俞士勇， 彭 歡， 王化愷， 駱 洋， 項洪剛*

1.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院普通外科，上海 201299 2.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科，上海 200127

結直腸癌發(fā)病率及致死率在全球居高不下[1]。早期結直腸癌患者多無特殊癥狀，或僅有腹痛、排便習慣改變等非特異性表現。多數患者確診時已為進展期或晚期，而進展期結直腸癌患者術后由于易復發(fā)和轉移，預后相對較差[2]。因此，探索結直腸癌患者的早期診斷和預后判斷十分重要。臨床上主要通過影像學檢查、消化內鏡及病理檢查診斷結直腸腫瘤，而分子標志物應用相對較少。借助分子基因技術，在微觀層面上研究結直腸癌的發(fā)生發(fā)展越來越被重視。

Rab蛋白是小GTP蛋白酶，其相對分子量為20 000～30 000，存在于大多真核細胞內與膜相關細胞器中[3]。Rab27是Rab蛋白主要的成員之一，包含2種亞型，分別為Rab27A和Rab27B[4]。研究[5]表明，Rab27A在機體中主要作用是幫助運輸小泡聚集和靠近靶膜，進而導致外泌體釋放。細胞內的Rab27A異常表達可促進癌癥的發(fā)生及增加遠處轉移機會。例如Rab27A可促進乳腺癌的發(fā)生[6]，其過度表達與胃癌和卵巢癌的發(fā)生和轉移也密切相關[7]。目前認為，Rab27A的表達異常在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。然而，國內有關Rab27A在結直腸癌中作用的報道尚不多見。

本研究通過比較Rab27A mRNA和蛋白在結直腸癌組織和正常組織間表達水平的差異，同時分析Rab27A表達與結直腸癌患者臨床病理資料的相關性及Rab27A與結直腸癌患者預后的關系，探討其在結直腸癌診治中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2005年1月至2019年1月在上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院普通外科和上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科接受手術治療的125例結直腸癌患者的結直腸癌組織標本及臨床病理資料?；颊咴谑中g前未接受新輔助化療或其他針對腫瘤的治療，均經病理組織學檢查確診。本研究經浦東新區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會和仁濟醫(yī)院倫理委員會審核批準(prylz 2020-008)，所有患者均知情同意。

1.2 實驗試劑 TRIzol試劑盒、逆轉錄試劑盒及qPCR試劑盒購自大連寶生物工程公司。Rab27A抗體購自英國Abcam公司，GAPDH和山羊多克隆抗兔IgG購自美國Proteintech公司。

1.3 實時定量PCR(qRT-PCR) 使用TRIzol試劑盒從組織中提取RNA，根據GeneAmp PCR System 9600的說明書，逆轉錄總RNA成cDNA。逆轉錄條件：37℃，15 min；85℃，5 s。Rab27A引物：正義鏈5’-GAA GCC ATA GCA CTC GCA GAG-3’，反義鏈5’-ATG ACC ATT TGA TCG CAC CA-3’；內參GAPDH引物：正義鏈5’-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3’，反義鏈5’-GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3’。數據分析采用2-ΔΔCT法。以上實驗進行3次，取均值。

1.4 Western印跡法 結直腸癌組織和癌旁組織樣品中加入適量的裂解液，低溫離心10 min后獲取目標蛋白。將目標蛋白與蛋白上樣緩沖液混合，100℃金屬浴5 min，冷卻后即可上樣。上樣結束后電泳90 min，轉膜，封閉，孵育一抗(Rab27A, Abcam公司, 1∶1 000)。4℃過夜，第2天孵育二抗60 min。PVDF膜上均勻滴加適量發(fā)光液，ECL底物發(fā)光。

1.5 免疫組化 組織切片經二甲苯脫蠟，水化，梯度乙醇脫水后，用0.3%過氧化氫孵育15 min，微波修復15 min，自然冷卻后10%牛血清白蛋白封閉30 min，滴加PBS稀釋過的Rab27A抗體(1∶200)，4℃過夜，HRP標記的二抗孵育30 min，在顯微鏡下進行DAB顯色。最后蘇木精復染，中性樹膠封片。Rab27A染色陽性表現為棕黃色或棕褐色顆粒，主要位于細胞質中。光鏡下隨機觀察10個高倍鏡視野，記錄1 000個腫瘤細胞中陽性細胞百分比，結合著色強度，按照表1的方式進行半定量評分：每個腫瘤細胞最后得分為兩項乘積，小于4分為Rab27A低表達，大于或等于4分為Rab27A高表達。

表1 免疫組化染色計分標準

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0進行數據處理。采用t檢驗比較結直腸癌組織mRNA水平；采用χ2檢驗比較Rab27A表達水平與臨床病理數據相關性；采用Kaplan-Meier生存曲線和log-rank檢驗比較Rab27A與結直腸癌生存率的關系。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 結直腸癌組織及癌旁組織中Rab27A mRNA和蛋白表達水平差異 選取32對結直腸癌腫瘤組織和相應的癌旁組織進行qRT-PCR實驗，結果(圖1A)顯示，結直腸癌腫瘤組織中Rab27A mRNA表達水平明顯高于癌旁正常組織(P=0.001)。隨機選取其中8對結直腸癌腫瘤組織和癌旁組織進行Western印跡實驗，結果(圖1B)表明，結直腸癌腫瘤組織中Rab27A蛋白表達水平明顯高于癌旁組織。上述結果表明，Rab27A mRNA水平和蛋白水平在結直腸癌細胞中均為高表達。

