李 偉， 盧莉莉， 肖淑秀， 白金金， 王志明， 程莉莎， 宋正清， 吳偉忠， 周宇紅,*

1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200032 2. 復旦大學附屬中山醫(yī)院生物治療中心，上海 200032 3. 復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廈門 361015

腫瘤發(fā)生、發(fā)展與機體免疫功能失調(diào)密切相關。腫瘤免疫逃逸是腫瘤十大特征之一[1]，不僅調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而且影響腫瘤細胞對免疫治療的應答。體外擴增的自體T細胞過繼免疫治療對實體惡性腫瘤有一定的臨床療效[2-3]。但這種療法也有不足之處，如過繼轉(zhuǎn)移的T細胞不能充分遷移進入腫瘤微環(huán)境、過繼轉(zhuǎn)移T細胞功能持久性較差等。免疫治療的療效還依賴于腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫調(diào)節(jié)細胞的相互作用，進入實體瘤內(nèi)部的T細胞會受到腫瘤微環(huán)境中各種免疫抑制調(diào)節(jié)細胞，如骨髓來源抑制細胞(MDSCs)、調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)、細胞因子，以及免疫抑制分子程序性死亡因子-1(PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)等的影響，從而限制其殺傷功能。因此，調(diào)節(jié)腫瘤患者免疫抑制微環(huán)境，使用解除免疫抑制的藥物，更好地發(fā)揮T細胞的功能，是很好的聯(lián)合治療策略。

過繼轉(zhuǎn)移的T細胞表達PD-1等免疫檢查點受體。與PD-1低表達的過繼轉(zhuǎn)移T細胞相比，PD-1高表達的T細胞產(chǎn)生較少的效應細胞因子，如γ干擾素(IFN-γ)。此外，過繼轉(zhuǎn)移的T細胞不能充分遷移到腫瘤微環(huán)境中，且功能低下，阻斷PD-1可增加過繼轉(zhuǎn)移的T細胞向腫瘤部位遷移[4]。本研究的前期體外細胞實驗結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)IL-2、IL-15誘導的體外擴增培養(yǎng)T細胞67.1%的殺傷效應相比，加入PD-1單抗孵育刺激后的T細胞殺傷功能增強到79.4%，而增殖功能無明顯改變。因此，我們將這種T細胞命名為“新型T細胞”。目前PD-1單抗孵育刺激的新型T淋巴細胞治療仍缺少相關臨床實踐數(shù)據(jù)。因此，本研究擬探討PD-1單抗、IL-2以及IL-15誘導的新型自體T細胞治療實體腫瘤的效果及安全性，為后續(xù)臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年3月至2020年12月復旦大學附屬中山醫(yī)院收治的經(jīng)病理學確診的晚期實體腫瘤患者10例，探討新型T細胞單獨使用或聯(lián)合標準治療的療效與安全性。本研究經(jīng)復旦大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(B2017-089R2)。研究分為2個隊列，隊列1(n=3)：標準治療失敗后的晚期實體腫瘤患者，入組后單獨使用新型T細胞免疫治療；隊列2(n=7)：晚期實體腫瘤患者，在接受臨床標準治療(包括但不限于化療、PD-1/PD-L1單抗、靶向治療等)的同時聯(lián)合新型T細胞免疫治療。

1.2 細胞制備及回輸 患者簽署知情同意書，篩選合格后，進行細胞制備。細胞制備時間約2周。第0天：進行細胞單采，單采前需要停止化療至少1周，停用粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)至少2周。每個療程需采集患者外周靜脈血60 mL或進行外周血單細胞采集，獲得至少1.0×109個細胞。進行細胞計數(shù)、細胞活力檢測，加入血清替代物、IL-15、CD3/CD28 磁珠鋪板。第2天：加入血清替代物、IL-2、IL-15繼續(xù)培養(yǎng)。第3～7天：用含有IL-2、IL-15、血清替代物的培養(yǎng)基半量換液、擴大培養(yǎng)，加入20 μg/mL PD-1單抗(pembrolizumab)。第8天：去除舊磁珠，加入新磁珠，期間進行活細胞計數(shù)、細菌培養(yǎng)，檢測支原體、內(nèi)毒素、細胞表型。第9～12天：用含有IL-2、IL-15、血清替代物的培養(yǎng)基半量換液、擴大培養(yǎng)。第13天：去除磁珠、轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)袋，抽取部分細胞完成終產(chǎn)品質(zhì)量控制，進行細胞有效性(包括活力、計數(shù)以及表型及功能)測定及細胞安全性檢測(細菌、支原體、內(nèi)毒素)測定，確認達標后可進行回輸?；剌敿毎麆┝繛?.0×109個起，每3天1次，3～4次為1個療程，1個療程總細胞輸注劑量為 6.0×109～8.0×109個。

