方夢(mèng)嬋, 鄢愛(ài)平, 萬(wàn)益群*,

(1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031；2.南昌大學(xué)分析測(cè)試中心，江西南昌 330031)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的腫瘤，是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因之一[1 - 3]。早期乳腺癌的治愈率可達(dá)90%，然而大多數(shù)乳腺癌在發(fā)現(xiàn)之時(shí)已到中、晚期[4]，導(dǎo)致治愈率下降。目前最普及的乳腺癌篩查和確診方法主要有X-射線檢查、組織病理學(xué)以及血液檢查。這些方法對(duì)乳腺癌的中、晚期診斷有較好的準(zhǔn)確性，但對(duì)早期乳腺癌的診斷缺乏特異性和靈敏度[5]。因此，尋找乳腺癌早期診斷新方法，對(duì)有效提高乳腺癌患者的治愈率意義重大。

腫瘤標(biāo)志物能夠較好地反映癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，且具有簡(jiǎn)便、客觀和便于連續(xù)動(dòng)態(tài)觀測(cè)等優(yōu)勢(shì)，對(duì)于腫瘤的臨床診斷和治療具有較好的輔助作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)乳腺癌患者的血清、尿液、組織等樣本中的小分子代謝物進(jìn)行了研究，并取得一定的成效[6 - 9]。Porto-figueira等[10]研究了乳腺癌 (BC)和結(jié)腸癌(CC)患者以及健康個(gè)體的尿液排泄生物特征。Yu等[11]應(yīng)用毛細(xì)管電泳聯(lián)合質(zhì)譜方法，分析了晚期乳腺癌患者和健康人的尿液樣本，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，在對(duì)化療敏感的患者中，化療后半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸和色氨酸水平顯著下降，而對(duì)化療不敏感的患者，大部分氨基酸均未顯現(xiàn)明顯差異。目前，關(guān)于乳腺癌腫瘤標(biāo)志物篩查研究的樣本大多來(lái)自中、晚期[12]，且樣本的可控性差，有可能導(dǎo)致分析結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生一定差異?；诖?，本文通過(guò)構(gòu)建大鼠乳腺癌模型，以獲得可控的尿液樣本，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了大鼠尿液代謝指紋圖譜，并用隨機(jī)森林(RF)算法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析[13,14]，對(duì)乳腺癌標(biāo)志物的篩查進(jìn)行了有益的探索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 5977A/7890B氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國(guó)，安捷倫公司)；AR124CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；TG20.5臺(tái)式高速離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；IKA MS3型迷你振蕩器(艾卡廣州儀器設(shè)備(中國(guó))有限公司)；MD200-2型氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

N,O-雙甲氧基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%三甲基氯硅烷(TMCS)(美國(guó)Sigma公司)；甲氧胺鹽酸鹽(美國(guó)Sigma公司)；脲酶(分析純，美國(guó)Sigma公司)；吡啶(無(wú)水級(jí)，99.8%，美國(guó)Aladdin公司)；甲醇、乙腈、丙酮、正庚烷(色譜純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正二十二烷(美國(guó)Aladdin公司)；7,12-二甲基苯并[a]蒽(Sigma，D3254-1G)。實(shí)驗(yàn)用水由MILLI-QS超純水器(美國(guó)Millipore公司)制備。

1.2 大鼠乳腺癌模型構(gòu)建

SD雌性大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，重量為150～160 g(5周齡)(合格證編號(hào)：43004700033214)。將大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組為20只，模型組為50只。適應(yīng)一周后，乳腺癌誘導(dǎo)模型組大鼠給予一次性灌胃7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)玉米油溶液，劑量為80 mg/kg，正常對(duì)照組大鼠灌胃等體積玉米油。常規(guī)飼養(yǎng)，觀察大鼠成瘤情況，并做記錄，同時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

