郭暉

1 移植心臟病理學(xué)研究的簡(jiǎn)史

1.1 國(guó)際移植心臟病理學(xué)研究的簡(jiǎn)史

自20世紀(jì)初以來(lái)，研究者圍繞心臟移植中的血管吻合技術(shù)、心臟保存方法和體外循環(huán)技術(shù)等進(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，在此基礎(chǔ)上，1967年Christian Barnard在南非實(shí)施了人類首例臨床心臟移植，該受者存活了18 d。借此，Thompson對(duì)該人體首例移植心臟進(jìn)行了詳細(xì)的解剖病理學(xué)研究。隨著20世紀(jì)80年代環(huán)孢素等強(qiáng)效免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，心臟移植例數(shù)和移植心臟存活時(shí)間均顯著提升。與此同時(shí)，這一成績(jī)?cè)诤艽蟪潭壬弦惨獨(dú)w功于心內(nèi)膜心肌活組織檢查（endomyocardial biopsy，EMB）技術(shù)的建立及其在臨床心臟移植中的應(yīng)用，使得移植心臟的排斥反應(yīng)等并發(fā)癥可以得到及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷和治療。

EMB的臨床應(yīng)用取決于活組織檢查（活檢）設(shè)備的發(fā)明及其不斷改進(jìn)、完善并轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床。EMB設(shè)備最初于1962年由日本東京女子醫(yī)科大學(xué)年輕的心臟外科醫(yī)師Konno發(fā)明，其通過(guò)將可彎曲的活檢導(dǎo)管經(jīng)左前臂貴要靜脈進(jìn)入右心室或通過(guò)左側(cè)腋動(dòng)脈插入到左心室，借助導(dǎo)管前端可張合的活檢鉗口夾取心內(nèi)膜下的心肌組織標(biāo)本以供組織病理學(xué)診斷，其對(duì)5例原發(fā)性心肌病的患者共進(jìn)行了10次EMB，均得到了明確的病理學(xué)診斷且未發(fā)生活檢導(dǎo)致的不良事件，初步證明了這一方法安全可行，但這一極具臨床應(yīng)用前景的醫(yī)學(xué)發(fā)明由于當(dāng)時(shí)僅發(fā)表于日文醫(yī)學(xué)雜志，影響力有限，而且更主要是因?yàn)樽诮碳叭宋牡囊蛩?，日本?008年以前一直未開(kāi)展心臟移植，使得日本科學(xué)家的這一發(fā)明未能得到臨床應(yīng)用。直到1973年，正在美國(guó)Stanford大學(xué)醫(yī)學(xué)院從事研究工作的英國(guó)年輕外科醫(yī)師Caves受到移植腎和移植肝活檢病理學(xué)診斷排斥反應(yīng)的啟發(fā)，利用Konno活檢鉗首次在實(shí)驗(yàn)犬的心臟移植中嘗試取得心肌活檢組織，進(jìn)而與年輕的病理科醫(yī)師Margaret Billingham合作，系統(tǒng)地觀察了活檢移植心臟的病理學(xué)表現(xiàn)，進(jìn)而開(kāi)創(chuàng)了移植心臟病理學(xué)這一新的領(lǐng)域。在此基礎(chǔ)上，Caves與醫(yī)療儀器研發(fā)者Schulz合作，進(jìn)一步對(duì)Konno活檢鉗予以改進(jìn)，使其更柔軟、更安全，發(fā)明了基本定型的活檢鉗（Stanford Caves-Schultz bioptome）并沿用至今。更重要的是他開(kāi)創(chuàng)了一種經(jīng)頸內(nèi)靜脈穿刺進(jìn)行EMB的方法。由于EMB設(shè)備的日益完善、EMB經(jīng)驗(yàn)的日漸成熟，EMB迅速成為移植心臟并發(fā)癥最為準(zhǔn)確的診斷手段，包括排斥反應(yīng)在內(nèi)的移植心臟多種并發(fā)癥的病理學(xué)特征得以觀察和掌握。借此，1981年Billingham基于美國(guó)Stanford大學(xué)的經(jīng)驗(yàn)，提出了移植心臟急性排斥反應(yīng)的活檢病理學(xué)診斷與分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，為心臟移植術(shù)后并發(fā)癥的正確診斷提供了依據(jù)。相繼地，歐美其他心臟移植中心也陸續(xù)提出和應(yīng)用了各自的EMB活檢病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，但各移植中心的活檢診斷標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)繁瑣、診斷結(jié)果不一。

為提高各移植中心之間活檢病理結(jié)果的通用性，便于各移植中心之間的交流和多中心的協(xié)作研究，在借鑒淋巴瘤病理學(xué)診斷及其分類標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，1989年在國(guó)際心肺移植學(xué)會(huì)（International Society for Heart and Lung Transplantation，ISHLT）的組織下，由Billingham綜合各移植中心的診斷標(biāo)準(zhǔn)提出了移植心臟排斥反應(yīng)的ISHLT診斷及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（以下簡(jiǎn)稱“ISHLT標(biāo)準(zhǔn)”），并于1990年正式發(fā)布（1990年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)）[1]，包括無(wú)急性排斥反應(yīng)（缺乏排斥反應(yīng)組織學(xué)表現(xiàn)）、輕度排斥反應(yīng)（局灶性或彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)不伴有心肌細(xì)胞損傷）、中度排斥反應(yīng)（局灶性或彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)伴有心肌細(xì)胞損傷）和重度排斥反應(yīng)（大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)并混有中性粒細(xì)胞以及出血）。隨后Gallo等應(yīng)用ISHLT標(biāo)準(zhǔn)，回顧性地分析了1 037例次移植心臟EMB活檢病理學(xué)的診斷，驗(yàn)證了ISHLT標(biāo)準(zhǔn)具有良好的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。隨著EMB在心臟移植中的廣泛應(yīng)用，其病理學(xué)方法也得以統(tǒng)一，包括明確規(guī)定可在≥1個(gè)部位活檢取得心肌組織 ；每次活檢的心肌組織標(biāo)本數(shù)量最好有5～10粒，至少3～5粒；主要進(jìn)行光學(xué)顯微鏡（光鏡）檢查，必要時(shí)進(jìn)行電子顯微鏡（電鏡）檢查；光鏡檢查包括蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色、Masson三色染色和彈力纖維染色等。2004年ISHLT又更新并提出了新的活檢診斷體系（2004年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)），其主要針對(duì)急性排斥反應(yīng)中的細(xì)胞免疫和體液免疫兩種免疫效應(yīng)機(jī)制，除了原有的、單一的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)（acute cellular rejection，ACR）或稱為T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（T cell-mediated rejection，TCMR）類別以外，增加了急性體液性排斥反應(yīng)或稱為抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody-mediated rejection，AMR）這一特定類別，體現(xiàn)出對(duì)AMR這一主要并發(fā)癥類型的高度認(rèn)可和重視；后續(xù)于2013年進(jìn)一步對(duì)AMR深入研究，尤其是對(duì)AMR所致微血管損傷（microvascular injury，MI）或微血管炎（microvascular inflammation，MVI）病變，即心肌間毛細(xì)血管C4d陽(yáng)性沉積和心肌間毛細(xì)血管內(nèi)巨噬細(xì)胞淤積浸潤(rùn)的組織病理學(xué)特點(diǎn)予以確定，提出了2013年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)[2]。

非常有意義的是，正是受到1990年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)的啟發(fā)，1991年舉辦了首屆Banff移植病理學(xué)會(huì)議，提出了移植腎活檢病理診斷的Banff活檢病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)（以下簡(jiǎn)稱“Banff標(biāo)準(zhǔn)”），更進(jìn)而在廣泛研討的基礎(chǔ)上逐漸建立了多種移植器官活檢的Banff標(biāo)準(zhǔn)。隨著B(niǎo)anff會(huì)議研討的深入，移植心臟病理學(xué)及其診斷也成為Banff會(huì)議專題研討的主要內(nèi)容之一，在Banff會(huì)議中專門設(shè)立了移植心臟病理學(xué)的專題會(huì)場(chǎng)，主要圍繞移植心臟AMR病理學(xué)診斷及其進(jìn)展等議題進(jìn)行專題討論[3-4]。

