宋偉 孫麗瑩 朱志軍 魏林 曲偉 曾志貴

膽道閉鎖是一種原因未明的、以肝內(nèi)外進(jìn)行性炎癥和纖維化為特征的罕見新生兒疾病[1]，發(fā)病率為1/12 000～1/5 000[2-3]，是最常見的小兒肝移植適應(yīng)證[4]。既往研究表明，肝病患者腸道菌群易發(fā)生紊亂，并通過“腸-肝軸”影響肝臟的結(jié)構(gòu)或功能，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程[5-8]。腸道菌群受多種因素影響[9]，如機(jī)體免疫狀態(tài)、肝移植術(shù)中的缺血-再灌注損傷、服用抗生素和益生菌等[10-11]。已有研究證明膽道閉鎖兒童的腸道菌群易發(fā)生紊亂[12]，但是肝移植對(duì)膽道閉鎖兒童腸道菌群的影響尚無研究和報(bào)道。本研究旨在探討肝移植對(duì)膽道閉鎖兒童腸道菌群的影響，為肝移植治療兒童膽道閉鎖提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

將2017年9月至2019年6月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院等待肝移植的膽道閉鎖兒童納入此次研究，通過臨床資料、血生化指標(biāo)、影像學(xué)資料及肝臟病理等確診膽道閉鎖。最終納入16例，男6例，女10例，年齡8（6，12）個(gè)月，體質(zhì)量指數(shù)為16.9（15.3，19.3）kg/m2。肝移植術(shù)后長(zhǎng)期給予免疫抑制劑治療，術(shù)后5～7 d給予抗生素預(yù)防感染。糞便樣本采集日期距離上次抗生素服用時(shí)間為136（125，140）d。健康對(duì)照組10名，男4名，女6名，年齡8（7，12）個(gè)月，體質(zhì)量指數(shù)為18.8（17.9，20.1）kg/m2。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡<3周歲；（2）樣本采集前近1個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素類藥物或胃腸動(dòng)力藥；（3）近期未患腹瀉及其它腸道疾??；（4）無全身細(xì)菌、病毒或真菌感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患其他肝臟疾病，如進(jìn)行性家族膽汁淤積癥、Alagille綜合征等；（2）近1個(gè)月內(nèi)服用乳酸菌或其他益生菌的藥物或食品；（3）近1個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)便秘或腹瀉；（4）合并其他臟器疾?。c道外），如胰腺炎、自身免疫性疾病等。

1.2 研究方法

1.2.1 腸道菌群檢測(cè) 采集符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的膽道閉鎖兒童肝移植術(shù)前糞便，4 h內(nèi)放于?80 ℃冰箱儲(chǔ)存。對(duì)患兒隨訪至術(shù)后6個(gè)月，再次采集糞便，保存方法與術(shù)前一致。采用QIAamp?Fast DNA Stool Mini試劑盒，按照說明書步驟提取糞便DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的純度和完整性，采用Qubit精確定量DNA濃度。

宏基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序：（1）在flow cell加入DNA聚合酶和4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只摻入單種堿基；（2）激光掃描芯片 flow cell表面，捕捉熒光信號(hào)，讀取每條模板序列聚合上的核苷酸種類；（3）將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3'端黏性，繼續(xù)摻入第2輪單種堿基；（4）依次統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 原始序列進(jìn)行質(zhì)控后，比對(duì)物種數(shù)據(jù)庫(kù)，分析樣品中的物種組成；組裝、基因預(yù)測(cè)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行功能注釋。應(yīng)用R語(yǔ)言對(duì)腸道菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析術(shù)前和術(shù)后腸道菌群組成、基因數(shù)量和代謝功能的改變。通過R軟件corrplot包或gplots包繪制熱圖，分析物種與環(huán)境因子之間的關(guān)系。

1.2.3 肝功能檢查 收集并整理患兒肝移植術(shù)前及術(shù)后的肝功能指標(biāo)，包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl transferase，GGT）、 總 膽 汁 酸（total bile acid，TBA）和總膽紅素（total bilirubin，TB）。分析腸道菌群與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。

1.2.4 肝移植術(shù)后腸道微生物恢復(fù)程度分析 采集10名健康兒童的糞便進(jìn)行測(cè)序和比較，分析膽道閉鎖兒童肝移植術(shù)后腸道微生物的恢復(fù)程度。在整體結(jié)構(gòu)上，比較肝移植術(shù)后組與健康對(duì)照組的物種多樣性指標(biāo)，包括α多樣性和β多樣性。α多樣性采用Simpson和Shannon-Wiener指數(shù)計(jì)算，代表物種組成的豐度和均勻度。β多樣性采用PCoA分析，代表兩組樣本間物種組成的差異度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R v.3.3.1軟件包對(duì)腸道菌群進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組腸道菌群差異物種、基因及代謝通路的組成，P<0.05或錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.1為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用線性判別分析效應(yīng)值（linear discrimin analysis effect size，LEfSe）分析肝移植術(shù)后組與健康對(duì)照組腸道菌群的差異物種：非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)檢測(cè)豐度差異特征，并找到與豐度有顯著性差異的類群，線性判別分析（linear discrimin analysis，LDA）估算每個(gè)物種豐度對(duì)差異效果影響的大小，LDA評(píng)分越高，表明差異越顯著。LDA評(píng)分臨界值為2.0，LDA>2.0代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)不同樣本間基因、肝功能指標(biāo)與腸道微生物間的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

