亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        PROX1通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展

        2021-11-15 07:58:02敖永強(qiáng)張領(lǐng)先丁建勇蔣家好
        中國臨床醫(yī)學(xué) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱孵育標(biāo)志物

        高 健, 敖永強(qiáng), 張領(lǐng)先, 王 帥, 丁建勇*, 蔣家好*

        1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科,上海 230032 2. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸心外科,南昌 330006

        肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤,同時也是腫瘤相關(guān)死亡的首要原因,每年約造成200萬例患者死亡[1]。臨床上通常把肺癌分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其中NSCLC約占85%[2]。盡管近幾年肺癌的診斷和治療方法取得很大進(jìn)步,但由于其早期轉(zhuǎn)移和高復(fù)發(fā)率,患者的5年生存率只有約20%[3-4]。因此,尋找準(zhǔn)確可靠的標(biāo)志物對于肺癌的早期診斷和治療,以及改善患者預(yù)后具有重要意義。

        轉(zhuǎn)錄因子Prospero同源框1(Prospero-related homeobox 1,PROX1)是果蠅Prospero的同源物,可調(diào)節(jié)多種器官的發(fā)育[5]。最近的研究[6-10]表明,PROX1在多種腫瘤中發(fā)揮作用,但在不同類型的腫瘤中,其對腫瘤生物學(xué)行為的影響具有較大差異。PROX1在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤中發(fā)揮抑制作用,而在結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中發(fā)揮促癌作用。然而,PROX1在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用以及對預(yù)后的影響仍不清楚。本研究將進(jìn)一步探究PROX1對NSCLC生物學(xué)行為的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 研究樣本 收集2014年6月至2015年7月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受標(biāo)準(zhǔn)的108例肺葉切除術(shù)和縱隔淋巴結(jié)清掃術(shù)患者的108對NSCLC腫瘤和相應(yīng)的癌旁組織,用于制作組織芯片?;颊呦嚓P(guān)臨床病理資料均從復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院數(shù)據(jù)庫中獲得,最后一次隨訪時間為2020年5月。本研究已通過復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會審查(Y2019-187),所有患者均知情并簽署知情同意書。

        1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞購買于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,培養(yǎng)條件:DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗,于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。病毒轉(zhuǎn)染:PROX1敲減的慢病毒由上海吉滿生物公司合成。敲減的序列:shPROX1-1為5′-TTT CCA GGA GCA ACC ATA ATT- 3′; shPROX1-2為5′-GGC TCT CCT TGT CGC TCA TAA- 3′。轉(zhuǎn)染時將細(xì)胞重懸計數(shù)后以2×105個/孔的密度鋪在6孔板內(nèi),放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,然后加入含有1×106TU/mL病毒的培養(yǎng)基3 mL,再加入5 μg/mL的polybrene,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后倒掉培養(yǎng)基,加入新的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測PROX1蛋白表達(dá)情況。

        1.3 免疫組化染色 組織芯片由上海芯超公司制作完成,組織芯片于60℃烘烤3 h,用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脫蠟后,用梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)水化。后用過氧化氫孵育30 min,檸檬酸鈉修復(fù)高火15 min,山羊血清封閉1 h后加入PROX1一抗(1∶500,Abcam公司,英國),4℃過夜后用辣根過氧化物酶孵育1 h后DAB染色,顯微鏡觀察染色深度至合適時終止顯色。蘇木精復(fù)染40 s,水洗20 min,然后逆乙醇梯度脫水,二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ各浸泡5 min后晾干,中性樹脂封片。免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn):染色強(qiáng)度(0,未染色;1,輕度染色;2,中度染色,3,強(qiáng)染色)以及染色密度(1,≤25%;2,26%~50%;3,51%~75%;4,>75%)。最終評分為染色強(qiáng)度+染色密度,得分≥4被定義為PROX1高表達(dá)組,得分≤3被定義為PROX1低表達(dá)組。

        1.4 qRT-PCR 采用碧云天RNA提取柱提取RNA后,采用NanoDrop 2000測定RNA濃度并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(翌圣生物科技股份有限公司,中國)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。溫度條件:5 min,25℃;30 min,42℃;5 min;85℃。而后使用PCR儀(Applied Biosystems)進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)條件:95℃,10 s;55~60℃,20 s;72℃,20 s,共40個循環(huán)。PROX1引物序列:F為CCC GTT ATG CCA GCT CCA ATA;R為CGT GCG TAC TTC TCC ATC TGA A。GAPDH引物序列:F為TCA GCA ATG CCT CCT GCA C; R為TGG CAT GGA CTG TGG TCA ATG。E-cadherin的引物序列:F為GAA CGC ATT GCC ACA TAC AC;R為GAA TTC GGG CTT GTT GTC AT。Vimentin的引物序列:F為TTG CCG TTG AAG CTG CTA ACT ACC;R為AAT CCT GCT CTC CTC GCC TTC C。