1.2 中國(guó)移植心臟病理學(xué)研究的簡(jiǎn)史

中國(guó)首例心臟移植于1978年由張世澤等在上海瑞金醫(yī)院實(shí)施，也是亞洲首例原位心臟移植，受者存活了109 d。隨著近年來(lái)心臟移植技術(shù)的提高和公民逝世后器官捐獻(xiàn)的實(shí)施，心臟移植例數(shù)穩(wěn)步增長(zhǎng)。自2003年上海中山醫(yī)院王齊兵等率先報(bào)道了移植心臟冠狀動(dòng)脈血管?。╰ransplant coronary artery disease，TCAD）的研究病例開(kāi)始，部分心臟移植中心逐漸開(kāi)展了移植心臟的病理學(xué)研究，其中尤其是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院系統(tǒng)地開(kāi)展了大例數(shù)的移植心臟EMB和病理學(xué)研究[5-6]，良好地指導(dǎo)了臨床移植心臟并發(fā)癥的治療和管理。

2 移植心臟術(shù)后主要并發(fā)癥及其病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)

無(wú)論是單純心臟移植還是心肺聯(lián)合移植，是兒童心臟移植或是成人心臟移植，移植心臟均具有基本相同的病理組織學(xué)表現(xiàn)，這有利于我們?cè)诓煌愋偷男呐K移植術(shù)后利用EMB的組織病理學(xué)觀察診斷其術(shù)后并發(fā)癥。目前已明確，在心臟移植術(shù)后的不同階段，可以出現(xiàn)移植心臟右心室衰竭（right ventricular failure，RVF）、缺血-再灌注損傷、急性排斥反應(yīng)、“Quilty病變”、感染和以TCAD為特征的慢性排斥反應(yīng)（chronic rejection，CR）等一系列并發(fā)癥。以下結(jié)合心臟移植術(shù)后主要并發(fā)癥及其ISHLT標(biāo)準(zhǔn)予以闡述。

2.1 移植心臟右心室衰竭

移植心臟RVF主要于心臟移植術(shù)中立即發(fā)生，在未關(guān)閉胸腔前可見(jiàn)移植心臟心室收縮減弱，心室擴(kuò)張并可見(jiàn)心臟外觀因心肌間質(zhì)出血而呈暗紫色。造成這一現(xiàn)象的原因是多方面的，最常見(jiàn)的原因是肺動(dòng)脈高壓所致的肺動(dòng)脈阻力升高，這一因素可以通過(guò)移植術(shù)前對(duì)受者進(jìn)行詳盡的體檢予以排除或改善，因而目前這一因素導(dǎo)致的RVF已非常少見(jiàn)了。即便受者確實(shí)存在明顯的肺動(dòng)脈高壓，可以選擇施行心肺聯(lián)合移植。其它偶爾可導(dǎo)致移植心臟RVF的原因包括供者在捐獻(xiàn)前的緊急搶救過(guò)程中使用了大量的心肺復(fù)蘇藥物而導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能超負(fù)荷甚至衰竭。移植心臟RVF的組織病理學(xué)表現(xiàn)缺乏特異性，主要為右心室心肌組織內(nèi)彌漫性出血，有時(shí)可見(jiàn)為微血管內(nèi)纖維素樣血栓栓塞，甚至部分病例由于發(fā)展迅速而沒(méi)有明顯的組織病理學(xué)表現(xiàn)，只有結(jié)合臨床發(fā)生的時(shí)間予以綜合判斷。

2.2 移植心臟缺血-再灌注損傷

移植心臟缺血-再灌注損傷主要為心臟的缺血損傷和血管吻合再通后的再灌注損傷，其次與供者嚴(yán)重的顱腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血、兒茶酚胺的大量釋放等也有關(guān)，部分文獻(xiàn)將其籠統(tǒng)地稱為移植前損傷（pre-transplant injury），主要出現(xiàn)于術(shù)后幾周尤其是最初的3周內(nèi)。

對(duì)于缺血-再灌注損傷，移植心臟EMB表現(xiàn)為小灶狀的心肌溶解性壞死（圖1），國(guó)外文獻(xiàn)中有時(shí)稱為“心肌缺失（dropout）”，少數(shù)表現(xiàn)為心肌缺血性壞死或凝固性壞死（coagulation necrosis），也可以稱為微梗死。其可能的原因除心肌的直接缺血損傷外，心臟切取或移植過(guò)程中的微小空氣栓子所造成的微小栓塞也是一種原因。凝固性壞死的心肌細(xì)胞嗜酸性染色明顯增強(qiáng)，胞核固縮甚至消失。缺血性壞死灶內(nèi)發(fā)生完全或不完全壞死的心肌細(xì)胞固縮而與其周圍正常心肌細(xì)胞之間形成較為明顯的空隙，這在應(yīng)用Masson三色染色時(shí)尤其明顯。嚴(yán)重的缺血性損傷時(shí)還可出現(xiàn)心肌間質(zhì)內(nèi)明顯的出血。如果缺血性病變?cè)谝欢〞r(shí)間內(nèi)如1周左右，有時(shí)可見(jiàn)壞死灶周圍存在少數(shù)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，以及少許增生的肉芽組織。就單純的缺血性損傷或是移植后血液循環(huán)恢復(fù)后的缺血-再灌注損傷的精細(xì)組織學(xué)比較研究而言，前者的心肌損傷或壞死灶的部位主要位于心內(nèi)膜下心肌組織內(nèi)，而后者多見(jiàn)于深部心肌組織內(nèi)。而在實(shí)際情況中，兩者?；旌洗嬖诙y以截然分開(kāi)。對(duì)于供者的嚴(yán)重顱腦損傷、兒茶酚胺大量釋放所致的心肌細(xì)胞損傷，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞或心肌纖維斷裂、心肌細(xì)胞固縮及嗜酸性壞死，壞死心肌細(xì)胞邊緣有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 移植心臟缺血-再灌注損傷的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 1 Pathological findings of ischemia-reperfusion injury in heart allograft

2.3 升壓藥物導(dǎo)致的移植心臟損傷

在供者搶救復(fù)蘇過(guò)程中以及心臟移植術(shù)中或術(shù)后均有可能使用大量?jī)翰璺影返壬龎核幬?，由此形成術(shù)后早期階段移植心臟的升壓藥物損傷或稱為“兒茶酚胺效應(yīng)”。其EMB活檢組織中可見(jiàn)微小灶狀心肌細(xì)胞輕微變性或壞死等損傷（圖2），損傷灶內(nèi)可有極少的包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的混合性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其診斷除觀察到上述組織病理學(xué)表現(xiàn)外，還必須有兒茶酚胺等升壓藥物應(yīng)用史。這一藥物損傷與急性排斥反應(yīng)的鑒別診斷要點(diǎn)為，前者損傷灶中僅有極少數(shù)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而后者即急性排斥反應(yīng)時(shí)一般有較多的以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖2 移植心臟“兒茶酚胺效應(yīng)”的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 2 Pathological findings of catecholamine effect of the heart allograft

2.4 移植心臟排斥反應(yīng)

目前移植心臟的排斥反應(yīng)已經(jīng)明確依照排斥反應(yīng)的免疫效應(yīng)機(jī)制分為TCMR和AMR兩種類型，其EMB活檢中排斥反應(yīng)均依次進(jìn)行診斷。其中既往所謂的超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）實(shí)則是嚴(yán)重的、迅猛發(fā)生的急性AMR（acute AMR，aAMR），應(yīng)歸入AMR的診斷類別中；同時(shí)也要注意在實(shí)際的急性排斥反應(yīng)病例中，往往急性TCMR（acute TCMR，aTCMR）和aAMR伴同發(fā)生，稱為混合性排斥反應(yīng)。在此僅簡(jiǎn)要介紹HAR和混合性排斥反應(yīng)，而著重闡述aTCMR和aAMR的病理學(xué)特點(diǎn)，兩者最終將共同導(dǎo)致CR。

