朱海，荀順義，劉慶，單繼軍(博瑞生物醫(yī)藥泰興市有限公司，江蘇 泰州 225400)

0 引言

采用分離純化技術(shù)能夠較為快速地實現(xiàn)物質(zhì)成分分解，切實提高藥物活性。但是分離純化技術(shù)的應(yīng)用成本和技術(shù)要求較高，而不同的分離純化技術(shù)具有不同的應(yīng)用特點，具體應(yīng)用效果也存在差別，較為常見的分離純化技術(shù)包括高效液相色譜、親和色譜。

1 米卡芬凈

米卡芬凈作為一種新型抗真菌藥，最早于2002年日本開始上市，米卡芬凈作用機制獨特，本身并無腎毒性，和其他藥物一起彼此之間并不會發(fā)生相互作用，因而被廣泛應(yīng)用于治療危重患者侵襲性真菌病。自2005年美國 FDA 審批通過后，米卡芬凈的耐藥性備受關(guān)注。而米卡芬凈在臨床應(yīng)用中，對熱帶念珠菌、杜氏念珠菌、白念珠菌均具有較好的抗菌效果。米卡芬凈屬于半合成抗菌藥，中間體FR901379是合成該藥物的關(guān)鍵材料，對中間體FR901379進行微生物轉(zhuǎn)化切除，再通過化學合成反應(yīng)，與活性側(cè)鏈結(jié)合，即可獲得米卡芬凈。在米卡芬凈中間體FR901379的制備中，表現(xiàn)出流程復雜、使用材料多的特點，分離純化難度較高，難以實現(xiàn)中間體FR901379的量化生產(chǎn)，影響米卡芬凈的推廣應(yīng)用?；诏B縮工藝原理，本試驗主要運用大孔樹脂，從而直接完成發(fā)酵液產(chǎn)物的分離、富集工作，并通過使用相應(yīng)溶劑完成結(jié)晶分散，從而獲取得到高濃度的提取液，切實完成生物轉(zhuǎn)化，滿足生產(chǎn)需求，用于工業(yè)化生產(chǎn)。在試驗中，通過高效純化措施，將中間體FR901379轉(zhuǎn)變?yōu)槊卓ǚ覂舻母呒兌饶负薋R179642，以此為米卡芬凈的高效生產(chǎn)提供高質(zhì)量原材料。

2 分離純化

分離純化試驗應(yīng)用儀器包括高效液相色譜儀、水環(huán)真空泵及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；應(yīng)用材料包括中間體FR901379發(fā)酵液、大孔樹脂(型號為D312、LX-18、HZ816、LX-20等)、乙腈等。

2.1 色譜條件

事實上，色譜條件也將會直接影響到試驗分析結(jié)構(gòu)，對于本次試驗，流動相則采用乙腈∶4 g/L乙酸銨溶液 (47∶53)，將流速控制在1.0 mL/min左右，而整個色譜柱則選擇為Inertsil C 18 柱 (4.6 mm×250 mm，5 m)，柱溫始終保持在大約40 ℃[1]。如果溫度過低，將會促使流動相的粘度增加，影響后續(xù)試驗工作的展開。色譜柱的進樣量為10 μL，將色譜檢測波長設(shè)置為220 nm。

2.2 大孔樹脂的預處理

大孔樹脂是一種應(yīng)用較為廣泛的有機高分子聚合物，具有液體吸附的功能，常溫狀態(tài)下理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，但一旦將其處于可吸收溶劑很容易出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象。大孔樹脂的使用類別多樣，當技術(shù)人員展開預處理工作時，便需要準備好各種型號的樹脂，將其放置到乙醇中進行浸泡，浸泡時間大約24 h。通過浸泡，可以直接通過乙醇的作用，將大孔樹脂中的各種雜質(zhì)、色素去除。之后，再將其放置到去離子水中，添加乙醇進行洗滌，直到整個溶液并無白色渾濁現(xiàn)象出現(xiàn)，則表示大孔樹脂清理干凈。最后還需要先后將其放置到鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酸堿度。需要注意的是，整個酸堿度調(diào)節(jié)過程，鹽酸和氫氧化鈉均為規(guī)格2 mol/L、含量3倍樹脂體積、浸泡時長4 h。

