王歡 周文濤 劉嘉馨 王紅

腎移植是治療終末期腎病的首選方法[1]。隨著全球腎衰竭患者數(shù)量的增加，腎臟供需差距不斷擴大，供腎短缺使人們將視線轉(zhuǎn)向了邊緣供者，如心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD）供者和擴大標準供者（expanded criteria donor，ECD）[2-3]。在腎移植過程中，腎臟必然會發(fā)生一定程度的缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI），不僅會嚴重影響移植腎的早期功能，也不利于受者長期存活。此外，從邊緣供者獲取的供腎對IRI更為敏感，更易發(fā)生遲發(fā)性病變或功能障礙，影響受者預后[4-6]。因此，在腎移植過程中，采用有效的器官修復和保存技術(shù)是保證移植成功的重要前提。傳統(tǒng)冷保存是目前臨床上最常用的一種保存和運輸器官的方法，但采用該方法對供器官進行長時間保存會導致組織損傷，增加器官功能評估難度，降低器官修復機會[7]。因此，器官保存技術(shù)亟待改善。

目前，缺血或缺氧是造成器官保存困難的原因之一，由于缺乏血液供應，器官在保存過程中因缺氧等原因?qū)е沦|(zhì)量逐漸下降[8-10]。因此，為器官保存過程提供足夠的氧氣具有重要意義。目前使用的機械灌注方法，如低溫機械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）、常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）以及仍處于動物及臨床前研究階段的亞常溫機械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）和控制性攜氧復溫（controlled oxygenated rewarming，COR）灌注等可攜帶部分氧氣進入器官，在器官保存和移植方面已經(jīng)取得了一定的成效[11]。有研究表明，與器官保存液相比，采用血液保存器官更符合生理條件，保存效果更佳，但由于血液臨床應用的局限性使人們轉(zhuǎn)向?qū)ρ踺d體的研究[12-13]。初步研究顯示，血紅蛋白類氧載體（hemoglobin-based oxygen carrier，HBOC）可以提高組織氧合程度并改善異體移植物的功能[14-15]。本文通過對目前供腎保存的現(xiàn)狀、供腎保存過程中的損傷機制以及HBOC在腎移植中的應用進行總結(jié)與展望，為器官移植的相關(guān)研究和臨床應用提供新的視角。

1 供腎保存的研究現(xiàn)狀

供腎保存的主要目標是減輕損傷。雖然靜態(tài)冷保存仍是首選保存方式，但在臨床前研究中，機械灌注在供腎保存上顯現(xiàn)出一系列更有益的效果，部分保存方式正逐漸應用于臨床工作中，而氧氣的加入在減輕IRI、提高供腎質(zhì)量、改善受者預后方面發(fā)揮著重要作用。

1.1 傳統(tǒng)冷保存

傳統(tǒng)冷保存是目前臨床常用的器官保存方式，其通過營造低溫環(huán)境來降低器官新陳代謝，并相應地減少氧氣需求。然而，研究表明，即使將溫度控制在4 ℃，腎臟的代謝率仍保持在10%左右，細胞仍然需要氧氣來維持基本代謝，導致離體腎臟能承受的缺血時間有限[16]。腎臟儲存時間越長，氧氣缺乏越嚴重，移植后再灌注損傷的程度就越重，而提供氧氣可以幫助線粒體再合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），延緩損傷過程。因此，研究如何在保存過程中為腎臟提供足夠的氧氣具有重要意義。

1.2 機械灌注保存

機械灌注通過控制性灌流來維持內(nèi)皮細胞功能。在內(nèi)皮一氧化氮合酶作用下，內(nèi)皮細胞釋放血管舒張因子——一氧化氮來擴張血管，調(diào)節(jié)血液流動，改善腎臟皮層微循環(huán)[17]。有研究表明，HMP（4～6 ℃）通過將低溫與體外機械灌注相結(jié)合的方式，在改善腎移植預后方面具有一定效果[15]。Darius等[18]研究發(fā)現(xiàn)，從腎臟獲取到移植期間，在HMP過程中持續(xù)給氧可以更好地調(diào)節(jié)腎臟血流狀況，改善早期移植物功能。NMP（35～38 ℃）是一種在生理條件下灌注器官以維持其代謝活性的方法。Nicholson等[19]研究發(fā)現(xiàn)，與靜態(tài)冷保存相比，短時間（1～2 h）的NMP可以更快恢復缺血腎臟功能，減少腎移植后不良反應的發(fā)生，改善受者預后。SNMP（20～34 ℃）是介于HMP和NMP之間的一種保存方式，Shonaka等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在SNMP期間，用HBOC灌注能夠增加供器官氧氣消耗，改善氧代謝。COR灌注（8～20 ℃）是一種將灌注液溫度逐漸升高的器官灌注方法，其目的是減少對移植物的損傷，改善再灌注后的細胞功能。Minor等[21]研究發(fā)現(xiàn)，冷保存后進行COR灌注能夠更好地恢復腎功能，降低細胞凋亡程度。