2.4.1 超急性排斥反應(yīng) HAR作為移植術(shù)后最嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，一旦發(fā)生常難以逆轉(zhuǎn)，所以其關(guān)鍵在于術(shù)前預(yù)防。目前因術(shù)前良好的免疫學(xué)選擇，心臟移植HAR已非常罕見(jiàn)。其致病機(jī)制為受者體內(nèi)的預(yù)存抗體（performed antibody）與移植心臟移植抗原結(jié)合后迅速激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)并活化血小板，導(dǎo)致移植心臟血管內(nèi)皮損傷及廣泛的微血栓形成，造成嚴(yán)重的血液循環(huán)障礙及心肌組織損傷。形成HAR的原因主要為供、受者ABO血型不相容或主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）抗原不匹配，也有報(bào)道是由于受者迅速產(chǎn)生了抗供者內(nèi)皮細(xì)胞等移植抗原的抗體所致，由于其主要由抗體及補(bǔ)體等參與，可見(jiàn)是一種典型的AMR。

發(fā)生HAR時(shí)，移植心臟迅速出現(xiàn)心律失常甚至搏動(dòng)消失，肉眼可見(jiàn)移植心臟迅速腫脹，顏色迅速變?yōu)榘导t色甚至暗紫色，除非立即建立心臟輔助系統(tǒng)或者馬上能獲得新供心，否則受者將難以存活。對(duì)切除的移植心臟的病理解剖學(xué)觀察可見(jiàn)心臟明顯腫大并呈出血狀外觀（圖3）。鏡下可見(jiàn)，心肌組織內(nèi)廣泛水腫、出血、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)甚至大片心肌出血性及溶解性壞死，細(xì)小血管內(nèi)有大量紅細(xì)胞淤積甚至可見(jiàn)較多的纖維素樣血栓。補(bǔ)體片段C4d的免疫熒光或免疫酶組織化學(xué)染色可協(xié)助確診。

圖3 移植心臟HAR的大體解剖學(xué)觀察Figure 3 Gross anatomical observation of hyperacute rejection of heart allograft

2.4.2 急性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng) aTCMR或稱ACR多數(shù)發(fā)生于術(shù)后3個(gè)月內(nèi)，但也可見(jiàn)于心臟移植術(shù)后長(zhǎng)期存活的受者中，尤其是長(zhǎng)期存活的受者因藥物依從性不佳，自行停用或減量免疫抑制劑，可發(fā)生嚴(yán)重的aTCMR。發(fā)生aTCMR的移植心臟，其大體標(biāo)本的肉眼觀可見(jiàn)移植心臟腫大、心室壁增厚，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)明顯的心室肌因出血而呈花斑狀、心室切面可見(jiàn)部分區(qū)域因凝固性壞死呈灰白色。移植心臟aTCMR的組織病理學(xué)改變最顯著的部位位于心室肌，尸體解剖學(xué)研究顯示兩側(cè)心室均可相同程度地被累及，這也是依據(jù)EMB對(duì)aTCMR進(jìn)行明確診斷的主要依據(jù)。

在EMB活檢組織病理學(xué)上，不同程度的aTCMR在心肌間淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及心肌損傷程度上是不同的，借此不僅可對(duì)aTCMR予以定性診斷，而且可以予以程度分級(jí)。輕微的aTCMR表現(xiàn)為少許單個(gè)核炎癥細(xì)胞（包括淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等）的微小灶狀浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)可無(wú)水腫，心肌細(xì)胞已基本正常；程度較重的aTCMR可見(jiàn)炎癥細(xì)胞呈多灶性甚至呈彌漫性浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)水腫甚至心肌細(xì)胞壞死，而aTCMR最為特征性的表現(xiàn)為冠狀動(dòng)脈分支出現(xiàn)動(dòng)脈內(nèi)膜炎，其病變包括內(nèi)膜上以單個(gè)核細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、內(nèi)膜水腫增厚甚至泡沫細(xì)胞形成，最為嚴(yán)重者導(dǎo)致動(dòng)脈管壁纖維素樣壞死。依據(jù)2004年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)[7]，aTCMR分為0～3級(jí)4個(gè)級(jí)別。

2.4.2.1 0級(jí)（無(wú)急性排斥反應(yīng)） 即移植心臟EMB活檢組織內(nèi)，鏡下無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及心肌細(xì)胞損傷等aTCMR的組織病理學(xué)改變。而在實(shí)際的情況下，有時(shí)心肌內(nèi)可見(jiàn)極個(gè)別散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)而沒(méi)有其它特征性的組織學(xué)表現(xiàn)也應(yīng)診斷為0級(jí)。因?yàn)镋MB常重復(fù)多次進(jìn)行，在前次活檢部位存在的小塊瘢痕組織內(nèi)以及心肌細(xì)胞周圍脂肪組織內(nèi)偶爾有極少許的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但心肌組織未見(jiàn)其它異常時(shí)也可診斷為0級(jí)。

2.4.2.2 1R級(jí)（輕度，低級(jí)別aTCMR） EMB活檢組織內(nèi)僅有單個(gè)的、微小局灶性的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞沒(méi)有或僅有輕微的損傷改變。其中一種表現(xiàn)為微小局灶性浸潤(rùn)的單個(gè)核細(xì)胞位于小血管旁或圍繞小血管周圍呈圍管狀浸潤(rùn)，而此時(shí)沒(méi)有心肌細(xì)胞損傷（圖4）；另一種情況為小灶狀的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的范圍較之前一種情況略大，不僅可以圍繞在小血管周圍，而且可向小血管周圍鄰近的心肌組織內(nèi)擴(kuò)展，部分文獻(xiàn)中將這一特征稱為“局灶性的彌漫浸潤(rùn)（focally diffuse in filtration）”，其可以理解為浸潤(rùn)為局限性，但部分炎癥細(xì)胞有向周圍浸潤(rùn)擴(kuò)展的趨勢(shì)。這一變化可見(jiàn)于1粒或多粒EMB活檢組織中，此時(shí)心肌細(xì)胞正?；騼H表現(xiàn)為心肌細(xì)胞腫脹。

圖4 移植心臟1R級(jí)aTCMR的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 4 Pathological findings of grade 1R aTCMR of heart allograft

2.4.2.3 2R級(jí)（中度，中間級(jí)別aTCMR） EMB活檢組織內(nèi)呈多個(gè)局灶性的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并出現(xiàn)了明顯的心肌細(xì)胞損傷改變。即在單獨(dú)1?；蚨嗔MB活檢心肌組織內(nèi)出現(xiàn)多個(gè)局灶性的、數(shù)量較多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5），有時(shí)也混有少許嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，多個(gè)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶之間仍可見(jiàn)正常的心肌組織間隔而尚未形成完全彌漫性的浸潤(rùn)，但可見(jiàn)其中炎癥侵蝕至少造成2～3處心肌細(xì)胞損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞輪廓不清似呈壞死而缺失，有時(shí)可見(jiàn)浸潤(rùn)灶內(nèi)的個(gè)別心肌細(xì)胞呈凝固性壞死。

圖5 移植心臟2R級(jí)aTCMR的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 5 Pathological findings of grade 2R aTCMR of heart allograft

2.4.2.4 3R級(jí)（重度，高級(jí)別aTCMR） EMB活檢組織內(nèi)呈彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞損傷甚至出現(xiàn)動(dòng)脈內(nèi)膜炎改變。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)累及所有的活檢組織塊，每一活檢組織塊內(nèi)的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)密集且廣泛（圖6A），炎癥細(xì)胞的種類由單一的單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘ㄖ行粤＜?xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞；多個(gè)心肌組織內(nèi)的心肌細(xì)胞壞死；如果活檢組織內(nèi)能夠取得冠狀動(dòng)脈位于心肌間的末梢分支，則可見(jiàn)明顯的動(dòng)脈內(nèi)膜炎（圖6B），甚至動(dòng)脈內(nèi)膜水腫以及管壁纖維素樣壞死改變，這是移植心臟aTCMR中程度最重的一種類型。

圖6 移植心臟3R級(jí)aTCMR的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 6 Pathological findings of grade 3R aTCMR of heart allograft

2.4.3 急性抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)