1.3 組織學(xué)分析

DMBA誘導(dǎo)16周后，統(tǒng)計(jì)成瘤率。大鼠斷頸處死，仰臥位固定在解剖板上，用剃毛器剃除腹部和胸部體毛，觀察成瘤數(shù)量、位置和大小，剪開(kāi)瘤體皮膚，摘下瘤體，用生理鹽水沖洗瘤體，并用4%多聚甲醛固定，用于HE染色。另外，打開(kāi)成瘤大鼠胸腔，暴露肺臟，觀察肺臟有無(wú)明顯轉(zhuǎn)移病灶，并剪取部分肺臟用4%多聚甲醛固定，做HE染色。未成瘤大鼠則每只取第2對(duì)和第4對(duì)單側(cè)乳房，4%多聚甲醛固定，用于HE染色。正常對(duì)照組隨機(jī)取3只大鼠取第2對(duì)和第4對(duì)單側(cè)乳房，4%多聚甲醛固定，用于HE染色。將固定的標(biāo)本包埋在石蠟中，每只制備4～5 μm厚的水平切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精和伊紅染色。然后由相同的病理學(xué)家使用普通白光通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢測(cè)準(zhǔn)備的病理切片。根據(jù)組織病理學(xué)分析結(jié)果，至第十六周時(shí)，DMBA誘導(dǎo)成瘤大鼠共計(jì)33只，未成瘤大鼠17只。

1.4 樣品采集及前處理

每周用代謝籠收集對(duì)照組和模型組大鼠24 h尿液一次。尿液樣品以14 000 r/min的速度離心10 min,去除蛋白質(zhì)。取50 μL上清液于1.5 mL離心管中，加入20 μL尿酶溶液(80 mg/mL),混合均勻，然后在37 ℃ 條件下加熱15 min分解尿樣中的尿素。加入180 μL甲醇∶乙腈=2∶1(V/V)混合溶液，渦旋1 min， 14 000 r/min離心10 min。取上清液150 μL，在溫和的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至近干，然后加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，于60 ℃反應(yīng)1 h。冷卻至室溫，加入100 μL BSTFA+TMCS(99∶1,V/V)，60 ℃反應(yīng)1 h后，再加入450 μL正庚烷(含0.05 g/L二十二烷內(nèi)標(biāo))終止反應(yīng)。衍生化完成后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.5 氣相色譜條件

HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：70 ℃保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，以4 ℃/min升至190 ℃，再以9 ℃/min升至250 ℃，最后以5 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；載氣：高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流進(jìn)樣：分流比為 2∶1。

1.6 質(zhì)譜條件

電離方式：電子轟擊離子源(EI)；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；采集方式：全掃描m/z35～800；溶劑延遲5.8 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 尿液樣品前處理方法的優(yōu)化

大鼠尿液成分較為復(fù)雜，其中的內(nèi)源性代謝物種類多，極性差異大，濃度范圍廣。為了獲得更多內(nèi)源性代謝物的信息，實(shí)驗(yàn)分別考察了有機(jī)溶劑甲醇、乙腈和丙酮對(duì)尿液樣品中內(nèi)源性代謝物的提取效率。結(jié)果表明，甲醇和乙腈的混合溶劑性能優(yōu)于其他溶劑。本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇∶乙腈=2∶1(V/V)混合溶劑作為尿液樣品的提取溶劑。

尿液樣品中尿素含量高，若不加處理，在進(jìn)行色譜分析時(shí)，會(huì)影響其他化合物的分析。本實(shí)驗(yàn)采用脲酶對(duì)尿素進(jìn)行分解，并對(duì)脲酶用量、分解溫度和分解時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。最終選用在50 μL尿液樣品中加入20 μL脲酶溶液(80 mg/mL)，在37 ℃下反應(yīng)15 min，尿素分解效果最佳。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

為了使尿樣中的內(nèi)源性代謝物達(dá)到較好的分離效果，實(shí)驗(yàn)分別考察了下列4種升溫程序下物質(zhì)的分離效果：(1) 80 ℃保持5 min，15 ℃/min升溫到300 ℃保持10 min；(2) 100 ℃保持3 min，以8 ℃/min升溫到280 ℃保持2 min；(3) 70 ℃保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，以4 ℃/min升至190 ℃，再以9 ℃/min升至250 ℃，最后以5 ℃/min升至280 ℃保持5 min；(4) 70 ℃保持5 min，以5 ℃/min升溫到250 ℃，再以8 ℃/min升溫到300 ℃，保持5 min。綜合考慮色譜峰的數(shù)量以及組分的分離效果，本實(shí)驗(yàn)選擇升溫程序(3)。樣品的總離子流(TIC)色譜圖如圖1所示。

