袁強(qiáng) 申開文 張瑞波 王強(qiáng) 吳玉婷 沈俊

腎缺血-再灌注損傷（ischemic-reperfusion injury，IRI）是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，常見于腎移植手術(shù)，是影響腎移植受者術(shù)后恢復(fù)的主要因素之一[1-2]。炎癥反應(yīng)作為IRI主要發(fā)病機(jī)制之一，對于IRI導(dǎo)致的腎損傷具有重要意義。腎移植作為終末期腎病的重要治療方式之一，可明顯改善終末期腎病患者的生活質(zhì)量。因此，通過減輕腎IRI中相關(guān)炎癥反應(yīng)，對于腎移植受者具有重要意義。然而，目前仍然缺乏通過減輕炎癥反應(yīng)治療腎IRI的有效途徑。研究表明，NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）-1 前體蛋白共同參與NLRP3炎癥小體的組成，與炎癥反應(yīng)息息相關(guān)[3-4]。

青蒿琥酯作為由青蒿素衍生而來的水溶性半合成化合物，除具有強(qiáng)大的抗瘧疾功效，還具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[5-8]。近年來，因其顯著的抗炎作用逐漸引起關(guān)注，有研究表明青蒿琥酯對于炎癥具有積極的治療作用[7-8]。目前仍缺乏青蒿琥酯在腎IRI中作用的相關(guān)報(bào)道，本研究旨在探討青蒿琥酯對大鼠腎IRI的影響及其機(jī)制，為促進(jìn)臨床腎移植受者術(shù)后恢復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量200～220 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。大鼠于40%～70%濕度、溫度20～26 ℃、晝夜12 h明暗交替、自由飲水和進(jìn)食條件下飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)獲得貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2001317）。

青蒿琥酯購于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，NLRP3炎癥小體抑制劑INF39購于美國Selleck生物科技有限公司，蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液購于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司，高碘酸購于汕頭西隴化工廠有限公司，堿性品紅購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（serum creatinine，Scr）測定試劑盒購于蘇州格銳思生物科技有限公司，血清白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司。

免疫組織化學(xué)（免疫組化）抗體：IL-1β一抗購于美國GeneTex公司，二抗購于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。免疫熒光抗體：Gasdermin D（GSDMD）一抗購于武漢愛博泰克（ABclonal）生物科技有限公司公司，NLRP3一抗購于江蘇親科（Affinity Biosciences）生物研究中心有限公司，Caspase-1一抗購于美國Santa Cruz公司，二抗購于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。蛋白質(zhì)印跡抗體：腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）-1一抗購于美國ThermoFisher公司，NLRP3、GSDMD、IL-1β一抗購于英國Abcam公司，Caspase-1購于江蘇親科（Affinity Biosciences）生物研究中心有限公司，二抗均購于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司。

1.2 模型建立與分組

將所有大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（Sham組）、模型組（IRI組）、低劑量青蒿琥酯組（ART-L組）、高劑量青蒿琥酯組（ART-H組）和INF39組，每組5只。建模前2 h，ART-L組和ART-H組大鼠分別腹腔注射15 mg/kg、30 mg/kg 青蒿琥酯[9]，INF39組大鼠腹腔注射7.5 mg/kg INF39[10]，IRI組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

根據(jù)大鼠的體質(zhì)量，腹膜注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進(jìn)行麻醉后，沿腹中線切開腹部，小心游離暴露雙側(cè)腎蒂后，用微動(dòng)脈瘤夾鉗夾住雙腎蒂周圍45 min后松開雙側(cè)夾鉗。通過顏色變化監(jiān)測缺血及再灌注是否成功。Sham組大鼠僅開腹游離暴露雙側(cè)腎蒂。用縫合線縫合腹部切口。手術(shù)后飼養(yǎng)24 h，對大鼠實(shí)施安樂死，收集血清和腎組織進(jìn)行分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠腎功能檢查 采用試劑盒檢測各組大鼠BUN和Scr水平。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immune absorbent assay，ELISA）試劑盒檢測各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平。