2.4.3.1 移植心臟急性抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)概述 移植心臟aAMR最初由Hammond等于1989年在EMB活檢組織中發(fā)現(xiàn)，其觀察到在缺乏明顯TCMR特征和缺血損傷改變的心肌組織下，出現(xiàn)心肌間MI、心肌間質(zhì)顯著水腫并可見(jiàn)多種類型的免疫球蛋白（immunoglobin，Ig）的陽(yáng)性沉積，且更易于進(jìn)展為CR的動(dòng)脈血管病。移植心臟aAMR的發(fā)生率隨診斷標(biāo)準(zhǔn)的不同而差異很大，在活檢后依據(jù)Ig的免疫熒光染色陽(yáng)性，其發(fā)生率高達(dá)28%～52%，采用觀察免疫熒光染色聯(lián)合微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷水腫這一指標(biāo)時(shí)，其發(fā)生率為19%，增加心功能異常指標(biāo)時(shí)則為8%～15%，而如果加上C4d染色陽(yáng)性指標(biāo)時(shí)則僅為3%[8]。

aAMR在1990年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)中即予以提出，但由于缺乏AMR的組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，既往對(duì)EMB活檢組織的冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)IgG、IgM、C1q、C3和纖維素等均缺乏診斷的特異性，直到2003年Banff會(huì)議確定了在移植腎活檢組織的AMR診斷中應(yīng)用C4d免疫組織化學(xué)染色方法，進(jìn)而將C4d染色也應(yīng)用于移植心臟AMR的活檢診斷中，促進(jìn)了其AMR診斷標(biāo)準(zhǔn)的建立。在2004年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)中明確將aAMR作為一項(xiàng)與aTCMR同等的病理學(xué)診斷類別，并嘗試單純依據(jù)組織病理學(xué)改變對(duì)其予以診斷和程度分級(jí)。2015年Banff會(huì)議是近年來(lái)對(duì)移植心臟aAMR進(jìn)行最全面的討論和總結(jié)的一屆Banff會(huì)議[9]，其明確提出移植心臟aAMR的核心病變?yōu)镸I，其特征性改變?yōu)樾募￠g毛細(xì)血管擴(kuò)張以及管腔內(nèi)可見(jiàn)活化的單個(gè)核細(xì)胞（intravascular activated mononuclear cell，IAMC）淤積浸潤(rùn)（圖7A），進(jìn)而與活檢心肌組織的C4d染色（圖7B）相結(jié)合共同體現(xiàn)了aAMR對(duì)微血管的炎癥損傷，也據(jù)此作為診斷aAMR的組織病理學(xué)依據(jù)：即>50%的毛細(xì)血管內(nèi)皮呈C4d+（無(wú)論是呈多灶性或彌漫性），或者≥10%的毛細(xì)血管腔內(nèi)有CD68+巨噬細(xì)胞淤積浸潤(rùn)。同時(shí)也為了避免單純的HE染色的局限，建議采用可以識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞的CD31或CD34和可識(shí)別巨噬細(xì)胞的CD68進(jìn)行雙重染色，以準(zhǔn)確識(shí)別毛細(xì)血管內(nèi)的巨噬細(xì)胞。同時(shí)對(duì)其后續(xù)的研究也提出了多種設(shè)想，包括：（1）希望借鑒移植腎aAMR診斷中關(guān)于腎小管周毛細(xì)血管炎（peritubular capillaritis，PTC）的量化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)IAMC予以量化評(píng)分，即通過(guò)計(jì)數(shù)毛細(xì)血管橫截面內(nèi)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞的數(shù)量對(duì)aAMR予以程度評(píng)分，并希望有更多的多中心研究予以確認(rèn)；（2）推薦經(jīng)活檢提示aAMR的心臟移植受者均必須進(jìn)行供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）監(jiān)測(cè)；（3）由于AMR機(jī)制的明確，其導(dǎo)致的移植心臟慢性失功的“CR”這一籠統(tǒng)性的術(shù)語(yǔ)不足以精確體現(xiàn)AMR的致病機(jī)制，應(yīng)考慮采用“慢性抗體相關(guān)性的移植心臟損傷（chronic antibody-associated allograft damage）”這一術(shù)語(yǔ)。

圖7 移植心臟aAMR的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 7 Pathological findings of aAMR of heart allograft

2.4.3.2 移植心臟急性抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的病理學(xué)診斷及其分級(jí) 1990年、2004年和2013年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)中陸續(xù)確認(rèn)了AMR這一病理類型，在2013年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)中依據(jù)EMB活檢的組織病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)aAMR予以診斷和分級(jí)（表1）[2]，完全基于病理學(xué)的診斷（pathology-based AMR，pAMR）和分級(jí)，其所依據(jù)的核心內(nèi)容為aAMR所致的MI病變，其病變包括兩個(gè)方面：（1）心肌間毛細(xì)血管內(nèi)巨噬細(xì)胞的淤積浸潤(rùn)，有時(shí)可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫；（2）結(jié)合C4d和（或）CD68的免疫熒光或免疫組化染色表現(xiàn)。病理學(xué)分級(jí)包括：（1）pAMR0，為組織病理學(xué)中完全未見(jiàn)MI病變和C4d染色為陰性，即未見(jiàn)任何aAMR損傷表現(xiàn)；（2）pAMR1（H+），可見(jiàn)MI的組織病理學(xué)表現(xiàn)但C4d和（或）CD68染色呈陰性；（3）pAMR1（I+），未見(jiàn)MI的組織病理學(xué)表現(xiàn)但C4d和（或）CD68染色呈陽(yáng)性；pAMR1（H+）和pAMR1（I+）均是輕微的aAMR級(jí)別；（4）pAMR2，同時(shí)具備了MI的組織病理學(xué)表現(xiàn)和C4d和（或）CD68染色陽(yáng)性，是明確的、病理學(xué)特征完整的aAMR，是中度的aAMR ；（5）pAMR3，出現(xiàn)了顯著的組織病理學(xué)損傷表現(xiàn)包括微血管內(nèi)血栓栓塞、間質(zhì)出血即間質(zhì)內(nèi)包括淋巴細(xì)胞以及混合中性粒細(xì)胞等多形核細(xì)胞浸潤(rùn)和心肌細(xì)胞壞死，也具備C4d和（或）CD68染色陽(yáng)性，是重度aAMR。在應(yīng)用這一標(biāo)準(zhǔn)對(duì)移植心臟EMB活檢組織進(jìn)行病理學(xué)診斷時(shí)，需要注意，該標(biāo)準(zhǔn)僅是單純的病理學(xué)診斷，仍然必須結(jié)合臨床心功能檢查和DSA監(jiān)測(cè)予以綜合診斷。

表1 移植心臟AMR的病理學(xué)診斷分級(jí)（2013年ISHLT標(biāo)準(zhǔn)）Table 1 Pathological diagnosis classification of AMR of heart allograft (2013 ISHLT working formulation)

2.4.4 慢性排斥反應(yīng) 既往認(rèn)為移植心臟的CR僅是細(xì)胞免疫所損傷的結(jié)果，但是隨著AMR損傷機(jī)制的明確以及這一機(jī)制的作用更為顯著，雖然目前仍未有慢性AMR（chronic AMR）這一名稱，但應(yīng)該認(rèn)識(shí)到“CR”這一名詞的內(nèi)涵已經(jīng)擴(kuò)展了。

移植心臟CR的核心病變位于冠狀動(dòng)脈尤其是其廣泛的末梢分支，形成以TCAD為特征的CR病變。TCAD病變雖然累及冠狀動(dòng)脈，但在EMB活檢細(xì)小心肌組織中，心肌間的末梢分支亦可觀察到這一病變而進(jìn)行診斷，這也體現(xiàn)出EMB對(duì)移植心臟CR也是具有診斷價(jià)值的。

2.4.4.1 移植心臟冠狀動(dòng)脈血管病概述 圍繞移植心臟CR所致冠狀動(dòng)脈血管病的名稱有多種，包括移植心臟血管?。╟ardiac allograft vasculopathy，CAV）、移植物動(dòng)脈血管病、加速性移植心臟動(dòng)脈硬化、移植心臟閉塞性動(dòng)脈血管病、移植心臟內(nèi)膜增生性疾病和TCAD等。多數(shù)文獻(xiàn)傾向于采用CAV或TCAD這一名稱[10]。雖然名稱略有不同，但其組織病理學(xué)表現(xiàn)是相同的。