圖1 Rab27A mRNA和蛋白在結直腸癌腫瘤組和癌旁組織織中的表達情況

2.2 結直腸癌組織中Rab27A表達水平與臨床特點的關系 結果(圖2)顯示：Rab27A蛋白主要表達于細胞質中，在細胞核中也少許表達；Rab27A在腫瘤組織中表達水平明顯高于癌旁組織。根據表1對Rab27A的表達進行評分，根據評分結果分為Rab27A高表達組(n=76)和Rab27A低表達組(n=49)。結果(表2)顯示，腫瘤大小和臨床分期在兩組中差異均有統計學意義(P=0.037，P=0.017)，而患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位及CEA水平在兩組中差異無統計學意義。

圖2 采用免疫組化檢測Rab27A在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達水平

表2 Rab27A高表達組與低表達組患者的臨床病理特點比較 n(%)

續(xù)表

2.3 Rab27A與結直腸癌患者預后的關系 結果(圖3)表明：Rab27A表達水平與結直腸癌患者預后可能存在相關性，即Rab27A表達水平越高，患者生存期越短。單因素分析結果(表3)表明，Rab27A表達水平、腫瘤大小及臨床分期與結直腸癌患者預后有相關性。多因素分析結果(表3)表明，Rab27A或可作為結直腸癌患者預后獨立預測分子標志物。

圖3 Rab27A表達水平與結直腸癌患者生存率關系

表3 結直腸癌患者預后單因素和多因素分析 n=125

3 討 論

以Rab家族為代表的經典小GTP蛋白在機體正常的信號轉導過程中扮演重要角色。Rab家族通過在GDP結合的非激活狀態(tài)與GTP結合的激活狀態(tài)之間的轉化，參與調控正常的生物學功能[8]。有研究[9-10]顯示，Rab家族在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著至關重要的作用，例如Rab25可通過激活Akt/GSK-3β信號通路介導上皮細胞和間葉細胞的轉化，增強胃癌細胞的侵襲能力[9]；Rab25在卵巢癌患者腫瘤組織中表達量越高，患者術后預后越差；Rab25也可作為卵巢癌術后患者的預后預測分子[10]。Rab5與胞膜上的整合素相互作用促進膜內骨架蛋白形成細胞偽足，同時腫瘤細胞提高金屬基質蛋白酶(MMP)9、MMP2等分子的分泌，加快細胞外基質的溶解，加快腫瘤細胞的擴散[11]。乳腺癌細胞中Rab8和Rab7有助于膜型金屬蛋白酶1(MT1-MMP)的分泌，而Rab7的顯性失活損害乳腺癌細胞遷移和侵襲能力[12]。

研究[13]表明，Rab27A在囊泡運輸過程中，特別是細胞外泌體的形成和分泌中發(fā)揮重要作用。外泌體在腫瘤細胞的增殖和遷移中作用顯著[14]，且是理想的腫瘤抗原標志。因此干擾Rab27A的表達可影響外泌體的分泌和生物功能，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Wang等[15]指出，Rab27A在胰腺癌細胞中表達水平異常升高，且表達量越高，患者預后越差，提示其可作為胰腺癌預后的預測分子。另有研究[16]指出，Rab27A通過促進胰島素樣生長因子2(IGF-2)的分泌，可增強乳腺癌細胞侵襲和遠處轉移能力，使乳腺癌患者預后更差。Chang等[17]指出，miRNA-134-3能通過降低Rab27A的表達來抑制卵巢癌細胞的增殖和周期，從而抑制腫瘤細胞的發(fā)生。Rab27A還與血管生成相關，抑制其表達會降低血管內皮生長因子受體1(VEGF-1)的棕櫚酰化，從而減弱VEGF-1穩(wěn)定性，使血管新生增加[18]。

本研究發(fā)現結直腸癌組織中Rab27A mRNA和蛋白較癌旁正常組織表達明顯增高。免疫組織化學法結果也提示結直腸癌組織中存在Rab27A高表達現象。Rab27A蛋白與結直腸癌臨床分期及腫瘤大小正相關，提示Rab27A可能參與腫瘤的分化及生長過程。單因素分析表明，Rab27A表達水平升高與結直腸癌總體生存期相關；多因素分析表明，Rab27A的表達水平升高是結直腸癌的危險因素，提示在結直腸癌診斷治療中，Rab27A可作為一種新的潛在預后標志物。

本研究存在一定局限性：病例數所限，且常規(guī)將腫瘤臨床分期分2組進行初步比較，而Ⅳ期腫瘤與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期腫瘤的在生物學行為、診斷、治療及預后等多有不同，未來將對此進行改進。

綜上所述，本研究表明，Rab27A與結腸直腸癌發(fā)生發(fā)展有較強相關性，可作為潛在預后預測分子進行深入研究，或可成為結直腸癌診治的一個新靶點。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。