1.3.3 病理學(xué)檢查 新鮮腎組織固定于4%多聚甲醛24 h以上，脫水后包埋在石蠟中。石蠟切片脫蠟水洗后進(jìn)行HE染色和過碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色。

1.3.4 免疫組化染色 腎組織石蠟切片脫蠟后水洗，抗原修復(fù)，封閉。IL-1β一抗（1∶300）覆蓋切片4 ℃孵育過夜，洗滌后辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔二抗（1∶200）孵育，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）在顯微鏡控制下染色，用光學(xué)顯微鏡CX-21觀察和MicroPublisher獲取圖像，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色呈黃褐色為陽性染色。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法 提取各組大鼠腎組織蛋白，檢測KIM-1以及焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β的表達(dá)。一抗覆蓋聚偏氟乙烯膜4 ℃孵育過夜，洗滌后HRP偶聯(lián)的二抗孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光對印跡進(jìn)行檢測，并通過Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3.6 免疫熒光染色 腎組織石蠟切片脫蠟后水洗，抗原修復(fù)，封閉。載玻片滴加NLRP3一抗（1∶100）、Caspase-1一抗（1∶50）、GSDMD（1∶100）4 ℃孵育過夜，洗滌后熒光二抗孵育50 min，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染液孵育5 min，使用抗熒光淬滅劑封片。使用熒光顯微鏡IX51觀察和MicroPublisher獲取圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.01軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 青蒿琥酯對大鼠腎IRI后腎損傷及血清學(xué)指標(biāo)的影響

各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果顯示，與Sham組比較，IRI組腎組織損傷較重，部分腎小管萎縮變性，小管上皮出現(xiàn)顆粒變性或水樣變性，細(xì)胞刷狀緣脫落，可見蛋白管型、細(xì)胞管型改變及間質(zhì)炎癥充血表現(xiàn)（圖1A）。各組大鼠腎臟組織PAS染色結(jié)果顯示，與Sham組比較，IRI組大鼠腎組織部分腎小管上皮明顯萎縮，刷狀緣脫落，腎小管可見上皮細(xì)胞空泡化改變（圖1B）。ART-L組、ART-H組及INF39組損傷較IRI組均減輕。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)Figure 1 Renal histopathological features of rats in each group

IRI組的Scr和BUN水平較Sham組升高 ；ART-L組、ART-H組和INF39組Scr、 BUN水平較IRI組均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P<0.05，圖2）。與Sham組比較，IRI組KIM-1蛋白表達(dá)水平升高；與IRI組比較，ART-L組、ART-H組及INF39組KIM-1蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P<0.05，圖3）。

圖2 各組大鼠腎功能血清學(xué)指標(biāo)Figure 2 Serum indexes of renal function of rats in each group

圖3 各組大鼠腎組織KIM-1蛋白表達(dá)水平Figure 3 The expression levels of KIM-1 protein in renal tissues of rats in each group

2.2 青蒿琥酯對大鼠腎IRI后腎組織及血清炎癥因子的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，與Sham組比較，IRI組、ART-L組、ART-H組及INF39組IL-1β表達(dá)增多；與IRI組比較，ART-L組、ART-H組和INF39組IL-1β表達(dá)均減少（圖4）。ELISA檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，IRI組、ART-L組、ART-H組及INF39組TNF-α、IL-6水平均升高；與IRI組比較，ART-L組、ART-H組和INF39組TNF-α、IL-6水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P<0.05，圖5）。

圖4 各組大鼠腎組織IL-1β的表達(dá)情況Figure 4 Expression of IL-1β in renal tissues of rats in each group

圖5 各組大鼠血清炎癥因子的水平Figure 5 The levels of inflammatory factors in serum of rats in each group

2.3 青蒿琥酯對大鼠腎IRI后腎組織焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Sham組比較，IRI組中NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表達(dá)水平均升高；與IRI組比 較，ART-L組、ART-H組 和 INF39組NLRP3、Caspase-1、GSDMD及IL-1β蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P<0.05，圖6A）。

