孟 艷，盧倩倩，劉小愿，王亞秀，張學(xué)芬，和禹廷，張妮南，高京草，張魯剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100)

大白菜屬于十字花科蕓薹屬蔬菜，異花授粉，天然雜交率高，是雜種優(yōu)勢(shì)比較明顯的作物。大白菜在中國(guó)栽培歷史悠久，適應(yīng)性強(qiáng)，全國(guó)各地廣泛種植，由于大白菜栽培地域性強(qiáng)、各地消費(fèi)習(xí)慣不同，因此各地不同的育種團(tuán)隊(duì)根據(jù)不同的育種方向培育了各具特色的大白菜種質(zhì)資源。對(duì)大白菜自交系進(jìn)行多樣性分析和類群劃分，在合理選配親本，構(gòu)建大白菜雜種優(yōu)勢(shì)群，及預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)有著重要意義。

近年來(lái)分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展為自交系類群的劃分提供了新的分子方法，使劃分結(jié)果更準(zhǔn)確。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP等分子標(biāo)記分別對(duì)親緣關(guān)系明確的玉米材料進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群劃分[1]，所得結(jié)果與系譜資料基本吻合，在油菜、辣椒、番茄、花椰菜類、白菜等研究中均證明結(jié)果具有真實(shí)可靠性[2-8]。SSR標(biāo)記是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上的一種遺傳標(biāo)記，以多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性高、穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)的遺傳多樣性研究。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)聚類分析基于分子水平的差異，不受環(huán)境影響，結(jié)果穩(wěn)定合理。本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)西北農(nóng)林科技大學(xué)大白菜課題組選育的65份自交系材料進(jìn)行多樣性和類群劃分，為進(jìn)一步親本選配、大白菜雜種優(yōu)勢(shì)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用65份自交系材料來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院十字花科大白菜育種課題組(表1)，所有自交系均連續(xù)多代自交，性狀穩(wěn)定。用由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院大白菜課題組保存的多態(tài)性良好，平均分布在10條染色體的26對(duì)SSR引物對(duì)自交系進(jìn)行擴(kuò)增分析。引物詳細(xì)信息見隋光磊等[9]，由上海生物工程有限公司 合成。

表1 供試大白菜自交系

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取和SSR多態(tài)性鑒定 每個(gè)自交系各選取5個(gè)單株，選取健康自交系的嫩葉0.5 g，用改良的CTAB法[10]提取基因組DNA，用1 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量與濃度(NanoDrop2000c)，稀釋至100 ng/μL，保存于4 ℃，用于PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系體積為10 μL體系。擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物4 ℃保存，利用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電壓 200 V，電流 100 mA，時(shí)間 1.5 h。電泳結(jié)束之后，使用簡(jiǎn)易銀染法顯色觀察[11]。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì) SSR標(biāo)記根據(jù)電泳圖譜在相同遷移位置上有帶者記為1，無(wú)帶者記為0，建立0-1數(shù)據(jù)庫(kù)。POPGENE1.32統(tǒng)計(jì)觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)，計(jì)算Nei基因多樣性指數(shù)(H)及Shannon多樣性信息指數(shù)(H＇)。利用NTSYS2.1軟件中的SHAN程序中的非加權(quán)平均法(UPGMA)對(duì)65自交系材料進(jìn)行聚類分析。用SPSS 20.0對(duì)表型性狀進(jìn)行聚類分析及一致性分析[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多樣性分析

26對(duì)引物對(duì)65份自交系材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出85條帶，每對(duì)引物擴(kuò)出2～5條帶，多態(tài)性位點(diǎn)條帶處在100～400 bp之間。通過(guò)POPGENE 1.32軟件分析，得到表2結(jié)果。65份自交系材料的平均觀測(cè)等位基因數(shù)為3.192 3，平均有效等位基因數(shù)為2.299 1，有效等位基因比例為72.02%。統(tǒng)計(jì)分析表明，平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.541 5，平均Shannon多態(tài)性指數(shù)為 0.913 5，都反映出供試材料較高的遺傳多樣性。