1.3 氧氣輸送保存

氧氣輸送保存的方法可與靜態(tài)冷保存或機械灌注同時使用以改善供腎質(zhì)量。在供腎保存過程中，氧氣可以通過各種技術(shù)輸送，常用方式有輸注氧合灌注液或全氟碳化合物（per fluorocarbon，PFC）、高壓氧灌注、逆行氧灌注等[8]。研究表明，在腎臟遭受熱或冷缺血損傷后，這些氧氣輸送方式有助于恢復細胞ATP水平[9]。Flatmark等[22]發(fā)現(xiàn)，離體腎臟經(jīng)氧合灌注后再進行移植，移植腎功能可迅速恢復。Kalenski等[23]比較了離體DCD豬腎在氧合灌注和冷保存下保存24 h后的腎功能狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧合灌注較冷保存更有利于維持腎功能。雖然氧氣輸送在一定程度上改善了器官保存質(zhì)量，但在保存過程中，腎臟內(nèi)的實際含氧量以及耗氧量不能確定。此外，高壓氧灌注等方式難以保證氧氣在器官中的合理分布，在沒有IRI的情況下，過度氧合對腎臟可能沒有好處，過多的氧氣供應反而會造成進一步的損傷。因此，必須注意灌注氧量，以適當平衡缺氧時ATP的產(chǎn)生和氧化應激的發(fā)展為目標[24]。使用氧載體適當緩沖氧氣攝入，并保證其在整個器官中擴散是解決問題的方法之一。

2 供腎保存過程中損傷的機制

供者類型對器官的質(zhì)量和器官對低溫的耐受能力有著關(guān)鍵的影響[24]。在供腎保存過程中，低溫和缺氧會造成離子失衡和細胞損傷，導致腎臟代謝功能障礙；再灌注后，在保存過程中損傷的基礎(chǔ)上，自由基產(chǎn)生導致膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷，與炎癥和免疫反應等共同作用，誘導細胞死亡[17,25-26]。

腎組織氧合是由動脈血中的氧、細胞消耗的氧以及動脈-靜脈氧分流所共同決定的。在人體中，腎臟的耗氧量僅次于心臟。生理條件下，流向腎皮質(zhì)的血液中所含的氧主要用于腎小球的濾過和腎小管的重吸收，相比之下，腎髓質(zhì)的血流量較低，主要用于維持腎內(nèi)的滲透壓梯度以增加尿液濃度[24,27]。在供腎保存過程中，血液流動被暫時阻塞導致腎臟缺血缺氧，從而嚴重影響腎臟細胞的生理。

供腎在保存過程中的損傷機制大多與IRI相關(guān)，主要包括氧自由基增多、抗氧化酶系統(tǒng)失調(diào)、細胞內(nèi)鈣離子超載、中性粒細胞激活和一氧化氮合酶激活等，它們相互影響，共同導致腎損傷[17,25,28]。腎移植后，人體血流刺激腎臟產(chǎn)生氧自由基，引起腎臟細胞膜脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷，進而加重細胞死亡，造成腎損傷。內(nèi)皮細胞和微血管是IRI的關(guān)鍵靶點，對缺氧環(huán)境高度敏感。腎組織缺氧后，與缺血性損傷相關(guān)的缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）信號通路受損，HIF-1α產(chǎn)生增加[9,29]。目前，HIF依賴的信號通路和HIF脯氨酸羥化酶是缺血性疾病藥理干預的靶點之一[24]，通過直接提供氧氣可能更容易防止該途徑的激活。

