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        懷玉山三葉青查爾酮合酶基因克隆和表達(dá)分析

        2021-11-15 01:56:56洪森榮劉佳劉軍劉依婷陳榮華蔡紅
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:查爾合酶克隆

        洪森榮,劉佳,劉軍,劉依婷,陳榮華,蔡紅

        (1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001;2.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點實驗室/上饒市三葉青保育與利用技術(shù)創(chuàng)新中心/上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院,江西 上饒 334001;3.上饒市紅日農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,江西 上饒 334700)

        三葉青(Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg)又名金絲吊葫蘆,葡萄科(Vitaceae)崖爬藤屬植物,是我國特有珍稀藥用植物,也是民間常用藥,主要分布在我國的浙、贛、湘、閩、粵、滇、桂、川等地區(qū)[1]。三葉青性寒味苦,具有祛風(fēng)化痰、活血散結(jié)、消炎止痛和清熱解毒等功效,以地下塊莖和果實的藥用效果最好[2]?,F(xiàn)代藥理實驗和臨床應(yīng)用表明,三葉青無毒、無副作用、無耐藥性,具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎解熱、鎮(zhèn)痛保肝以及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用,被譽為“植物抗生素”[3]。

        黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物,不但能抗毒、調(diào)節(jié)生長、清除活性氧、抵抗紫外輻射,還能抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、清除自由基[4]。查爾酮合酶(CHS)是黃酮類化合物生物合成過程中第一個限速酶和關(guān)鍵酶,主要催化丙二酰輔酶A和對羥基苯丙烯酰輔酶A縮合生成異黃酮、黃酮醇、黃烷酮和花青素等物質(zhì)的共同前體查爾酮,從而為合成黃酮類化合物提供基本碳鏈骨架[5]。查爾酮合酶對植物生長發(fā)育的某些生理過程,如花色形成、根瘤形成、生物和非生物脅迫響應(yīng)、抵御紫外輻射傷害等,具有重要作用[6]。因此,克隆三葉青查爾酮合酶基因并進(jìn)行qRT-PCR(實時熒光定量PCR)分析,對研究查爾酮合酶基因在三葉青中的表達(dá)和三葉青黃酮類化合物的合成機(jī)理具有重要意義。

        關(guān)于查爾酮合酶研究的報道較多,如韓穎穎等[7]對蝴蝶蘭查爾酮合酶基因cDNA進(jìn)行了克隆、鑒定和原核表達(dá);謝修志等[8]對非洲菊查爾酮合酶基因進(jìn)行了克隆、序列分析,并在大腸桿菌中表達(dá);譚曉風(fēng)等[9]對油茶查爾酮合酶和異構(gòu)酶基因進(jìn)行了cDNA克隆和序列分析;和鳳美和朱永平[10]構(gòu)建了東方百合“元帥”查爾酮合酶基因的表達(dá)載體;吳琦等[11]對苦蕎查爾酮合酶基因的結(jié)構(gòu)及花期不同組織表達(dá)量進(jìn)行了分析;伍翀等[12]研究了黃芩查爾酮合酶基因內(nèi)含子在轉(zhuǎn)基因煙草中對GUS活性的調(diào)控;汪結(jié)明等[13]對矮牽牛查爾酮合酶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;李成磊等[14]對甜蕎查爾酮合酶基因進(jìn)行了克隆和序列分析;夏芳等[15]研究了水母雪蓮查爾酮合酶基因的克隆、表達(dá)和活性;汪孟曦等[16]克隆了白木香的查爾酮合酶基因AsCHS1,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;李星和王紅[17]對虎杖查爾酮合酶基因PcCHS1進(jìn)行了克隆與功能分析;劉姍等[18]克隆了金龍膽草查爾酮合酶基因并對其在花期不同組織中的表達(dá)進(jìn)行了分析;王佳媛等[19]克隆了海南龍血樹查爾酮合酶基因DcCHS,并分析了其在花、根、莖、葉和果實中的表達(dá)量;齊宇和趙蘭勇[20]克隆了玫瑰查爾酮合酶基因,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;馬立功等[21]克隆了向日葵查爾酮合酶基因HaCHS,并對其逆境應(yīng)答進(jìn)行了研究;趙風(fēng)治等[22]克隆了花椰菜的查爾酮合酶基因,并對其功能進(jìn)行了分析;孟衡玲等[23]克隆了鐵皮石斛查爾酮合酶基因,并對其表達(dá)進(jìn)行了分析;孫威等[24]克隆了日本蛇根草查爾酮合酶基因,并對其生物信息學(xué)進(jìn)行了分析;潘德灼等[25]克隆了紅樹植物秋茄查爾酮合酶基因,并對其在鹽脅迫下的表達(dá)進(jìn)行了分析;趙學(xué)榮等[26]克隆了苦蕎查爾酮合酶基因FtCHS1啟動子,并對其在低溫(4℃)和光照(UV-B)處理下的表達(dá)進(jìn)行了分析;周姍等[27]克隆了烏拉爾甘草查爾酮合酶基因,并對其進(jìn)行了序列分析;胡會剛[28]和徐僡[29]等分別對香蕉查爾酮合酶基因家族和金釵石斛的查爾酮合酶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