圖6 各組大鼠腎組織焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Figure 6 Expression of pyroptosis related proteins in renal tissues of rats in each group

免疫熒光染色結(jié)果（圖6B、C）顯示，與Sham組比較，IRI組NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)均增多；與IRI組比較，ART-L組、ART-H組和INF39組NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)均減少。

3 討 論

腎IRI是一種常見的危重疾病，腎臟作為高灌注器官，對缺血缺氧十分敏感。目前，腎移植術(shù)中IRI的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸效果常不能達(dá)到理想狀態(tài)，顯著增加了受者的住院時(shí)間。腎小管上皮細(xì)胞受損及炎癥反應(yīng)在腎IRI中扮演了重要角色，可加速慢性腎病的發(fā)展[11-12]。腎IRI中相關(guān)炎癥反應(yīng)主要病理過程表現(xiàn)為間質(zhì)性炎癥。腎IRI后，腎臟近曲小管、腎小球系膜細(xì)胞等可釋放一系列促炎因子，經(jīng)過血管內(nèi)皮細(xì)胞到達(dá)損傷組織，進(jìn)一步加重?fù)p傷[13]。

腎IRI過程會(huì)發(fā)生包括細(xì)胞焦亡在內(nèi)的多種細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞焦亡作為一種近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其啟動(dòng)發(fā)生較細(xì)胞凋亡等更快，是一種受調(diào)控并同時(shí)伴有大量炎癥介質(zhì)釋放的程序性細(xì)胞死亡方式，其特征是細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜上形成孔洞和釋放促炎因子[14-15]。這一過程需要NLRP3炎癥小體和GSDMD的參與[16]。一旦發(fā)生焦亡反應(yīng)，GSDMD的N-端聚集并與脂類結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成孔洞，細(xì)胞逐漸膨脹至細(xì)胞破裂，最終使包括IL-1β在內(nèi)的大量細(xì)胞內(nèi)含物釋放，激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[17-18]。

焦亡介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了腎IRI。NLRP3炎癥小體及GSDMD在焦亡中發(fā)揮了重要作用，對于誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生至關(guān)重要，可反映炎癥反應(yīng)的程度。NLRP3炎癥小體作為腎IRI中關(guān)鍵的因素，可在多種急性和慢性腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。大量研究表明，NLRP3炎癥小體參與了腎臟炎癥反應(yīng)及腎損傷[19-22]。因此，抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)對于腎IRI的防治具有巨大的潛力。NLRP3炎癥小體在腎臟的足突細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中均可被激活，并增加相關(guān)炎癥因子的表達(dá)[23]。然而，目前對于其治療仍缺乏有效手段。本研究結(jié)果顯示，大鼠腎IRI后，炎癥因子的釋放增加，腎損傷情況加重。而經(jīng)青蒿琥酯預(yù)處理的大鼠，NLRP3炎癥小體表達(dá)減少，相關(guān)炎癥因子釋放減少，腎組織損傷得到明顯的改善，效果與INF39預(yù)處理相似，表明青蒿琥酯能夠通過抑制腎IRI后NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減輕大鼠腎損傷。

青蒿琥酯作為青蒿素的衍生物，憑借其優(yōu)越的抗炎作用被用于多種疾病的治療，效果得到了廣泛的認(rèn)可。相關(guān)研究表明，青蒿琥酯可通過減輕炎癥反應(yīng)，在心臟IRI、腦IRI及糖尿病腎病中發(fā)揮保護(hù)作用[24-27]。有研究表明，青蒿琥酯可通過抑制NLRP3炎癥小體發(fā)揮抗炎作用[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯預(yù)處理后NLRP3炎癥小體、GSDMD及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)明顯減少，表明青蒿琥酯能在腎IRI中發(fā)揮顯著的抗炎作用，減少焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及腎組織損傷。

綜上所述，青蒿琥酯可抑制NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，減少腎IRI后焦亡相關(guān)蛋白的激活及炎癥因子的釋放，減輕腎IRI。