1.3 隨訪評估 研究的主要終點指標為安全性，即28 d內(nèi)細胞治療相關不良反應發(fā)生率及嚴重程度(根據(jù)CTCAE 4.03評估)；次要終點指標為療效，包括EORTC QLQ-C30 (Version 3)生活質(zhì)量調(diào)查問卷評價生活質(zhì)量(quality of life，QOL)與無進展生存(progression free survival，PFS)。其他指標包括回輸細胞活力、患者免疫功能變化。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 結(jié)果(表1)顯示：10例患者年齡46～73歲，中位年齡56歲，男性患者9例、女性患者1例。其中腸道腫瘤5例、肝細胞肝癌3例、胰腺癌1例和肺癌1例。

表1 入組患者基本情況

在腫瘤控制方面，隊列1中3例患者均在治療8周復查評估時出現(xiàn)腫瘤進展；隊列2的7例患者治療后8周時疾病控制率(disease control rate，DCR)達到85.7%(6/7)。隊列2中有5例(71.4%)疾病控制良好，至隨訪結(jié)束，未見腫瘤進展證據(jù)；另2例為多線治療失敗后晚期腫瘤，雖采用了積極的聯(lián)合治療，但最終結(jié)局不佳。其中1例患者(編號2-1) 治療后CA19-9下降明顯，但8周時疾病進展；另1例肺癌患者(編號2-3)，治療8周后腫瘤縮小，但之后迅速進展，PFS僅3個月。

2.2 T細胞鑒定 在回輸細胞中，新型T細胞活力平均達85.6%(78.6%～96.6%)；T細胞(CD3+)純度平均達到93.6%(75.7%～99.7%)，其中輔助T細胞群(CD3+CD4+)比例平均為36.9%，細胞毒性T細胞群(CD3+CD8+)比例平均達48.0%(16.3%～75.9%)。

2.3 療效及安全性

2.3.1 主要指標 結(jié)果(表2)顯示：在細胞輸注后28 d內(nèi)，未發(fā)生與細胞治療有關的嚴重(≥3級)不良事件。常見的輸注相關不良反應為發(fā)熱(20%)，2例患者第1次輸注后出現(xiàn)1級發(fā)熱，自行消退。

表2 患者治療相關不良反應發(fā)生率 n(%)

2.3.2 次要指標 生活質(zhì)量調(diào)查問卷調(diào)查結(jié)果(表3)顯示，細胞免疫治療后，患者軀體功能、總體健康狀況、疲倦改善較為明顯(P<0.05)。

表3 治療前后患者的EORTC QLQ-C30(Version 3)生活質(zhì)量評分

2.3.3 探索性指標 檢測7例患者治療前后外周血中免疫細胞亞群，發(fā)現(xiàn)在治療有效的5例患者(編號2-2、2-4、2-5、2-6、2-7)中，外周血CD4+CD25+Treg比例相對較低，治療前為(1.66±0.57)%、治療后28 d為(1.68±0.68)%；另2例治療無效的患者(編號2-1、2-3)治療前后Treg均處于較高水平，治療前為(3.04±0.43)%，治療后28 d為(3.62±0.28)%。2組治療后28 d CD4+CD25+Treg水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)。