        目前,對三葉青的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理臨床、種植栽培、組織培養(yǎng)等方面[1,3],關(guān)于三葉青查爾酮合酶方面的研究尚未見報道。本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了懷玉山三葉青查爾酮合酶基因,并采用生物信息學(xué)方法和qRTPCR進(jìn)行序列分析和組織表達(dá)分析,可為揭示懷玉山三葉青查爾酮合酶的生物學(xué)功能提供理論依據(jù),為從分子水平調(diào)控懷玉山三葉青黃酮醇成分代謝及體外催化合成黃酮醇提供新思路。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        懷玉山三葉青2個栽培種‘懷玉1號’和‘懷玉2號’試管苗。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol試劑提取懷玉山三葉青‘懷玉2號’試管苗的總RNA,提取步驟按說明書進(jìn)行,使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版,按照MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈,逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo(dT)18 Primer(5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTT TT-3′),具體步驟按說明書進(jìn)行。

        1.2.2 查爾酮合酶基因的克隆 利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息(TRINITY_DN16981_c0_g3),運用Primer Premier 5.0設(shè)計引物(F:5′-ATGGCGGCCACCATGACCG-3′;R:5′-TCATGCGGTTGCCCCGGCGGT-3′)。PCR擴(kuò)增條件:95℃2 min;95℃30 s,62.8℃30 s,72℃30 s,35個循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將含有目的基因的條帶與pMD19-T載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α,經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

        1.2.3 查爾酮合酶基因的生物信息學(xué)分析 使用BioEdit軟件翻譯基因序列為氨基酸序列,用ProtParam預(yù)測酶的理化性質(zhì),用ProtScale預(yù)測酶的疏/親水性。使用GOR I軟件在線預(yù)測酶的二級結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL在線預(yù)測酶的三級結(jié)構(gòu)。采用WoLFPsort在線預(yù)測基因的表達(dá)部位。通過軟件DNAMAN和Bioedit進(jìn)行氨基酸序列比對,利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

        1.2.4 查爾酮合酶基因的組織表達(dá)分析 分別取懷玉山三葉青2個栽培種‘懷玉1號’和‘懷玉2號’試管苗的根、莖、葉RNA 500 ng,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR(SYBR Green I)檢測內(nèi)參基因為GAPDH。設(shè)計引物F為5′-CACGAGTCCCACCTCGACTC-3′,R為5′-AGGGGACGCTCCACGGACA-3′,大小為104 bp,Tm為59.2。qRT-PCR檢測采用16μL反應(yīng)體系(SYBR Green Mix 7μL,Primer-F 0.5μL,Primer-R 0.5 μL,cDNA 8μL),PCR反應(yīng)程序:95℃10 min;95℃10 s,60℃34 s,95℃15 s,40個循環(huán)。使用2-△△Ct法計算基因表達(dá)水平。試驗重復(fù)3次。