3 血紅蛋白類氧載體在腎移植中的應用

紅細胞是一種良好的天然氧載體，可以用于器官保存。但由于血液供應緊張，且存在配型不合和潛在病原體等問題，無法在器官保存中廣泛應用[30]。為此，人們將目光轉(zhuǎn)向一類具備攜氧、擴容、無病原體感染、無需配型、能夠長期保存等特點的血液替代品，即人工合成的氧載體[31-32]。2019年，Vrselja等[33]發(fā)表在《Nature》的一項研究發(fā)現(xiàn)，用HBOC-201進行氧氣輸送可以恢復離體豬腦的血液循環(huán)，并使其在離體狀態(tài)下維持正常的細胞代謝及神經(jīng)活動長達36 h，證明了HBOC對離體豬腦的保護作用，引起了研究者們對氧載體的廣泛關(guān)注。在器官保存方面，目前研究的氧載體主要有PFC類氧載體和HBOC[34]。PFC是一種具有很高攜氧能力的惰性化合物，其釋放氧氣的過程不受溫度影響，能夠創(chuàng)造一個高度含氧的環(huán)境。有研究顯示，雖然PFC能夠通過提供氧氣促進器官產(chǎn)生足量的ATP，維持器官基本代謝功能，但PFC所攜帶的氧氣是否能夠通過密度更高的器官或組織釋放，目前仍廣受質(zhì)疑[35]。研究發(fā)現(xiàn)，在供腎保存方面，PFC在大鼠模型中能夠降低血清肌酐水平，減少腎組織損傷，提高大鼠存活率；但應用于豬模型時，與使用現(xiàn)有威斯康星大學保存液（University of Wisconsin solution，UW液）相比，用PFC保存的腎臟表現(xiàn)出炎癥增加，內(nèi)皮損傷以及腎功能降低[36-37]。此外，由于PFC單一的攜、釋氧特性，其在器官保存中的應用有限。

HBOC是一類經(jīng)過修飾的人或動物源性血紅蛋白的產(chǎn)物，具有為人體組織器官輸送氧氣的功能，由于沒有細胞膜，其攜氧、釋氧效率遠高于紅細胞[32]。此外，HBOC具有流變學優(yōu)勢，可以更好地維持微血管血流量和組織氧合。在器官保存方面，HBOC的應用能夠改善離體器官缺血缺氧的狀態(tài)，為進一步改善離體器官質(zhì)量、提高移植成功率提供了可能。在供腎保存方面，目前研究主要集中在HBOC-201和M101，其他HBOC在供腎保存方面的研究還處于起步階段[24,38]。目前，國內(nèi)外多個團隊以海洋蠕蟲、牛血和過期人血等不同原料制備HBOC，通過靜態(tài)冷保存或機械灌注對大鼠、豬等動物的不同器官進行保存，均取得了一定的效果（表1）[12,20,38-47]。

表1 HBOC在器官保存中的應用的文獻報道Table 1 Literature reports on the application of HBOC in organ preservation

3.1 HBOC-201在腎移植中的應用

HBOC-201是用戊二醛做交聯(lián)劑，通過分子內(nèi)和分子間交聯(lián)形成的聚合牛血紅蛋白溶液，平均相對分子質(zhì)量為250。與人血紅蛋白[血紅蛋白氧飽和度為50%時的氧分壓（P50）=27 mmHg，10 mmHg=1.33 kPa]相比，HBOC-201具有較低的氧親和力（P50=38 mmHg），能夠有效向組織供氧。HBOC-201分別于2001年和2011年在南非和俄羅斯獲準用于急性貧血的治療[48]。

在器官保存方面，HBOC-201目前主要用于肝臟和腎臟的臨床前研究。在肝移植模型中發(fā)現(xiàn)，HBOC-201的SNMP有助于快速減輕炎癥反應，從而更好地恢復術(shù)后移植物功能。在常溫條件下，用HBOC-201代替紅細胞和新鮮冰凍血漿灌注肝臟，能夠有效減輕肝損傷[38]。這些發(fā)現(xiàn)推動了HBOC-201在其他器官保存方面的研究。

在腎移植中，研究顯示HBOC-201是一種良好的血液替代品。Aburawi等[12]在腎臟NMP試驗中，通過監(jiān)測腎動脈阻力、能量儲存以及組織學表現(xiàn)等情況，發(fā)現(xiàn)與濃縮紅細胞相比，HBOC-201并未引起額外的損傷，可以作為血液替代品用于器官保存。在亞常溫條件下，Bhattacharjee等[39]發(fā)現(xiàn)腎臟在熱缺血30 min后，用保存液沖洗并用HBOC-201進行靜態(tài)冷保存或機械灌注保存腎臟4 h，與用血液保存腎臟相比，二者的氧飽和度沒有顯著差異；再灌注時，兩組腎臟具有相似的腎血流量和功能，表明HBOC-201是一種能夠替代血液的良好氧載體。從低溫到常溫的逐漸復溫灌注是一種新的灌注方式，在4～7 ℃的溫度范圍內(nèi)HBOC-201是否可以在腎臟復溫期間使用，需要進一步的研究。Mahboub等[40]將HBOC-201應用于大鼠腎臟逐漸復溫灌注中，發(fā)現(xiàn)HBOC-201組表現(xiàn)出較好的腎功能、腎小球濾過率和鈉重吸收率，并且復溫后腎功能恢復更好。器官保存是一個多因素共同影響的復雜過程，從氧氣供應方面，相關(guān)研究均展現(xiàn)了HBOC-201在器官保存方面的可行性，但在不同器官和不同保存條件下的保存效果以及移植后器官功能恢復情況仍有待研究。