人口統(tǒng)計(jì)學(xué)基本特征及臨床資料采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，比較采用符號(hào)秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝移植術(shù)后腸道菌群物種結(jié)構(gòu)及功能組成的改變

肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組腸道菌群有1 164個(gè)共有物種，另外有158個(gè)和344個(gè)物種分別單獨(dú)存在肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組，肝移植術(shù)后物種的數(shù)量較術(shù)前增加（圖1）。

圖1 肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組腸道菌群物種數(shù)量的韋恩圖（屬水平）Figure 1 Venn diagram of the number of intestinal micro flora species in the pre- and post-liver transplant group（genus level）

肝移植術(shù)后腸道菌群發(fā)生了明顯改變。腸桿菌（Enterobacter）、耶爾森菌（Yersinia）、摩根菌（Morganella）、沙雷菌（Serratia）等機(jī)會(huì)致病菌在肝移植術(shù)前組富集，羅斯氏菌（Roseburia）、真桿菌（Eubacterium）、布勞特氏菌（Blautia）、梭菌（Clostridium）、阿克曼氏菌（Akkermansia）等產(chǎn)短鏈脂肪酸菌在肝移植術(shù)后組富集（均為P<0.05，表1）。

表1 肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組豐度發(fā)生改變的物種（屬水平）Table 1 Species with altered abundance in the pre- and post-liver transplant group（genus level）

肝移植術(shù)后組腸道菌群基因數(shù)量較肝移植術(shù)前組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A，P<0.05）。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示同組間的腸道菌群基因呈正相關(guān)，不同組間的腸道菌群基因呈負(fù)相關(guān)（均為P<0.05，圖2B）。

圖2 肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組腸道菌群基因數(shù)量比較及相關(guān)性分析Figure 2 Comparison and correlation analysis of the number of intestinal micro flora genes in the pre- and post-liver transplant group

在功能代謝通路上，兩組菌群的代謝通路發(fā)生了明顯改變。肝移植術(shù)后組氨基酸代謝（amino acid metabolism）、脂代謝（lipid metabolism）、能量代謝（energy metabolism）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、輔助因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins）等代謝通路增強(qiáng)，而膜轉(zhuǎn)運(yùn)（membrane transport）、細(xì)菌感染（infectious diseases: bacterial）、藥物抵抗（drug resistance）、多聚糖代謝（glycan biosynthesis and metabolism）、免疫系統(tǒng)疾?。╥mmune diseases）等代謝通路減弱（圖3）。

2.2 膽道閉鎖兒童肝移植術(shù)后腸道菌群的恢復(fù)程度

與健康對(duì)照組比較，肝移植術(shù)后組腸道菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4，均為P>0.05）。但兩組間仍存在差異物種，克雷伯菌（Klebsiella）、腸球菌（Enterococcus）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae bacterium 291 EBAC）等機(jī)會(huì)致病菌和ε15樣病毒（Epsilon15likevirus）在肝移植術(shù)后組富集，糞桿菌（Faecalibacterium）、真桿菌（Eubacterium）、布勞特氏菌（Blautia）、羅斯氏菌（Ruminococcus）等腸道有益菌在健康對(duì)照組富集（圖5，均為P<0.05）。

圖3 肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組腸道菌群功能代謝通路比較Figure 3 Comparison of functional metabolic pathways of intestinal micro flora between the pre- and post-liver transplant group

圖4 肝移植術(shù)后組與健康對(duì)照組腸道菌群多樣性和菌群結(jié)構(gòu)比較Figure 4 Comparison of intestinal micro flora diversity and structure between post-liver transplant group and healthy control group

圖5 肝移植術(shù)后組與健康對(duì)照組差異物種比較Figure 5 Comparison of species between post-liver transplant group and healthy control group

2.3 肝移植改變的菌群與肝功能指標(biāo)間的關(guān)系

膽道閉鎖兒童肝移植術(shù)前組及肝移植術(shù)后組肝功能指標(biāo)結(jié)果見表2，與肝移植術(shù)前組比較，肝移植術(shù)后組肝功能指標(biāo)均呈下降趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P<0.000 1）。肝移植術(shù)后發(fā)生早期感染3例，門靜脈血栓1例，其余患者生存良好。

表2 肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組肝功能指標(biāo)比較Table 2 Comparison of liver function indexes between pre- and post-liver transplant group[M(Q25,Q75)]

腸道菌群與肝功能指標(biāo)間的Spearman相關(guān)性分析見圖6，腸道有益菌如阿克曼氏菌（Akkermansia）、羅斯氏菌（Roseburia）、真桿菌（Eubacterium）、布勞特氏菌（Blautia）、梭菌（Clostridium）等的豐度與肝功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，而機(jī)會(huì)致病菌如沙雷菌（Serratia）、腸桿菌（Enterobacter）、耶爾森菌（Yersinia）等的豐度與肝功能指標(biāo)呈正相關(guān)（均為P<0.05）。