        試驗所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗查爾酮合酶基因組織表達(dá)的差異顯著性(P<0.05)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因cDNA序列

        懷玉山三葉青查爾酮合酶基因cDNA總長度為1 143 bp(圖1、圖2),G+C和A+T含量分別為65.27%和34.73%(圖3)。

        圖1 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因PCR擴(kuò)增

        圖2 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因堿基組成

        圖3 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因各堿基的比例

        2.2 懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列

        懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列見圖4。懷玉山三葉青查爾酮合酶由380個氨基酸組成,分子量41 809.23 Da,等電點6.19,為親水性蛋白。各氨基酸的數(shù)目和比例為Ala(A)37、9.7%,Arg(R)20、5.3%,Asn(N)9、2.4%,Asp(D)23、6.1%,Cys(C)7、1.8%、Gln(Q)12、3.2%,Glu(E)24、6.3%,Gly(G)30、7.9%,His(H)12、3.2%,Ile(I)18、4.7%,Leu(L)34、8.9%,Lys(K)22、5.8%,Met(M)17、4.5%,Phe(F)13、3.4%,Pro(P)17、4.5%,Ser(S)20、5.3%,Thr(T)20、5.3%,Trp(W)4、1.1%,Tyr(Y)9、2.4%,Val(V)32、8.4%。帶負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為47,帶正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為42。估計半衰期為30 h(哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞,體外),>20 h(酵母,體內(nèi)),>10 h(大腸桿菌,體內(nèi))。失穩(wěn)指數(shù)(II)為40.92,因此將該蛋白分類為不穩(wěn)定蛋白。

        圖4 懷玉山三葉青查爾酮合酶氨基酸序列

        2.3 懷玉山三葉青查爾酮合酶親疏水性分析

        在圖5中,峰值(正值)區(qū)域表示疏水區(qū)域,而低谷區(qū)域(負(fù)值)是親水區(qū)域??梢?,最大疏水值在2.25左右,說明該處的疏水性最強(qiáng);親水峰值最大為-2.50左右。該蛋白整體表現(xiàn)出高度的親水性,為親水蛋白。

        圖5 懷玉山三葉青查爾酮合酶親疏水值分布

        2.4 懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級、三級結(jié)構(gòu)分析

        懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖6)顯示,其二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(Hh,37.37%)、β-片層(Ee,19.47%)、無規(guī)則卷曲(Cc,43.16%)構(gòu)成,且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個蛋白中(圖7)。

        圖6 懷玉山三葉青查爾酮合酶的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

        圖7 懷玉山三葉青查爾酮合酶二級結(jié)構(gòu)各部分的分布

        三級結(jié)構(gòu)是多個二級結(jié)構(gòu)元素在三維空間排列形成的,SWISS-MODEL預(yù)測顯示懷玉山三葉青查爾酮合酶的三級結(jié)構(gòu)為二聚體(圖8)。

        圖8 懷玉山三葉青查爾酮合酶三級結(jié)構(gòu)

        2.5 懷玉山三葉青查爾酮合酶的亞細(xì)胞定位

        對懷玉山三葉青查爾酮合酶基因表達(dá)部位的預(yù)測結(jié)果(圖9)顯示,定位于細(xì)胞核中的數(shù)量為6,定位于線粒體中的數(shù)量為5,定位于細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量為2,定位于細(xì)胞外的數(shù)量為1。表明其主要存在于細(xì)胞核和線粒體中。

        圖9 懷玉山三葉青查爾酮合酶亞細(xì)胞定位

        2.6 懷玉山三葉青查爾酮合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

        由構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖10)可見,懷玉山三葉青查爾酮合酶與硬粒小麥(Triticum turgidumsubsp.durum)、節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschiisubsp.tauschill)、小麥(Triticum aestivum)的查爾酮合酶在一個大分支下,說明他們之間親緣關(guān)系較近,尤其是與硬粒小麥未命名蛋白產(chǎn)物VAH38240.1親緣關(guān)系最近。