3.2 M101在供腎保存中的研究

M101是從海洋蠕蟲中分離出來的一種高分子量（相對分子質(zhì)量3 600 ）的生物聚合物，具有很高的氧結(jié)合能力，飽和時可攜帶156個氧分子（人血紅蛋白飽和時可攜帶4個氧分子）。它能夠梯度釋放氧氣，并具有超氧化物歧化酶樣活性，可防止?jié)撛谟泻Φ难t素相關(guān)自由基產(chǎn)生和血紅蛋白降解產(chǎn)物釋放。在器官保存液中加入M101可為缺氧環(huán)境提供適量的氧氣，防止組織中氧含量下降[41,49]。

在腎臟、肺臟、心臟等器官移植的臨床前模型中，研究表明M101能改善各類器官質(zhì)量、功能和預后[42-44]。在供腎保存方面，將M101用于豬腎近端腎小管細胞（LLC-PK1細胞）的靜態(tài)冷保存中發(fā)現(xiàn)，加入一定劑量的M101能提高細胞活力。在使用冷保存方式保存的豬腎自體移植模型中，M101的加入提高了腎功能恢復的速度，降低了腎臟炎癥水平，并維持腎組織結(jié)構(gòu)完整性[41]。Kaminski等[46]發(fā)現(xiàn)，在冷保存條件下，M101改善了腎臟的長期功能；在機械灌注條件下，M101可以同時改善腎臟短期和長期功能并維持組織完整性，減緩腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮的進程。此外，研究純氧與M101對豬腎移植的影響發(fā)現(xiàn)，在機械灌注條件下，無論是否添加純氧，補充M101均有助于移植腎功能的恢復，減少移植后不良反應的發(fā)生[45]。目前的研究表明，在不同保存方式下加入M101對供腎保存均有良好效果，部分研究已進入臨床研究階段。將M101作為器官保存液添加劑的 60 例腎移植安全性研究（NCT02652520，https://clinicaltrials.gov/）證實，使用M101是安全的，并能顯著減少移植物功能延遲恢復（delayed graft function，DGF）的發(fā)生，縮短腎功能恢復時間。另一項將M101作為氧載體添加到供腎保存液中用于終末期腎病患者腎移植的研究（NCT04181710，https://clinicaltrials.gov/），以觀察M101 作為標準器官保存溶液的添加劑用于預防腎移植術(shù)后DGF的效果為主要目的，目前已進入臨床Ⅱ期研究，有望在臨床器官移植中盡早應用。

4 展 望

在腎移植研究方面，HBOC能夠有效進行攜氧、釋氧，以滿足器官保存的需求，其中HBOC-201和M101均有良好的效果。在器官保存中，保存方式、氧合策略和溫度選擇等多種因素影響器官的保存質(zhì)量，缺氧或氧過載均不利于器官保存。HBOC從一定程度上解決了供腎保存過程中的缺氧損傷問題，為進一步改善心、肝、肺等其他器官的保存效果提供了可能。在后續(xù)研究中，將HBOC與不同保存方式相結(jié)合，研究合適的劑量范圍、不同P50的HBOC制品對不同器官的保存效果等，建立更加有效的保存方式，為不同供者確定具體方案，包括對供者和器官進行準確評估，以便充分利用供者器官。已有研究報道，在器官獲取、保存與移植的全過程中，無缺血器官移植技術(shù)不中斷器官血流，能夠有效避免IRI的發(fā)生，最大程度地改善移植預后[50]，這也為HBOC的應用提供了新機遇。同時，隨著技術(shù)的不斷改進，深入研究HBOC在器官保存和修復方面的效用及相關(guān)作用機制，通過合理的方式對其進行動態(tài)干預，優(yōu)化氧合溫度等因素在器官保存中的作用條件，為建立器官移植庫提供了可能。