2.3 發(fā)酵液預處理

發(fā)酵液經(jīng)過減壓、抽濾，獲取得到菌絲體，并在其中添加工業(yè)乙醇進行充分攪拌，浸泡時長為2 h，從而抽濾獲取得到浸提液。需要注意的是，由于提取乙醇自身濃度較高，并不利于后續(xù)展開樹脂吸附工作，這就需要工作人員能夠在發(fā)酵液中添加一定含量的去離子水進行調(diào)節(jié)，等到浸提液乙醇濃度處于40%左右后便可以完成整個發(fā)酵液的預處理工作。

2.4 樹脂靜態(tài)篩選

整個處理環(huán)節(jié)，可以將5 mL的樹脂放置到錐形瓶中，添加浸提液進行震蕩，從而達到吸附飽和的作用，進行濃度計算。過濾階段，將樹脂防治到錐形瓶中，添加100 mL的80%乙醇溶液，在室溫環(huán)境下進行充分震蕩，解吸4 h左右，從而完成解吸率的計算。其中，靜態(tài)飽和吸附量可以通過以下公式計算：

式中：c0為米卡芬凈中間體FR901379浸提液的起始濃度；ce為上清液中米卡芬凈中間體FR901379濃度；c1為解吸液中米卡芬凈中間體FR901379濃度；V0、Vt、V1則分別為浸提液體積、解吸液體積、吸附樹脂濕體積。

根據(jù)具體計算可以發(fā)現(xiàn)，對于不同類型樹脂的靜態(tài)飽和吸附量和解析率都存在差別，以D303為例，吸余液顏色為淺黃色，靜態(tài)飽和吸附量為0.6 mg/mL，解吸率達到49.8%，具有較為明顯的色素雜質(zhì)吸附作用，可以用于當做脫色樹脂。

2.5 脫色樹脂的動態(tài)篩選

對于脫色樹脂的動態(tài)篩選，則可以選擇應(yīng)用自身脫色效果較好的樹脂D303、HZ801，將其放置到具體規(guī)格為100 mL的玻璃柱中，并將流速控制在2 BV/h，從而將含 40%乙醇的浸提液上柱，進行流穿液的收集，對流穿液顏色進行對比，從而判斷樹脂脫色效果。結(jié)果表明，對于D303 樹脂，當流穿液處于 40 BV時，整體脫色效果較好，而當處于50 BV時，顏色將會再次變成黃色，到了80 BV，脫色效果最差，樹脂呈現(xiàn)為褐色。

2.6 樹脂的動態(tài)吸附試驗

2.6.1 動態(tài)吸附

對于已經(jīng)經(jīng)過前期處理的 LX-18 樹脂，可以直接將其放置到規(guī)格為100 mL的玻璃柱中，并將米卡芬凈中間體FR901379脫色液直接進行上柱動態(tài)吸附，整體流速需要控制在2 BV/h，從而結(jié)合流出液信息，獲取LX-18 樹脂的動態(tài)吸附情況。通常而言，對于前10 BV的流出液，可以直接按照集中收集的原則進行裝瓶，后10 BV的流出液，則可以按照單獨收集的原則，每1 BV流出液就需要將其單獨裝入到一個玻璃瓶。進而測定濃度，從而發(fā)現(xiàn)，當對濃度處于0.8 mg/mL 的米卡芬凈中間體FR901379脫色液展開動態(tài)吸附，流出液上樣量達到 15 BV，整體開始出現(xiàn)泄漏情況，而當流出液上樣量達到18 BV，流出液濃度和上樣液濃度基本趨同，表明樹脂動態(tài)吸附處于飽和狀態(tài)。

2.6.2 吸附流速

將已經(jīng)經(jīng)過前期預處理的 LX-18 樹脂再分別裝入到5個玻璃柱中，玻璃柱容積為100 mL。從而將動態(tài)篩選中獲取得到的米卡芬凈中間體FR901379脫色液上樣吸附，并將5根玻璃柱設(shè)置為不同的流速，按照每200 mL的含量，進行流出液的收集，進而檢測濃度，計算泄漏率，獲取最佳吸附流速[2]。