移植心臟TCAD最突出的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為移植心臟冠狀動(dòng)脈血管管腔向心性狹窄、局部阻塞甚至完全閉塞，導(dǎo)致移植心臟心肌缺血及功能障礙，是心臟移植后長(zhǎng)期存活者的主要致死原因。其致病機(jī)制中，免疫損傷因素起到了關(guān)鍵作用，其中也包括移植心臟內(nèi)冠狀動(dòng)脈血管分支及其毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞所攜帶的移植抗原誘導(dǎo)受者產(chǎn)生針對(duì)性的DSA，繼而導(dǎo)致補(bǔ)體活化、細(xì)胞因子釋放、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)甚至血栓形成等體液免疫因素的損傷，這也是移植心臟的TCAD與普通冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的主要區(qū)別。在平均存活>1年的心臟移植受者中，經(jīng)EMB證實(shí)，其中93%的移植受者存在不同程度的CR表現(xiàn)，86%的移植受者存在明顯動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生的改變，92%的移植受者存在不同程度的心肌組織缺血壞死及修復(fù)后微小瘢痕灶，且29%存在持續(xù)的急性排斥反應(yīng)。Loupy等[11]結(jié)合40例切除的失功能的移植心臟及其402例次EMB的病理學(xué)觀察和抗體檢測(cè)的研究，結(jié)果顯示在47.5%的失功能的心臟移植受者體內(nèi)檢測(cè)到抗體、移植心臟術(shù)后均經(jīng)歷過(guò)未能明確診斷的亞臨床aAMR、切除移植心臟中存在AMR病變者，其MI損傷計(jì)分和血管內(nèi)皮炎計(jì)分均顯著高于無(wú)AMR的移植心臟，而且在62.1%的具備TCAD病變的切除移植心臟中均觀察到aAMR病變。這一詳細(xì)的病理學(xué)觀察明確提示AMR在移植心臟CR尤其是TCAD中發(fā)揮了關(guān)鍵的致病作用，這也是近年來(lái)部分研究者提出應(yīng)將AMR損傷因素進(jìn)一步予以凸顯，而應(yīng)稱為“慢性抗體相關(guān)性的移植心臟損傷”的原因所在。

2.4.4.2 移植心臟冠狀動(dòng)脈血管病的病理學(xué) 代表移植心臟CR的關(guān)鍵病變即TCAD為移植心臟冠狀動(dòng)脈及其分支因內(nèi)膜反復(fù)的免疫損傷導(dǎo)致內(nèi)膜增生，進(jìn)而動(dòng)脈管腔向心性狹窄，并且這一病變彌漫性地累及幾乎所有冠狀動(dòng)脈分支。這一病變與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變有明顯的區(qū)別， 后者通常表現(xiàn)為僅在冠狀動(dòng)脈管壁一側(cè)，因脂質(zhì)沉積損傷與修復(fù)而增厚，即僅累及冠狀動(dòng)脈的某一局部，而移植心臟TCAD則累及冠脈的所有分支甚至心肌間末梢分支。

2.4.4.2.1 肉眼所見(jiàn) 典型的移植心臟CR時(shí)，肉眼可見(jiàn)心臟不同程度的肥大，心臟外觀可以有很大差異，有的表現(xiàn)正常，有的表面可見(jiàn)梗死后纖維化形成的瘢痕。心臟切面可見(jiàn)心室等部位有明顯的心肌梗死瘢痕，并同時(shí)可見(jiàn)新的心肌梗死灶。心臟表面冠狀動(dòng)脈主干分支的橫斷面檢查，可見(jiàn)管壁均勻性增厚及管腔向心性狹窄，沿血管長(zhǎng)軸剖開(kāi)可見(jiàn)內(nèi)膜常有黃色脂質(zhì)斑塊。移植心臟冠狀動(dòng)脈分支的整個(gè)血管樹(shù)即不同管徑的各級(jí)動(dòng)脈均可被累及，其中管徑>100 μm的動(dòng)脈血管可全部累及，部分管徑50～100 μm的動(dòng)脈血管也可被累及，管徑<40 μm的、缺乏完整中膜平滑肌的血管也可被累及。

2.4.4.2.2 鏡下所見(jiàn) 病變包括冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)膜顯著增生，增生血管內(nèi)膜中的細(xì)胞成分主要為大量增生的平滑肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、吞噬了大量脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞或稱為泡沫細(xì)胞以及不同程度的淋巴細(xì)胞，同時(shí)伴有膠原增加及脂質(zhì)沉積，增厚的血管內(nèi)膜致管腔狹窄甚至閉塞（圖8）。TCAD時(shí)，心肌組織由于不同部位、不同程度的缺血呈局灶性梗死，梗死灶部位心肌纖維支架塌陷并有灶狀淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，隨后梗死灶由纖維瘢痕組織取代。嚴(yán)重的TCAD所致的缺血損傷可致心室尤其是右心室心肌組織內(nèi)大量心肌細(xì)胞梗死并逐漸為纖維組織所取代。移植心臟冠狀動(dòng)脈是形成TCAD的主要部位，而各級(jí)靜脈的分支基本不出現(xiàn)與動(dòng)脈類似的病變。

圖8 移植心臟CR的TCAD病理學(xué)表現(xiàn)Figure 8 Pathological findings of TCAD of CR of heart allograft

對(duì)于診斷移植心臟急性排斥反應(yīng)非常有價(jià)值的EMB，在TCAD診斷上的作用有限，這是由于EMB取材部位非常表淺而且標(biāo)本量非常少，無(wú)法活檢鉗取到深部的心肌組織，更難以取得管徑略大的冠狀動(dòng)脈血管分支以觀察TCAD的血管病變，而且部分心內(nèi)膜下淺表部位的心肌組織得益于心內(nèi)膜下滋養(yǎng)血管的血供，可以沒(méi)有明顯的心肌缺血性改變，因而造成EMB未能及時(shí)診斷TCAD相應(yīng)的心肌損傷的現(xiàn)象，因此在EMB的活檢組織中僅能通過(guò)觀察是否存在心肌缺血性損傷以及結(jié)合心臟移植術(shù)后的存活時(shí)間間接提示移植心臟可能存在一定程度的動(dòng)脈血管病變，并進(jìn)一步進(jìn)行移植心臟冠狀動(dòng)脈血管造影等影像學(xué)檢查以最終明確TCAD的診斷。在CR中，一個(gè)值得注意的現(xiàn)象是部分典型的CR病變中常常同時(shí)伴有不同程度的甚至嚴(yán)重的aTCMR和（或）aAMR等急性排斥反應(yīng)，有報(bào)道顯示有大約27%的移植心臟CR中合并有急性排斥反應(yīng)，更進(jìn)一步說(shuō)明免疫學(xué)損傷因素在CR病變中的致病作用。

移植心臟TCAD病變應(yīng)與非移植心臟的動(dòng)脈粥樣硬化相鑒別，兩者鑒別的要點(diǎn)在于移植心臟TCAD為內(nèi)膜全周的向心性增厚而非動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)脈管壁一側(cè)顯著增厚；TCAD累及冠狀動(dòng)脈分支全境，大、中、小各級(jí)分支均可被累及，而動(dòng)脈粥樣硬化主要累及動(dòng)脈主干如升主動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈等；TCAD較之非移植心臟的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展更快速，但通常不合并粥樣斑塊內(nèi)的鈣化。