3 討 論

過繼性細胞免疫治療是指通過輸注自身或同種特異性或非特異性“抗腫瘤免疫效應細胞”，直接殺傷腫瘤細胞或改善提高機體免疫功能來治療腫瘤的方法。細胞因子誘導的殺傷(cytokine induced killer，CIK)是過繼性細胞治療之一，是將人外周血單個核細胞在體外與多種細胞因子共培育而獲得的一群異質(zhì)性細胞。其中，CD3+CD56+細胞為主要效應細胞，既具有T淋巴細胞強大殺傷活性，也具有自然殺傷細胞殺傷時的非主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性[5]。CIK治療已在肝癌、肺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中開展，顯示出一定的療效[6-9]，但在實體瘤中的療效缺乏持久性[10]。

近年來，免疫檢查點抑制劑(以PD-1單抗為代表)和過繼免疫T細胞(包括CAR-T、自體體外擴增T細胞)治療成為腫瘤免疫治療的兩大免疫治療方法[11]。單用PD-1抗體在實體腫瘤中客觀反應率很少超過20%[12]。而過繼免疫T細胞在實體腫瘤的治療中的問題主要有：(1)腫瘤微環(huán)境中過繼免疫T細胞的浸潤數(shù)量不足；(2)腫瘤微環(huán)境中多種具有免疫調(diào)節(jié)活性的酶表達上調(diào)，如吲哚胺 2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)等，導致T細胞活化不足和T細胞抑制，使T細胞抗腫瘤效應不能持久；(3)輸注的腫瘤特異性T細胞會上調(diào)PD-1等共抑制受體，而腫瘤細胞可通過T細胞活化介導的輔助性T細胞1(helper T cell 1，Th1)細胞因子的釋放產(chǎn)生PD-L1等共抑制配體，從而產(chǎn)生免疫抑制[13-14]。近期研究[15-16]采用聯(lián)合免疫檢查點抑制劑、工程改造免疫細胞等方法，使其拮抗腫瘤微環(huán)境中的抑制信號，進而增強過繼細胞治療療效。其中，PD-L1與T細胞上的受體PD-1相互作用，在免疫應答的負性調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[17-18]。在NK細胞的擴增中加入PD-1抗體能夠增強其對骨髓瘤細胞的殺傷能力[19]。一項Ⅰ期臨床研究[20]采用體外經(jīng)派姆單抗(pembrolizumab)處理的DC-CIK 治療既往治療失敗的晚期實體瘤，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的抗腫瘤活性，總體疾病控制率可達64.5%。

本研究的新型T細胞優(yōu)化策略是自外周血獲取T細胞，予以T細胞刺激，并擴大培養(yǎng)，同時采用PD-1單抗與T細胞共孵育，封閉T細胞表面的PD-L1受體，獲得殺傷功能提高的T淋巴細胞(PD-1單抗激活的新型T淋巴細胞)。該新型T細胞具有以下優(yōu)勢：對惡性腫瘤細胞的天然識別性，同時可拮抗腫瘤微環(huán)境中主要抑制性信號(腫瘤細胞表達的PD-L1)。本研究結(jié)果證實了新型T細胞治療的安全性，且患者生活質(zhì)量在治療后有明顯提高。

在腫瘤控制方面，單用新型T細胞治療療效不佳，可能是因為這部分難治性患者腫瘤微環(huán)境處于高度免疫抑制狀態(tài)，即使回輸?shù)腡細胞進行了PD-1抗體的誘導培養(yǎng)，也難以逆轉(zhuǎn)其免疫抑制狀態(tài)。新型T細胞治療聯(lián)合標準治療則療效較為滿意。

本研究進一步分析顯示，Treg高表達可能是抗腫瘤免疫治療療效不佳的原因之一。Treg是一群特殊的具有免疫抑制功能的T細胞亞群。在腫瘤形成過程中，Treg細胞能保護腫瘤組織免受免疫系統(tǒng)的清除，促進腫瘤生長。Treg能通過膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)通路保護腫瘤細胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊，進而影響免疫治療療效[21]。

綜上所述，新型T細胞治療較為安全，治療后患者生活質(zhì)量改善，聯(lián)合標準治療顯示出較滿意的療效。在完成新型T細胞臨床安全性、耐受性及療效評價的基礎上，可進一步通過檢測相關預測指標(如Treg)，優(yōu)選治療人群，進而探索新型T細胞聯(lián)合治療方案在腫瘤治療各階段的可行性。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。