圖6 腸道菌群與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析熱圖Figure 6 Heat map of correlation analysis between intestinal micro flora and liver function indexes

3 討 論

膽道閉鎖是新生兒膽汁淤積性肝病中最常見的病因，臨床表現(xiàn)以黃疸為主，肝移植是有效的治療手段[1,13]。既往研究表明，終末期肝病患者的腸道菌群易發(fā)生紊亂[9,14-15]，且紊亂的腸道菌群在疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[16]。本研究基于宏基因組測(cè)序技術(shù)，分析肝移植對(duì)膽道閉鎖兒童腸道菌群物種和功能組成的影響。

有研究表明，不同類型的肝病引起的腸道菌群失調(diào)普遍存在菌群多樣性下降、豐度減少的現(xiàn)象，在門、綱、目、科、屬、種的水平上菌群結(jié)構(gòu)與功能與健康對(duì)照人群相比均有顯著改變[5,17-18]。腸道和肝臟通過“腸-肝軸”相互作用和聯(lián)系，一方面，腸道細(xì)菌中的膽鹽水解酶可以將肝臟分泌的初級(jí)膽汁酸代謝為次級(jí)膽汁酸，進(jìn)而通過法尼醇X激活受體和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1激活初級(jí)膽汁酸的合成[19-20]；宿主和微生物的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物及外源性代謝產(chǎn)物可以為機(jī)體提供維生素、氨基酸等能量物質(zhì)并通過門靜脈系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到全身[21]。另一方面，肝臟分泌的膽汁酸可以酸化腸道環(huán)境，降低腸道內(nèi)pH值，抑制病原菌的生長(zhǎng)，維持腸道內(nèi)菌群的平衡狀態(tài)[22-23]。肝臟發(fā)生疾病后，膽汁酸分泌減少、腸道環(huán)境改變、菌群失調(diào)、厭氧菌減少、兼性厭氧菌和需氧菌增加、機(jī)會(huì)致病菌和病原菌過度增長(zhǎng)、腸道通透性增加，腸道來源的微生物通過門靜脈循環(huán)易位到肝臟，激活肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝臟損傷[19,22]。

根據(jù)菌群的特性可將腸道菌群分為3類：有益菌（如乳酸桿菌、雙歧桿菌等）、有害菌（如沙門菌、金黃色葡萄球菌等）和中間菌（大腸埃希菌、腸球菌等）。中間菌在機(jī)體免疫功能減弱時(shí)成為潛在致病菌，引起機(jī)體損害。既往有文獻(xiàn)證明肝移植可改善多種肝病的腸道菌群紊亂[24-29]，但目前尚缺乏關(guān)于膽道閉鎖患者肝移植術(shù)后腸道菌群的研究。本研究發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖終末期腸道菌群中機(jī)會(huì)致病菌更為富集，肝移植術(shù)后6個(gè)月機(jī)會(huì)致病菌豐度明顯下降，產(chǎn)短鏈脂肪酸菌豐度明顯升高。短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，乙酸能被大腦、心臟和外周組織氧化利用；丙酸可以影響肝臟和膽固醇代謝；丁酸能作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的能量來源調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡、抑制結(jié)腸炎和結(jié)腸癌、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，并能影響?zhàn)ひ簩拥慕M成[30-31]。這表明肝移植不僅可以改善膽道閉鎖患者的肝功能，還可在提高腸道菌群結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用。此外，腸道菌群的基因數(shù)量在肝移植術(shù)后顯著增加，肝移植術(shù)前和肝移植術(shù)后組內(nèi)基因之間呈正相關(guān)、不同組間基因呈負(fù)相關(guān)，表明肝移植術(shù)前組和肝移植術(shù)后組在腸道菌群功能代謝上存在差異。

本研究結(jié)果顯示，能量代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂代謝等代謝通路在肝移植術(shù)后明顯增強(qiáng)，而病原相關(guān)的代謝通路如細(xì)菌感染、免疫系統(tǒng)疾病等在肝移植術(shù)后減弱，與機(jī)會(huì)致病菌豐度在肝移植術(shù)后減少相對(duì)應(yīng)。

腸道菌群受眾多因素的影響，如抗生素和免疫抑制劑的使用、應(yīng)激（術(shù)中缺血-再灌注損傷）、益生菌的服用等。本研究中膽道閉鎖兒童肝移植術(shù)后腸道菌群雖明顯改善，但尚未達(dá)到健康兒童的水平，可能是受到免疫抑制劑和既往應(yīng)用抗生素的影響。隨著肝移植術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)及機(jī)體免疫力的恢復(fù)，膽道閉鎖兒童腸道菌群達(dá)到健康兒童水平仍需一段時(shí)間。此外，我們發(fā)現(xiàn)腸道有益菌豐度與肝功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，而機(jī)會(huì)致病菌與其呈正相關(guān)。因此益生菌的使用除了可以改善腸道菌群紊亂以外，可能間接影響肝功能。綜上所述，肝移植在一定程度上可以改善膽道閉鎖兒童腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的組成。