2.4.5 移植心臟“Quilty 病變”（心內(nèi)膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)） 移植心臟“Quilty 病變”或稱“Quilty 效應(yīng)”，也可稱為移植心臟心內(nèi)膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。“Quilty病變”的定義及其組織病理學(xué)特征為位于移植心臟心內(nèi)膜下部位的、局灶性的、密集的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)（圖9），可伴或不伴有急性排斥反應(yīng)。在心臟移植術(shù)后稍長(zhǎng)時(shí)間如1個(gè)月或數(shù)月以后，以及更長(zhǎng)期存活者的EMB活檢組織內(nèi)，?？梢?jiàn)到心內(nèi)膜下局灶性或沿心內(nèi)膜下彌漫性、密集的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。最初結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征稱為心內(nèi)膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、類淋巴瘤病變或心內(nèi)膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其于1981年由美國(guó)Stanford大學(xué)的Billingham最先報(bào)道并以出現(xiàn)該病變的移植受者的姓氏命名為“Quilty病變”或“Quilty損傷”。其在心臟移植受者的EMB活檢組織中的出現(xiàn)率約為14%，而Stanford大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Joshi等對(duì)移植心臟“Quilty病變”進(jìn)行的大樣本的EMB研究顯示，其總體發(fā)生率為51.46%，其中在成人心臟移植受者中的發(fā)生率為49.77%，在兒童心臟移植受者中的發(fā)生率為68.18%，可見(jiàn)其在心臟移植受者中的發(fā)生率較高?！癚uilty病變”內(nèi)浸潤(rùn)的細(xì)胞有多種類型，主要包括T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其中以T淋巴細(xì)胞為主，其次為漿細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞中又以CD 4+T淋巴細(xì)胞為主，其與CD 8+T淋巴細(xì)胞的比例為2～3∶1。也有個(gè)別的研究顯示以B淋巴細(xì)胞為主，此外偶爾有少許巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。其中淋巴細(xì)胞可具有不同成熟階段的不同細(xì)胞形態(tài)。雖已有大量關(guān)于“Quilty病變”產(chǎn)生機(jī)制的動(dòng)物和臨床研究，曾經(jīng)提出與免疫抑制劑環(huán)孢素的應(yīng)用、EB病毒感染、早期急性排斥反應(yīng)以及移植后淋巴組織異常增生等因素有關(guān)，但仍無(wú)法明確?！癚uilty病變”與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，且因?yàn)閮烧呓M織病理學(xué)表現(xiàn)相似，其鑒別診斷也令人困惑，進(jìn)一步對(duì)EMB活檢組織予以不同角度的、連續(xù)地、深層的切片，以及全面觀察所有的活檢組織塊，有利于鑒別診斷[12-13]。

圖9 移植心臟“Quilty病變”的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 9 Pathological findings of Quilty injury of heart allograft

2.4.6 感染性心肌炎 由于術(shù)后免疫抑制劑的大量應(yīng)用，受者機(jī)體免疫力明顯下降，感染性心肌炎亦是心臟移植術(shù)后的并發(fā)癥之一。心臟移植后最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染為細(xì)菌感染，占整個(gè)術(shù)后感染的50%，其次為病毒感染，占40%，此外真菌感染及寄生蟲(chóng)感染各占5%。而在移植心臟EMB活檢組織以及死后尸檢組織中最常見(jiàn)的為巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）和弓形蟲(chóng)感染。器官移植中CMV感染的方式主要為CMV陰性受者接受了CMV陽(yáng)性供者的心臟或輸入了CMV陽(yáng)性的血液制品[受者（recipient，R）–/供者（donor，D）+]，這是最常見(jiàn)也是最重要的CMV感染方式，這種方式稱為原發(fā)性感染；其次為繼發(fā)性感染或稱再次激活性感染，即受者術(shù)前隱性感染CMV病毒而呈CMV陽(yáng)性，在移植術(shù)后因免疫抑制劑的應(yīng)用，機(jī)體免疫功能低下后導(dǎo)致病毒再度活化（R+/D–）；最后一種情況即CMV陽(yáng)性的受者又再次感染不同株的CMV病毒形成的再次感染（R+/D–），有時(shí)也稱為超感染。Stovin等曾報(bào)道，心臟移植受者臨床出現(xiàn)明顯的CMV活性感染時(shí)未見(jiàn)心肌活檢組織內(nèi)浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞數(shù)量的明顯增加。

2.4.7 供心的感染 慶幸的是，供心的感染在心臟移植中十分罕見(jiàn)，但移植病理科醫(yī)師在診斷中應(yīng)具備警惕性。其中主要為供心的弓形蟲(chóng)感染，因?yàn)楦腥緯r(shí)常常沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)，而且在心內(nèi)膜活檢組織學(xué)診斷中很難與輕度的急性排斥反應(yīng)相鑒別，需要借助活檢組織的電鏡檢查以及血清學(xué)檢查予以明確。

2.4.8 移植心臟心肌組織內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化 移植心臟心肌組織內(nèi)有時(shí)可見(jiàn)鈣化即局部的小灶狀鈣質(zhì)沉積稱為營(yíng)養(yǎng)不良性鈣化。其形成的原因可能與環(huán)孢素、膿毒血癥、貧血、低鎂血癥、糖皮質(zhì)激素（激素）應(yīng)用以及酗酒等有關(guān)。組織學(xué)上可見(jiàn)心肌細(xì)胞或心肌間質(zhì)內(nèi)有暗藍(lán)色或藍(lán)紫色細(xì)小顆粒樣鈣質(zhì)沉積，顆粒直徑為1.0～2.5 μm，如果鈣質(zhì)較多可覆蓋整個(gè)心肌細(xì)胞甚至多個(gè)心肌細(xì)胞。

2.4.9 心肌缺血損傷 相對(duì)于移植術(shù)后近期內(nèi)出現(xiàn)的缺血改變，在術(shù)后長(zhǎng)期存活受者中也可能由于TCAD等原因?qū)е滦募∪毖虼薎SHLT標(biāo)準(zhǔn)中建議在明確存在缺血損傷的前提下，進(jìn)一步對(duì)其組織病理學(xué)改變劃分為A級(jí)和B級(jí)兩個(gè)級(jí)別。其中A級(jí)定義為出現(xiàn)在移植術(shù)后3周內(nèi)，主要由于術(shù)前或術(shù)中的缺血或再灌注損傷所致，稱為移植術(shù)前損傷；而B(niǎo)級(jí)則主要出現(xiàn)于稍晚，常為術(shù)后3個(gè)月或3個(gè)月以上的心肌缺血損傷，稱為晚期缺血變化，其原因?yàn)門CAD的可能性較大。移植心臟缺血損傷后常沒(méi)有明顯的臨床癥狀，而壞死等損傷的修復(fù)可因免疫抑制劑的應(yīng)用而延遲，也有報(bào)道缺血損傷可進(jìn)展為移植心臟間質(zhì)纖維化。

2.4.10 EMB活檢標(biāo)本中的脂肪組織 心臟的多數(shù)脂肪組織分布于心外膜，心肌內(nèi)僅有極少許脂肪組織，主要分布于心內(nèi)膜下以及少許位于心肌組織內(nèi)（圖10）。移植心臟EMB活檢標(biāo)本中如果發(fā)現(xiàn)脂肪組織或脂肪細(xì)胞應(yīng)予以仔細(xì)鑒別其來(lái)源，以明確其來(lái)源于心內(nèi)膜或心外膜。如果脂肪組織表面可檢見(jiàn)間皮細(xì)胞則表明脂肪組織來(lái)源于心外膜，如果在脂肪組織周圍發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)組織也提示這一脂肪組織來(lái)源于心外膜，提示可能由于活檢致心室穿孔。如果活檢組織內(nèi)僅有極少許脂肪細(xì)胞夾雜在心肌細(xì)胞之間，則提示為正常部位的右心室心肌組織，并且對(duì)于較為肥胖以及應(yīng)用大量激素的移植受者，心肌組織內(nèi)的少許脂肪細(xì)胞應(yīng)視為正常。此外，在少數(shù)前次活檢部位的活檢組織中，增生的小瘢痕組織內(nèi)有時(shí)也可有少許脂肪細(xì)胞。

圖10 移植心臟活檢標(biāo)本中脂肪組織的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 10 Pathological findings of adipose tissue in biopsy specimen of heart allograft

2.4.11 移植心臟的其他病理學(xué)變化 移植心臟EMB活檢組織中的其他可能出現(xiàn)的組織病理學(xué)變化包括人為因素所致改變、組織標(biāo)本的假象和與前次活檢部位重疊所致的改變等3種情況。