表2 大白菜自交系SSR標(biāo)記多樣性分析

2.2 SSR分子標(biāo)記聚類結(jié)果分析

根據(jù)SSR標(biāo)記聚類結(jié)果如圖1，在相似系數(shù)0.5處，65份自交系共聚成5大類群：第Ⅰ類包括35份材料，包括19份不育系、9份保持系及7份橙色材料，其中保持系06J30、15S1094及不育系18BC2、18BC5、18BC6、18BC9、18BC11為橙色材料，這類橙色材料表型以疊抱、頭球形和筒形為主，其余材料包括兩份紫心材料14S838及18BC36，表型為疊抱筒形，19份白色材料表型為疊抱和舒心，頭球和筒形；類群Ⅰ在0.52處可劃分為2個(gè)亞群，亞群Ⅰ包括28份材料：8份保持系及20份不育系材料、亞群Ⅱ包括7份橙色材料；第Ⅱ類包括9份炮彈形材料，18S460、18S469為高樁舒心晚熟材料，其余7份為中矮樁合抱材料；第Ⅲ類僅有18S121、18S501表型表現(xiàn)為中高樁、黃心長(zhǎng)炮彈形材料；第Ⅳ類群包括11份材料，其中包括5份橙色疊抱頭球形近筒形材料和6份黃心舒心筒形或頭球形材料；第Ⅴ類包括8份材料，除18S421為黃心炮彈形，其余7份為橙色、球形及頭球形材料。

65份材料中包括26份橙色材料，分布在類群Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ，材料類型比較豐富，球形有球形、頭球形、筒形，抱合類型有疊抱、合抱，以及5份橙色不育材料和2份橙色保持系。

2.3 SSR標(biāo)記聚類與表型性狀聚類一致性分析

為了了解大白菜種質(zhì)資源SSR標(biāo)記與表型性狀間相關(guān)性，將其中37份大白菜自交系的SSR標(biāo)記和23個(gè)表型性狀分別進(jìn)行聚類(圖2)，聚類表型性狀包括：雄蕊育性、株型、茸毛密度、葉球顏色、結(jié)球形狀、球內(nèi)顏色、中肋顏色、中心柱形狀、抱合類型、頂部形狀、毛重、凈重、株高、株幅、外葉數(shù)、外葉長(zhǎng)、外葉寬、中肋長(zhǎng)、中肋寬、球高、球?qū)挕⑶騼?nèi)葉數(shù)、中心柱長(zhǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表型聚類和SSR標(biāo)記聚類均將37份材料劃分為2大類群，表型性狀聚類在相似距離7處進(jìn)一步劃分4個(gè)亞群，SSR標(biāo)記在0.49處同樣劃分為4個(gè)亞群。兩種聚類方法劃分的類群Ⅰ、類群Ⅳ組分基本相同且保持系15S1094和不育系18BC5、18BC6均聚類在類群Ⅲ。17S62、17S64、17S81、17S104、17S430、17S623、17S775、17S781、17S810、17S958、17S967這11個(gè)橙色材料在兩種聚類方法中均集中在類群Ⅱ、Ⅲ，但是組分分布差異較大，在查詢系譜來(lái)源發(fā)現(xiàn)17S62和17S64來(lái)源相同，17S104和17S958來(lái)源相同，17S430、17S623、17S810來(lái)源相同，對(duì)比發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確地將系譜來(lái)源相同的材料聚類在一起。利用Kappa檢驗(yàn)兩種聚類方法的一致性為0.459,表明兩種聚類結(jié)果一致性為中度。