        圖10 懷玉山三葉青查爾酮合酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

        2.7 懷玉山三葉青查爾酮合酶同源蛋白的序列比對信息

        保守結(jié)構(gòu)域是指在生物進(jìn)化過程中不變或者一個蛋白家族中相同的結(jié)構(gòu)域,一般具有重要的功能,不能被改變。圖11中“※”號區(qū)域即為懷玉山三葉青查爾酮合酶蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域,可見其同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域較為豐富。懷玉山三葉青在15到32位點氨基酸缺失,在其他位點與硬粒小麥(Triticum turgidumsubsp.durum)、節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschiisubsp.tauschill)、小麥(Triticum aestivum)完全一致,說明懷玉山三葉青查爾酮合酶與硬粒小麥、節(jié)節(jié)麥、小麥的查爾酮合酶同源性較高。

        圖11 懷玉山三葉青查爾酮合酶基因氨基酸序列的同源性比較

        2.8 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中查爾酮合酶基因的表達(dá)分析

        由圖12可見,懷玉山三葉青查爾酮合酶基因在‘懷玉1號’和‘懷玉2號’栽培種根、莖、葉中均有表達(dá),但表達(dá)量在不同器官間差異顯著,其中,根中表達(dá)量最高,葉中最低。

        圖12 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中 查爾酮合酶基因相對表達(dá)量分析

        3 討論

        三葉青地下塊根中的藥用成分主要有黃酮、多糖及多酚等[1],其中,黃酮類物質(zhì),如山奈酚蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮苷、兒茶素、紫云英苷等均具有藥理活性[3]。合成黃酮類化合物的關(guān)鍵酶之一是查爾酮合酶[5]。查爾酮合酶基因的突變、沉默或過表達(dá)會影響三葉青黃酮類物質(zhì)的合成,對其功能和產(chǎn)量產(chǎn)生一定影響。因此,研究查爾酮合酶基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式,將有助于明確三葉青黃酮合成的分子機(jī)制,提高三葉青中黃酮含量。

        本研究從懷玉山三葉青中克隆到查爾酮合酶全長基因,cDNA總長度為1 143 bp,G+C含量為65.27%;該基因編碼的蛋白質(zhì)具有查爾酮合酶家族保守存在的功能位點及結(jié)構(gòu)域,由380個氨基酸組成,分子量41 809.23 Da,等電點6.19,是一種親水性、不穩(wěn)定蛋白,與硬粒小麥(Triticum turgidumsubsp.durum)未命名蛋白產(chǎn)物VAH38240.1的親緣關(guān)系最近。研究表明,G+C的含量越高,基因穩(wěn)定性越高[7-29]。懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的G+C含量大于50%,推測其處于相對穩(wěn)定的狀態(tài),有助于該基因在進(jìn)化過程中穩(wěn)定遺傳。此外,作為黃酮類化合物代謝途徑的第一個關(guān)鍵限制酶,懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的組織表達(dá)情況可能會對黃酮合成和累積造成影響,進(jìn)而影響三葉青藥材的品質(zhì)。本研究結(jié)果表明,該基因在懷玉山三葉青2個栽培種的根、莖、葉中均有表達(dá),但器官間存在顯著差異,均以根中的表達(dá)量最高,葉中最低。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究懷玉山三葉青查爾酮合酶的功能及表達(dá)調(diào)控奠定了理論基礎(chǔ)。

        4 結(jié)論

        懷玉山三葉青查爾酮合酶具有查爾酮合酶典型的結(jié)構(gòu)特征,氨基酸序列及核苷酸序列與同源物種相似度高,在進(jìn)化上高度保守,且懷玉山三葉青查爾酮合酶基因的表達(dá)存在組織器官差異性,根中表達(dá)量最高。

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