2.4.11.1 人為改變 移植心臟EMB活檢組織中的人為改變或稱為“人為假象”，主要來(lái)自于EMB操作和后續(xù)病理制片中造成的人為改變兩個(gè)方面。在EMB操作過(guò)程中尤其是在用活檢鉗口鉗夾心肌組織時(shí)，由于鉗夾及拉扯等機(jī)械力作用造成的心肌組織形態(tài)改變，如活檢心肌組織上出現(xiàn)的鉗夾夾痕、或形成“緊箍帶”（圖11）；或者由于活檢鉗鉗口的鋒利度不夠，在鉗夾過(guò)程中，不能切斷心肌組織而形成明顯的活檢鉗拉扯痕跡。此外，同樣原因也可以形成活檢組織內(nèi)的假性出血，這時(shí)可見(jiàn)活檢組織周圍包裹單一的、大量的紅細(xì)胞而沒(méi)有其它炎癥細(xì)胞。如果這時(shí)鉗夾的活檢組織內(nèi)有細(xì)小血管的分支，由于鉗口不夠鋒利，在切割和拉扯過(guò)程中拉扯血管內(nèi)膜和管壁組織，一旦切割完成，經(jīng)劇烈拉扯的血管內(nèi)膜或管壁平滑肌彈性回縮而進(jìn)入血管腔內(nèi)，可形成小血管栓塞或者內(nèi)膜增生的假象；由于病理制片過(guò)程中心肌組織固定保存不佳，切片過(guò)厚等原因，在HE染色切片中造成部分心肌細(xì)胞嗜伊紅染色過(guò)深，局部心肌細(xì)胞類似凝固性壞死。此外，由于未進(jìn)行多角度、多層面的連續(xù)切片，未能發(fā)現(xiàn)心肌組織塊深部的炎癥浸潤(rùn)灶，而錯(cuò)失了本應(yīng)建立的準(zhǔn)確診斷等。為克服這一人為因素，應(yīng)熟練EMB操作技術(shù)、選用良好的器械、在活檢過(guò)程中精細(xì)操作，保護(hù)活檢組織的原始狀態(tài)，取材完成后不可人為夾捏、擠壓或拉扯活檢組織，也避免因不同的染色需要而分切活檢組織，最大限度地避免對(duì)活檢組織固有形態(tài)的人為破壞。

圖11 移植心臟活檢組織內(nèi)人為假象的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 11 Pathological findings of artificial artifacts in biopsy tissue of heart allograft

2.4.11.2 假象的識(shí)別 應(yīng)用EMB診斷移植心臟排斥反應(yīng)等并發(fā)癥時(shí)，EMB活檢組織內(nèi)的一些假象可能會(huì)造成診斷偏差。這些偏差多數(shù)情況下常由于取樣標(biāo)本不足所致。由于程度較輕的急性排斥反應(yīng)常為微小局灶性病變，應(yīng)用EMB診斷時(shí)很容易發(fā)生取樣不足所致的偏差，那么，需要鉗取多少塊活檢組織呢？當(dāng)然對(duì)于診斷的病理科醫(yī)師而言，越多越好，這樣可以明顯提高樣本的代表性和診斷的準(zhǔn)確性，而在實(shí)際的活檢中，活檢手術(shù)醫(yī)師盡可能鉗取越少越好，這樣盡可能地降低活檢的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)合兩方面的因素以及目前的經(jīng)驗(yàn)，多數(shù)中心認(rèn)為活檢時(shí)必須選取3塊以上的組織，以減少誤差。有時(shí)活檢樣本也可能鉗取到血栓、凝血塊或心內(nèi)膜下脂肪組織，當(dāng)采到心內(nèi)膜下脂肪組織時(shí)，?？梢?jiàn)到因植入反應(yīng)所致的少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是移植術(shù)后最初2～3周，應(yīng)與排斥反應(yīng)區(qū)別。只有當(dāng)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)延伸到心肌組織時(shí)，方可考慮為急性排斥反應(yīng)。如果脂肪組織包含有間皮細(xì)胞時(shí)，應(yīng)警惕可能發(fā)生了心室穿孔。

2.4.11.3 EMB取材部位重疊 活檢取材部位重疊即活檢取材位于前次活檢部位。在常規(guī)開(kāi)展EMB的移植中心以及對(duì)于長(zhǎng)期存活的心臟移植受者，通常會(huì)接受多次的EMB，而且每次EMB均要鉗取數(shù)塊心內(nèi)膜組織，因而許多活檢標(biāo)本會(huì)重疊在以前的活檢部位上。有報(bào)道術(shù)后第1年內(nèi)大約需要接受15～20次的EMB，在此情況下，其中大約有50% 甚至更多的機(jī)會(huì)將會(huì)取材到以前的活檢部位。之所以有如此高的重復(fù)活檢到同一部位的幾率，主要是由于絕大多數(shù)EMB均采用經(jīng)頸靜脈的路徑、右心室內(nèi)乳頭肌固有的走行方向和心室收縮等原因，均容易引導(dǎo)活檢鉗進(jìn)入右心室間隔的相應(yīng)位置反復(fù)鉗夾，使得在EMB中難以避免取到前次的活檢部位。肉眼觀，在心臟移植術(shù)后存活數(shù)月或1年以上者，如果接受過(guò)多次EMB，可見(jiàn)右室間隔壁上有多個(gè)直徑大約1～2 cm的局灶斑片狀增厚區(qū)域，組織病理學(xué)上可見(jiàn)局部肉芽組織或機(jī)化的纖維瘢痕組織，其中有輕微的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖12），周圍心肌纖維排列略為紊亂。近期活檢者可見(jiàn)心肌間質(zhì)內(nèi)輕微出血。

圖12 EMB活檢組織取材重疊部位的病理學(xué)表現(xiàn)Figure 12 Pathological findings of overlapping site of EMB biopsy tissue

3 移植心臟排斥反應(yīng)診斷研究的最新進(jìn)展

截止至目前，雖然EMB仍然是診斷移植心臟排斥反應(yīng)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其固有的局限性限制了其更廣泛的臨床應(yīng)用，這些局限性包括3個(gè)方面：（1）其為有創(chuàng)傷性的檢查；（2）檢查結(jié)果因標(biāo)本質(zhì)量或診斷者經(jīng)驗(yàn)的不同而存在結(jié)果的差異；（3）往往由于需要連續(xù)多次的活檢，部分心臟移植受者在術(shù)后第1年大約需要接受十余次的EMB，其醫(yī)療費(fèi)用也是一項(xiàng)較重的負(fù)擔(dān)。由此，在移植心臟排斥反應(yīng)的診斷中，一直希望探索出一種可以取代EMB的、無(wú)創(chuàng)性的、安全、快速、費(fèi)用低廉且可重復(fù)多次應(yīng)用的診斷方法。近年來(lái)，基于最新的分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)移植心臟排斥反應(yīng)的診斷研究進(jìn)展很快，部分檢測(cè)方法已經(jīng)可以很好地協(xié)助臨床預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)，從而在很大程度上避免不必要的EMB。

