用，其在1997年發(fā)現(xiàn)，并在2005年證實(shí)禽流感疫情爆發(fā)期間顯現(xiàn)出了良好的治療效果，被認(rèn)為是抑制H7N9等型流感病毒的特效藥[12-13]。奎寧酸是一種羥基苯甲酸衍生物，是莽草酸途徑中中間代謝產(chǎn)物3-脫氫奎寧酸經(jīng)奎寧酸脫氫酶催化生成，其是一種具有較高價(jià)值的醫(yī)藥合成中間體，具有抗炎、抗氧化等作用，并具有生物引誘的作用[14-15]。目前，以上兩種化合物的生產(chǎn)大多數(shù)通過(guò)植物提取實(shí)現(xiàn)，野生八角中的莽草酸含量較高，是較好的植物來(lái)源，但依舊存在諸多問(wèn)題，需開(kāi)發(fā)成本更低、操作更加簡(jiǎn)便的生產(chǎn)方法[16]。CHEN Xianzhong等[7]通過(guò)分子生物學(xué)手段及發(fā)酵工藝優(yōu)化將一株野生型的大腸桿菌莽草酸產(chǎn)量提高了6.9倍(14.6 g/L)。HAWKINS RA等[17]首次報(bào)道了存在于真菌(構(gòu)巢曲霉)中的奎寧酸途徑基因簇。劉禮兵等[9]通過(guò)分子手段構(gòu)建奎寧酸合成工程菌16.4 g/L。

冠突曲霉俗稱金花菌，是茯磚茶發(fā)酵過(guò)程中的特征菌群，茶葉生產(chǎn)過(guò)程中“金花”的多少是判斷茯磚茶品質(zhì)的重要指標(biāo)，而金花指的是冠突曲霉生長(zhǎng)過(guò)程中無(wú)性階段產(chǎn)生的閉囊殼與子囊孢子[18-19]。在該菌的生長(zhǎng)過(guò)程中，可消耗毛茶中的游離氨基酸，從而降低茯磚茶的苦澀使茶湯風(fēng)味變得柔和，其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物可將兒茶素分解為茶紅素、茶褐素等從而賦予了茯磚茶獨(dú)特的色澤，但為了更好地了解并開(kāi)發(fā)該菌，需從代謝物及分子水平進(jìn)行深入研究[20-21]。本研究通過(guò)檢測(cè)冠突曲霉不同時(shí)期參與莽草酸形成相關(guān)酶的酶活及其對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示在冠突曲霉的有性生長(zhǎng)階段，隨著菌體閉囊殼的形成，aroF、quiB的酶活及其對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量均出現(xiàn)升高的趨勢(shì)，表明aroF代表的莽草酸途徑與quiB代表的奎寧酸途徑隨著菌體閉囊殼的形成逐漸活躍，在閉囊殼形成階段最為活躍；在無(wú)性生長(zhǎng)階段，隨著菌體的生長(zhǎng)及分生孢子的形成，aroF、quiB、aroD的酶活均顯著下降，且其對(duì)應(yīng)的aroF、quiB、aroD基因的表達(dá)量均也呈下降(P<0.05)趨勢(shì)，表明莽草酸途徑與奎寧酸途徑在冠突曲霉無(wú)性階段逐漸不活躍，說(shuō)明隨著無(wú)性發(fā)育的不斷進(jìn)行，莽草酸及奎寧酸途徑逐漸被抑制。

相關(guān)性分析表明，aroF(R2=0.431)和aroD(R2=0.057)的基因表達(dá)量與對(duì)應(yīng)酶酶活的變化在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中相關(guān)性較弱，而quiB(R2=0.910)基因表達(dá)量與對(duì)應(yīng)的酶活性變化相關(guān)性較強(qiáng)。值得注意的是，aroD酶在有性階段的酶活與其對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量之間并不呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)，可能原因是由于酶的活性僅代表當(dāng)前酶促反應(yīng)的快慢強(qiáng)弱，而相對(duì)表達(dá)量代表了該基因的轉(zhuǎn)錄活性，酶活的大小并不能代表基因表達(dá)量的高低。aroF和aroD基因表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)酶的酶活變化相關(guān)性較弱，但quiB基因表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)酶的酶活變化相關(guān)性較強(qiáng)，說(shuō)明quiB基因相比于aroF和aroD基因轉(zhuǎn)錄后所受到的調(diào)控及其他影響較小，酶活與對(duì)應(yīng)基因相對(duì)表達(dá)量的變化較一致。有意思的是：aroF與aroD酶活的相關(guān)性(R2=0.859)較強(qiáng)，而aroF與quiB的酶活的相關(guān)性(R2=0.489)較弱，但aroF與aroD基因表達(dá)量之間的相關(guān)性較弱(R2=0.156)，aroF與quiB基因表達(dá)量之間的相關(guān)性較強(qiáng)(R2=0.933)，而具體原因需進(jìn)一步探討。本研究揭示了冠突曲霉中不同生長(zhǎng)階段莽草酸、奎寧酸途徑的運(yùn)行情況變化，以期為下一步對(duì)該菌株在分子水平上的開(kāi)發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。