        1.5 Western印跡法檢測 采用RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白后,BCA法測定蛋白濃度,統(tǒng)一調(diào)整為4 μg/μL。蛋白上樣后進(jìn)行電泳(150 V,60 min),而后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(0.28 mA,1.5 h),將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,快速封閉液封閉20 min后一抗孵育(1∶1000),4℃搖晃過夜,第2天用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h,ECL發(fā)光顯影。

        1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

        1.6.1 遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸,向小室上層加入5×104個細(xì)胞,總體積為200 μL,下層加入正常培養(yǎng)基500 μL,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,后用4%多聚甲醛固定,1%結(jié)晶紫溶液染色,顯微鏡下拍照計數(shù)。

        1.6.2 侵襲實(shí)驗(yàn) 小室上層鋪入60 μL(按1∶8稀釋)基質(zhì)膠后,放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸后,向小室上層加入1×105個細(xì)胞,約200 μL,下層加入正常培養(yǎng)基500 μL,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,后用4%多聚甲醛固定,1%結(jié)晶紫溶液染色,顯微鏡下拍照計數(shù)。

        1.6.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞重懸計數(shù)后,96孔板內(nèi)每孔加入1 000個細(xì)胞,總體積為100 μL,孵育7 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,繼續(xù)37℃培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度,后每24 h測1次,連測4 d。

        2 結(jié) 果

        2.1 PROX1在NSCLC中的表達(dá) 結(jié)果(圖1)顯示:在108例NSCLC患者中,有55例(50.9%)腫瘤組織中PROX1高表達(dá),并且在腫瘤中的表達(dá)高于對應(yīng)的癌旁組織。

        圖1 PROX1在NSCLC及癌旁中的表達(dá)

        2.2 PROX1高、低表達(dá)組的一般資料分析 結(jié)果(表1)顯示:腫瘤直徑和淋巴轉(zhuǎn)移在PROX1高低表達(dá)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003、0.042),其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

        表1 PROX1高、低表達(dá)組的一般資料分析 n(%)

        2.3 PROX1高、低表達(dá)組的預(yù)后分析 結(jié)果(圖2)顯示,高表達(dá)PROX1的NSCLC患者其5年復(fù)發(fā)率高于PROX1低表達(dá)組(70.9%vs50.9%,P=0.005),而5年生存率低于PROX1低表達(dá)組(49.1%vs66%,P=0.016)。

        圖2 PROX1高表達(dá)組和低表達(dá)組的復(fù)發(fā)和生存比較的生存曲線

        2.4 NSCLC患者的預(yù)后Cox單因素和多因素分析 結(jié)果(表2、表3)顯示,淋巴轉(zhuǎn)移和PROX1的表達(dá)是影響NSCLC患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。

        表2 NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)Cox單因素和多因素分析

        表3 NSCLC患者術(shù)后生存相關(guān)Cox單因素和多因素分析

        2.5 PROX1對NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移作用 在A549細(xì)胞系中構(gòu)建了PROX1敲減模型,并且Western印跡法證實(shí)了PROX1在A549細(xì)胞系中被成功敲減(圖3A)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3B)表明,敲減PROX1后NSCLC細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(P<0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3C)表明,敲減PROX1后NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱(P<0.05)。因此,通過以上功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PROX1能夠促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

        圖3 體外驗(yàn)證敲減PROX1對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

        2.6 PROX1對NSCLC的EMT變化的影響 Western印跡法和qRT-PCR結(jié)果(圖4A、4B)表明,當(dāng)敲減A549中的PROX1后,A549中的E-鈣黏著蛋白(E-cadhein)表達(dá)明顯升高而波形蛋白(vimentin)明顯降低(P<0.001)。證實(shí)PROX1可誘導(dǎo)NSCLC的EMT變化,從而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。

        圖4 敲減PROX1后NSCLC中EMT標(biāo)志物表達(dá)的變化

        3 討 論

        目前有關(guān)PROX1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究很多[6-7, 9-10]。既往研究[11-12]顯示,PROX1在肝癌、前列腺癌等多個類型的腫瘤中促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,但是其在NSCLC中的臨床意義仍不明確,并且PROX1在NSCLC中相應(yīng)的功能和機(jī)制也有待進(jìn)一步探究。因此,本研究首次明確了PROX1在NSCLC中的功能和相關(guān)分子機(jī)制。通過對NSCLC患者的組織芯片進(jìn)行PROX1免疫組化染色發(fā)現(xiàn),在部分NSCLC患者中PROX1高表達(dá),并且高表達(dá)PROX1的NSCLC患者其生存預(yù)后較低表達(dá)組差。進(jìn)一步通過功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PROX1可以促進(jìn)NSCLC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。在機(jī)制方面發(fā)現(xiàn),EMT在PROX1參與NSCLC進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