3 討 論

3.1 橙色大白菜遺傳分析

球色研究一直是育種家們關(guān)注的熱點(diǎn)，現(xiàn)已有白色、淺黃、橙色、紫色等大白菜[13]，本研究中使用的自交系材料包括橙色、紫色、白色和淺黃大白菜，利用SSR標(biāo)記聚類發(fā)現(xiàn)橙色材料主要被劃分為三個(gè)類群，分別為橙色筒形為主、橙色頭球形為主和橙色頭球近筒形為主。對(duì)橙色大白菜進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，橙色大白菜主要為筒形材料，頭球形和球形次之，缺乏橙色炮彈形材料，抱合類型僅有疊抱和合抱兩種類型，花色以橙色和黃色花為主，株型以半直立為主，平展材料次之，葉色為綠色和淺綠色。表明橙色大白菜自交系種質(zhì)資源比較豐富，對(duì)今后橙色大白菜選育有一定指導(dǎo)意義。

3.2 基于SSR標(biāo)記分析大白菜多樣性

我國(guó)大白菜種質(zhì)資源豐富，遺傳背景復(fù)雜，育種學(xué)家們一直加強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)群劃分及雜優(yōu)模式研究，管曉雨[14]、劉何[15]、原靜云等[16]均進(jìn)行了大白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性及優(yōu)勢(shì)群劃分研究。SSR標(biāo)記是常用于遺傳多樣分析方法之一，具有多態(tài)性好、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。SSR標(biāo)記方法在玉米[17]、水稻[18]等作物中已被證明可以準(zhǔn)確的將不知系譜來(lái)源的自交系準(zhǔn)確的劃分到相應(yīng)的種質(zhì)類群，普遍用于辣椒[4]、番茄[5]、白菜[19-20]等作物的自交系類群劃分，目前已是大白菜種質(zhì)資源研究中利用最廣泛分子標(biāo)記之一。本研究采用26對(duì)多態(tài)性良好的引物對(duì)65份大白菜自交系進(jìn)行遺傳背景和親緣關(guān)系分析，將65份大白菜自交系劃分為5個(gè)類群，通過(guò)查閱部分材料的系譜，發(fā)現(xiàn)基于SSR標(biāo)記聚類可以將系譜來(lái)源相同的材料劃分在同一類群，表明SSR標(biāo)記可以真實(shí)的反映出65份大白菜自交系間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

基于表型性狀分析是傳統(tǒng)的劃分自交系材料類群的方法，表型性狀統(tǒng)計(jì)成本低，但其容易受環(huán)境影響導(dǎo)致類群劃分不準(zhǔn)確。Hem等[21]在番茄上研究了表型性狀和分子標(biāo)記對(duì)植物種質(zhì)類群劃分在提高雜交組合選配的效率高低，最終發(fā)現(xiàn)基于分子標(biāo)記的雜交具有更高的效率，本研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)。Zhang等[22]在食用粳稻風(fēng)味研究中發(fā)現(xiàn)風(fēng)味主要是遺傳決定，但其農(nóng)藝性狀可能和地理起源相關(guān)密切，農(nóng)藝性狀受遺傳和環(huán)境共同決定，表明利用農(nóng)藝性狀進(jìn)行多樣性分析可以作為分子標(biāo)記的補(bǔ)充證明。

本研究中的65份大白菜自交系球形有球形、頭球形、筒形、長(zhǎng)筒形和炮彈形，球內(nèi)顏色有橙色、紫色、黃色、白色，抱合類型有合抱、疊抱、舒心，表明大白菜自交系多樣性比較豐富，具有培育出各種形狀、不同大小的大白菜的潛力。利用表型性狀聚類劃分自交系類群和利用SSR標(biāo)記劃分類群一致性為中度，表明兩種方法提供的遺傳信息有所不同，這與郭守鵬等[23]在茄子中的研究結(jié)果一致。這為選配新的優(yōu)勢(shì)雜交種提供理論依據(jù)的同時(shí)，也提醒表型性狀和分子標(biāo)記提供的信息有所不同，在育種實(shí)踐中要兼顧二者。