圖1 大鼠乳腺癌尿液樣品的總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of urine samples from rats with breast cancer

2.3 尿液分析

本實(shí)驗(yàn)采集了對(duì)照組大鼠尿樣20例、未成瘤大鼠尿樣17例、乳腺癌大鼠尿樣33例，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行分析，得到48個(gè)共同峰。為了鑒定尿液中的復(fù)雜代謝物，將代謝物分為：氨基酸、碳水化合物和脂肪酸三類。脂肪酸衍生物直接用NIST數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定，而氨基酸和碳水化合物衍生物則通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化合物鑒定。實(shí)驗(yàn)以正二十二烷為內(nèi)標(biāo)，定量結(jié)果以代謝物峰面積(Ax)與內(nèi)標(biāo)物峰面積(Ai)比值的形式表示。 最后成功鑒定了48個(gè)共同峰，定性和定量分析結(jié)果列于表1。

表1 大鼠尿樣中48個(gè)色譜共有峰分析結(jié)果Table 1 Analytical results of 48 common chromatographic peaks in the rat urine samples

(續(xù)表1)

2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用RF算法對(duì)三組大鼠尿液樣本中的代謝物分析結(jié)果進(jìn)行分類。RF算法是一種受監(jiān)督的機(jī)器學(xué)習(xí)分類器，由于能夠有效地區(qū)分不同組樣本之間的差異，因此得到了廣泛的應(yīng)用[15,16]。該方法能處理高維度的數(shù)據(jù)，并在訓(xùn)練過(guò)程中得到各代謝物的變量重要度信息。其中重要度越高的變量說(shuō)明對(duì)分類的貢獻(xiàn)越大，可能是潛在的生物標(biāo)志物。

如圖2所示，不同組之間的差異明顯，乳腺癌組可以與健康組、未成瘤組有效地區(qū)分開(kāi)。其中乳腺癌組樣本點(diǎn)與健康組的樣本點(diǎn)距離較遠(yuǎn)，未成瘤組樣本點(diǎn)分布位于乳腺癌組與健康組之間。未成瘤組大鼠因受藥物誘導(dǎo)雖未成瘤，但其代謝與健康組大鼠會(huì)有一定差異。圖3列出了各代謝產(chǎn)物的變量重要度。結(jié)果表明，在乳腺癌組樣本和非乳腺癌組樣本中具有顯著性差異的物質(zhì)主要有甲基丙二酸、3-羥基丁酸、蘇糖酸、對(duì)羥基苯乙酸、D -麥芽糖。甲基丙二酸是丙二酸的衍生物，是脂肪和蛋白質(zhì)代謝中的重要中間體。甲基丙二酸含量出現(xiàn)顯著性差異說(shuō)明乳腺癌可能導(dǎo)致脂肪和蛋白質(zhì)代謝過(guò)程發(fā)生異常。3-羥基丁酸是支鏈氨基酸(主要是纈氨酸)的典型部分降解產(chǎn)物，3-羥基丁酸顯著減少顯示了氨基酸代謝異常。以上結(jié)果表明，由于乳腺癌的存在，導(dǎo)致了生物本身的一些代謝發(fā)生了改變，其差異性代謝物有可能是乳腺癌潛在的標(biāo)志物。

圖2 三類樣本的隨機(jī)森林算法分析結(jié)果Fig.2 Analytical results of three group samples with random forest algorithm

圖3 各代謝產(chǎn)物的變量重要度Fig.3 The variable importance of metabolites

3 結(jié)論

本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠乳腺癌模型，獲得了可控的樣本，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)大鼠乳腺癌尿液中的代謝物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)合隨機(jī)森林算法，對(duì)對(duì)照組、未成瘤組和乳腺癌組進(jìn)行了分類，篩選出具有顯著性差異的5種代謝物：甲基丙二酸、3-羥基丁酸、蘇糖酸、對(duì)羥基苯乙酸、D -麥芽糖。這5種物質(zhì)出現(xiàn)了明顯的差異，說(shuō)明乳腺癌疾病導(dǎo)致了大鼠代謝發(fā)生異常，有可能成為潛在的乳腺癌標(biāo)志物。