新的診斷方法的研究主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面。其中一方面仍然是基于EMB活檢心肌組織的研究，充分利用活檢心肌組織這一最能體現(xiàn)移植心臟病理?yè)p傷的寶貴標(biāo)本資源，通過(guò)將多種最新的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于此，研究發(fā)生排斥反應(yīng)等損傷時(shí)心肌細(xì)胞的病理生理改變、心肌細(xì)胞和多種炎癥細(xì)胞的細(xì)胞因子及其信號(hào)通路、發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)藥物的相應(yīng)治療靶點(diǎn)等[14-16]。這方面的研究中借助的技術(shù)主要包括二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）、分子顯微鏡（molecular microscope）、心臟血管的MRI（cardiac MRI，CMR）和基因表達(dá)譜（gene expression profile，GEP）技術(shù)等。其中二代測(cè)序與邏輯回歸分析模型相結(jié)合，檢測(cè)經(jīng)石蠟包埋的移植心臟EMB活檢心肌組織內(nèi)微小核糖核酸（micro RNA，miRNA），已經(jīng)可以協(xié)助臨床區(qū)分包括TCMR、AMR和混合性排斥反應(yīng)在內(nèi)的3種不同的急性排斥反應(yīng)類型，進(jìn)而通過(guò)大量研究建立ACR的計(jì)分閾值模型，對(duì)于高于其閾值的ACR的預(yù)測(cè)特異度和靈敏度可分別達(dá)到0.91和0.68[17]，但其局限性在于miRNA分離方法的不同和EMB活檢組織中混雜多種不同類型的細(xì)胞使得其結(jié)果差異很大；分子顯微鏡技術(shù)是檢測(cè)排斥反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)，尤其是aAMR時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞損傷中其轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化；而CMR是基于急性排斥反應(yīng)時(shí)心肌間質(zhì)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)甚至心肌壞死時(shí)導(dǎo)致組織和細(xì)胞間的間隙增寬等空間結(jié)構(gòu)改變，通過(guò)MRI對(duì)心臟收縮期和舒張期內(nèi)心臟影像的精細(xì)觀察予以診斷；EMB通過(guò)對(duì)活檢組織內(nèi)GEP進(jìn)行研究[18]，提示其損傷基因的表達(dá)明顯早于TCMR發(fā)生，且血管炎相關(guān)GEP高表達(dá)者與預(yù)后不良相關(guān)[19]。

另一方面則是利用心臟移植受者血液、尿液等多種體液標(biāo)本展開(kāi)研究，即液態(tài)活檢（liquid biopsy）。主要通過(guò)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在受者外周循環(huán)血液中尋找和確定與排斥反應(yīng)等相關(guān)的、可用于診斷的生物標(biāo)志物。這些研究?jī)?nèi)容包括外周血白細(xì)胞中的GEP、細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA）、心肌肌鈣蛋白（cardiac troponins）、miRNA、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）和DSA等多方面的研究[20-22]。

在ISHLT標(biāo)準(zhǔn)中的重度aTCMR時(shí)，外周血內(nèi)排斥反應(yīng)損傷相關(guān)的GEP表達(dá)顯著升高，而低于特定閾值者則少有發(fā)生嚴(yán)重的aTCMR，其對(duì)術(shù)后1年內(nèi)不發(fā)生aTCMR者的預(yù)測(cè)值即陰性預(yù)測(cè)值可高達(dá)99.6%。而且目前已經(jīng)有商業(yè)化的GEP技術(shù)平臺(tái)（ALLOMap?）在歐洲和美國(guó)的多個(gè)心臟移植中心得到應(yīng)用，其對(duì)心臟移植術(shù)后2個(gè)月、6個(gè)月和1年的受者分別檢測(cè)其GEP表達(dá)水平，低于特定閾值者發(fā)生急性排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)明顯降低，從而可以顯著降低EMB的診斷需求[23]。

供者來(lái)源性細(xì)胞游離DNA（donor-derived cellfree DNA，dd-cfDNA）是來(lái)源于供者心臟的心肌細(xì)胞，是在缺血或排斥反應(yīng)等損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡甚至壞死時(shí)釋放入外周血內(nèi)的微小DNA片段。最常見(jiàn)的為女性受者接受男性供者心臟移植后，受者外周血中可檢測(cè)到男性供者的Y染色體，提示移植心臟受到損傷。目前隨著dd-cfDNA檢測(cè)技術(shù)的飛速發(fā)展，不僅可以檢測(cè)男女不同性別的、也可以檢測(cè)供、受者雙方的dd-cfDNA，其不僅可以檢測(cè)ISHLT標(biāo)準(zhǔn)中重度的aTCMR，而且也逐漸擴(kuò)展到可檢測(cè)輕度aTCMR，其對(duì)中度aTCMR判斷的陰性預(yù)測(cè)值可達(dá)100%，其判斷的特異度和靈敏度已經(jīng)分別可以達(dá)到0.754 8和1.000 0[24]。

心肌肌鈣蛋白是嚴(yán)重心血管疾病所致的心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志物，在中至重度aTCMR時(shí)亦可顯著升高和釋放入血[25]。近來(lái)Erbel等[26]在血漿中確立了高敏感性的心肌肌鈣蛋白檢測(cè)閾值為33.55 ng/mL，其靈敏度和特異度分別高達(dá)0.909 1和0.709 7，低于此閾值的移植心臟5年存活率顯著提高，但其局限性在于其他造成心肌損傷的因素亦可造成其指標(biāo)水平升高，并非僅見(jiàn)于急性排斥反應(yīng)。

EV是一種由細(xì)胞產(chǎn)生和釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中的膜性小囊泡（直徑30～150 nm），廣泛地存在于各種體液和細(xì)胞上清液中，其攜帶重要的生物信號(hào)，是特異性的細(xì)胞功能性囊泡，參與到細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞免疫等多種細(xì)胞生物學(xué)行為中，其主要包括微囊泡（microvesicle）、外泌體（exosome）和凋亡小體（apoptotic body），在急性和（或）慢性損傷引發(fā)的適應(yīng)性炎癥反應(yīng)等病理生理狀態(tài)下，常伴有特異性的EV產(chǎn)生及釋放，進(jìn)而可以作為無(wú)創(chuàng)性的診斷標(biāo)志物予以檢測(cè)，其不僅促進(jìn)T淋巴細(xì)胞免疫活化信號(hào)的傳導(dǎo)，而且也攜帶和表達(dá)Ⅰ類和Ⅱ類的MHC抗原分子，在T淋巴細(xì)胞活化中發(fā)揮抗原提呈作用；此外，部分由成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可促進(jìn)淋巴結(jié)中特定區(qū)域內(nèi)的淋巴細(xì)胞歸巢，從而發(fā)揮T淋巴細(xì)胞活化和免疫放大效應(yīng)，借此可通過(guò)檢測(cè)血液中供者M(jìn)HC特異性EV而診斷T細(xì)胞介導(dǎo)的aTCMR[27-28]。

通過(guò)上述多方面的研究，希望能夠像移植腎的無(wú)創(chuàng)性診斷中所初步建立的、通過(guò)多中心參與的、大樣本量研究確立的類似于iBox模型一樣的診斷預(yù)測(cè)模型，以期可以實(shí)際應(yīng)用于心臟移植排斥反應(yīng)的預(yù)警和診斷，可以最終替代有創(chuàng)性的EMB，使移植心臟排斥反應(yīng)的診斷更安全、便捷、經(jīng)濟(jì)和可重復(fù)使用。同時(shí)也需要注意，由于新的檢測(cè)方法技術(shù)要求高，方法和結(jié)果有待驗(yàn)證和統(tǒng)一以及檢測(cè)費(fèi)用仍偏高等多種客觀因素，在其尚未能應(yīng)用于臨床時(shí)，對(duì)于高度提示排斥反應(yīng)等并發(fā)癥的心臟移植受者，及時(shí)采用EMB活檢病理學(xué)診斷仍是必不可少的[29]。

4 小 結(jié)

對(duì)移植心臟排斥反應(yīng)等并發(fā)癥及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷，是保障移植心臟和受者長(zhǎng)期存活的重要先決條件。通過(guò)移植心臟的EMB可對(duì)移植心臟的排斥反應(yīng)、感染性心肌炎、“Quilty病變”等多種并發(fā)癥予以明確診斷，截止至目前其仍是多種并發(fā)癥診斷的最有效手段。同時(shí)，由于其EMB固有的有創(chuàng)性和近年來(lái)無(wú)創(chuàng)性分子生物學(xué)檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)與臨床應(yīng)用，EMB已經(jīng)不作為診斷急性排斥反應(yīng)的唯一途徑，但是對(duì)于難以鑒別的急性排斥反應(yīng)尤其是aAMR的鑒別診斷，借助EMB觀察MI病變，對(duì)于及時(shí)診斷aAMR仍是非常有幫助的。因此，一定程度上，EMB仍是診斷和鑒別移植心臟并發(fā)癥的有效手段之一。同時(shí)，也期待不久的將來(lái)，新的更加安全、便捷和經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段可以常規(guī)應(yīng)用于心臟移植，使更多的心臟移植受者受益，以更好地保障移植心臟和受者的長(zhǎng)期存活。