結(jié)果根據(jù)試驗表明，隨著上柱流速的提高，泄漏率也會相應(yīng)提高，隨著上柱流速的下降，泄漏率也會相應(yīng)降低，進而達到理想的吸附效果。事實上，對于米卡芬凈中間體FR901379，整個樹脂吸附過程均可以被看做是一個穩(wěn)態(tài)過程，所以無論溶質(zhì)在怎樣的環(huán)境完成擴散和吸附，均需要相應(yīng)的傳質(zhì)時間，速度則變成把控吸附率的重要因素。需要注意的是，隨著降低上柱流速能夠降低泄漏率，但當流速過慢時，也會嚴重影響整個生產(chǎn)周期，促使雜質(zhì)增加，起到適得其反的效果。一般來講，可以將吸附流速控制在 1.5 ～ 2 BV/h范圍內(nèi)。

2.6.3 吸附條件

同時選擇 D303 樹脂柱、 LX-18 樹脂柱，具體規(guī)格為50 mL、100 mL，將二者串聯(lián)，將流速控制在2 BV/h，從而完成上樣吸附。當出口濃度約為上樣濃度的10%左右，則初步判斷樹脂吸附已達到飽和狀態(tài)。按照2 BV/h的流速，用水將樹脂柱清洗干凈，特別是殘留料液，避免料液影響整個解吸效果。

之后，直接斷開D303 樹脂柱，并通過不同濃度的乙醇溶液進行LX-18樹脂柱的吸附，解吸流速控制在0.5 BV/h，從而按照分瓶收集的原則進行解吸液收集。應(yīng)用 HPLC 法，并將所有濃度超過 0.2 mg/mL 的解吸液進行綜合處理，完成解吸率的計算。通過計算發(fā)現(xiàn)，當乙醇濃度為40%時，就可以將樹脂柱中多余色素清理干凈，但是清理效果有限；當乙醇濃度為60%時，解吸率達到71.5%，但是色素清理效果一般；當乙醇濃度為70%時，解吸率為85.7%，拖尾嚴重，當乙醇濃度為80%時，HPLC純度達到80.2%，解吸率為93.1%，整體解吸效果最好[3]。

2.7 選擇結(jié)晶溶劑

在解吸處理后，對溶液進行減壓濃縮處理，直到溶液濃縮為固體；再使用200 mg/mL 的80%乙醇溶液溶解固體，將溶液濃度劃分為3份，并分別添加異丙醚析晶、乙酸乙酯、丙酮，添加量為溶解液的8～10倍體積，將潔凈液冷卻放置24 h，要求冷卻溫度控制在2～8 ℃，冷卻后進行抽濾干燥處理，可獲得中間體FR901379的粗粉產(chǎn)品，通過HPLC法進行產(chǎn)品濃度檢測，從而發(fā)現(xiàn)將丙酮作為分散結(jié)晶的溶劑結(jié)晶收率較好，為81.4%，異丙醚析晶的結(jié)晶收率為70.2%，乙酸乙酯的結(jié)晶收率為66.3%，均低于丙酮。

2.8 試驗驗證

基于上述試驗獲取得到的分離純化條件，對吸附樹脂 LX-18 分瓶展開工藝驗證，設(shè)置三種不同濃度的浸提液與解吸液，從而檢測發(fā)現(xiàn)，提取總收率始終大于70%，能夠完成理想的分離純化生產(chǎn)效果。就此，在米卡芬凈生產(chǎn)中，可利用疊縮工藝進行中間體FR901379的分離純化，提高中間體FR901379的總收率，實現(xiàn)米卡芬凈生產(chǎn)的降本增效目的，可在實際生產(chǎn)中推廣普及。

3 結(jié)語

綜上所述，對米卡芬凈中間體FR901379的分離純化技術(shù)展開分析具有至關(guān)重要的意義。通過試驗發(fā)現(xiàn)，選擇濃度80%的乙醇、丙酮分別作解吸劑、結(jié)晶溶劑，并將吸附流速控制在1.5 ～ 2 BV/h范圍，能夠取得理想的分離純化效果。