        EMT是指從上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變[13]。既往文獻(xiàn)[14]報道,EMT在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)與纖維化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,腫瘤細(xì)胞通過EMT變化顯著增強(qiáng)了其增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)上皮細(xì)胞通過EMT獲得向周圍侵襲轉(zhuǎn)移能力的同時,細(xì)胞會部分喪失上皮標(biāo)志物,如E-鈣黏著蛋白,并獲間質(zhì)標(biāo)志物,如波形蛋白,因此這2個蛋白也是檢測腫瘤EMT變化的重要標(biāo)志物[15]。根據(jù)既往文獻(xiàn)[16]報道,EMT也是NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的重要機(jī)制,并且研究廣泛。在肝細(xì)胞肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤中已經(jīng)有很多關(guān)于PROX1通過促進(jìn)EMT促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制研究[11-12, 17],并且報道顯示,PROX1也是預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物。PROX1過表達(dá)的細(xì)胞中,波形蛋白表達(dá)升高而E-鈣黏著蛋白表達(dá)下降;當(dāng)下調(diào)PROX1的表達(dá)時,E-鈣黏著蛋白表達(dá)上調(diào)而波形蛋白表達(dá)下降[10-12,18]。這與本研究結(jié)果一致,本研究中敲減NSCLC中的PROX1時,E-鈣黏著蛋白的表達(dá)升高而波形蛋白的表達(dá)明顯下降。因此,PROX1可能通過EMT過程促進(jìn)NSCLC的增殖、遷移和侵襲。

        綜上所述,PROX1的表達(dá)與NSCLC的惡性程度相關(guān),高表達(dá)PROX1的NSCLC患者預(yù)后更差,PROX1主要通過EMT促進(jìn)NSCLC的進(jìn)展。PROX1可能作為判斷NSCLC預(yù)后的可靠預(yù)測因子,同時也是潛在的治療靶點(diǎn)。

        利益沖突:所有作者聲明不存在利益沖突。

        猜你喜歡
        培養(yǎng)箱孵育標(biāo)志物
        嬰兒培養(yǎng)箱的質(zhì)控辦法及設(shè)計改良探討
        微生物培養(yǎng)箱的選購與管理
        食品工程(2020年3期)2020-01-05 14:38:16
        三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
        中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
        Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
        基于模糊PID參數(shù)自整定的細(xì)胞培養(yǎng)箱溫度控制算法
        大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
        中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
        膿毒癥早期診斷標(biāo)志物的回顧及研究進(jìn)展
        冠狀動脈疾病的生物學(xué)標(biāo)志物
        腫瘤標(biāo)志物在消化系統(tǒng)腫瘤早期診斷中的應(yīng)用
        MR-proANP:一種新型心力衰竭診斷標(biāo)志物
        精品国产亚洲av成人一区| 成人欧美一区二区三区1314| 亚洲高清中文字幕视频| 18禁裸男晨勃露j毛网站| 亚洲欧美日韩综合久久| 亚洲午夜久久久久中文字幕久| 国产精品国产自线拍免费| 日本顶级片一区二区三区 | 涩涩鲁精品亚洲一区二区 | 精品人伦一区二区三区蜜桃麻豆| 少妇激情一区二区三区| 日韩亚洲精品中文字幕在线观看| 国产ww久久久久久久久久| 欧美另类在线视频| 国产乱人伦真实精品视频| 亚洲综合偷拍一区二区| 国语对白精品在线观看| 久久久中文久久久无码| 亚洲av无码成人精品区在线观看| 污污污国产免费网站| av免费观看在线网站| 午夜被窝精品国产亚洲av香蕉 | 国产午夜激无码av毛片| 亚洲在战AV极品无码| 日韩av天堂一区二区| 亚洲中文字幕无码中文字在线| 九九视频免费| 久久综合老鸭窝色综合久久| 欧美国产激情18| 亚洲欧美在线观看| 无码国产亚洲日韩国精品视频一区二区三区 | 野外亲子乱子伦视频丶| 日韩国产欧美视频| 一区二区三区精品婷婷| 亚洲午夜久久久精品影院| 丰满人妻被中出中文字幕| 狼色在线精品影视免费播放| 中文字幕在线乱码av| 性裸交a片一区二区三区| 色综合久久综合欧美综合图片 | 亚洲一区二区三区免费的视频|