趙瀟瀾， 謝發(fā)婷， 遲寬能， 楊云慧， 胡 蓉

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南昆明 650500)

快速、可靠地檢測(cè)生物標(biāo)志物在疾病的診斷中起著至關(guān)重要的作用。C-反應(yīng)蛋白(CRP)是炎性淋巴因子(白介素-6IL-6、白介素-1IL-1、腫瘤壞死因子TNF)在肝細(xì)胞和上皮細(xì)胞中合成的急性期炎性蛋白。血清中CRP含量異常被證明與許多疾病有關(guān)，包括細(xì)菌或病毒感染的腦膜炎、心血管疾病(高血壓、高血脂等)、骨髓炎、新冠肺炎、冠心病等[1 - 4]。臨床上可通過(guò)分析CRP濃度對(duì)患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估[5]。因此，發(fā)展CRP的定量分析方法對(duì)于預(yù)測(cè)心血管疾病發(fā)生的可能性具有重要意義。目前臨床上檢測(cè)CRP的方法主要是比濁法[6]、局部表面等離子體共振[7]、酶聯(lián)免疫分析[8]和熒光法[9]等。但這些方法大多數(shù)具有儀器價(jià)格昂貴、靈敏度低等缺點(diǎn)。電化學(xué)生物傳感器具有簡(jiǎn)單、靈敏度高和易于操作等優(yōu)點(diǎn)[10]，可用于實(shí)時(shí)檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)[11]，在臨床診斷、食品安全、食品質(zhì)量、生物學(xué)分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[12]。

金屬有機(jī)框架材料(MOFs)是近十年來(lái)迅速發(fā)展的一種具有三維孔結(jié)構(gòu)的配位聚合物。目前MOFs在催化[13]、儲(chǔ)能[14]、生物傳感[15]和分離[16]等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。碳化氮作為一種新型富氮的類石墨相二維碳納米材料，具有優(yōu)良的半導(dǎo)體特性，已被廣泛運(yùn)用于催化[17]、光電[18]、電池[19]等諸多領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)基于金納米顆粒/碳化氮(Au NPs@C3N4)與多孔框架材料Cd-MOF-74，構(gòu)建了一種新的夾心型免疫傳感器用于CRP的定量檢測(cè)。用Au NPs@C3N4提供大的比表面積，用于固定CRP抗體(anti-CRP)，可以提高傳感器的靈敏度。多孔有機(jī)框架材料Cd-MOF-74為信號(hào)標(biāo)簽，通過(guò)檢測(cè)MOFs材料中Cd2+的信號(hào)，構(gòu)建了夾心型免疫傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)CRP的定量檢測(cè)。之前的報(bào)道中，我們將Fe-MIL-88作為信號(hào)標(biāo)簽時(shí)只檢測(cè)到MOFs中的配體峰[20]，并未檢測(cè)到離子峰，但以Cd-MOF-74作為信號(hào)標(biāo)簽時(shí)，既檢測(cè)到MOFs中的配體峰也檢測(cè)到Cd2+的峰，且離子峰的信號(hào)更強(qiáng)。該免疫傳感器在與CRP相關(guān)的疾病監(jiān)測(cè)和臨床診斷的生物學(xué)應(yīng)用中顯示出巨大的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

電化學(xué)工作站(CHI650E，上海辰華儀器公司)；真空干燥箱(DZF-6020，上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司)；電子分析天平(ME104E，德國(guó)賽多利斯集團(tuán))；透射電鏡(JEM 2100，日本電子株式會(huì)社)；高速冷凍離心機(jī)(TGL16，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(ST2200HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

CRP、anti-CRP(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.138 mol/L NaCl，pH=7.4)(Solarbio公司)；2,5-二羥基對(duì)苯二甲酸(DHTA)、CdAc2·2H2O(上海阿拉丁試劑有限公司)；牛血清蛋白(BSA，廣州賽國(guó)生物科技有限公司)；檸檬酸三鈉(盛奧化學(xué)試劑有限公司)；HAuCl4(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸(廣東西隴化工廠)；冰HAc、無(wú)水乙醇、甲醇(廣東光華科技股份有限公司)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司)；類石墨相碳化氮(C3N4，先豐納米材料科技有限公司)；Na2HPO4·12H2O(盛奧化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水NaAc(上海麥克林生化科技有限公司)；人反應(yīng)C蛋白ELISA試劑盒(上海江萊科技有限公司)。所用試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 材料制備

1.2.1 Au NPs的合成參照文獻(xiàn)方法[21]，將50 mL去離子水與500 μL 1%HAuCl4加入到100 mL圓底燒瓶中，加熱攪拌至沸騰后，立即加入1.75 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，在沸騰狀態(tài)下持續(xù)攪拌直至溶液變?yōu)榫萍t色，冷卻至室溫后，于4 ℃避光保存。

1.2.2 Au NPs@C3N4的制備將0.05 g C3N4超聲分散于20 mL的滅菌水中，在不斷攪拌的條件下滴加20 mL Au NPs，室溫?cái)嚢?8 h。以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，滅菌水洗滌3次，最終分散于5 mL的滅菌水中，4 ℃避光保存。

1.2.3 Cd-MOF-74的合成參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[22]，稱取0.4 g DHTA超聲分散于10 mL DMF中得到A液；稱取1.398 g CdAc2·2H2O分散于30 mL DMF中得到B液。將A液緩慢滴加至B液中，并超聲30 min。而后將混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在125 ℃反應(yīng)20 h，待反應(yīng)結(jié)束且冷卻至室溫后，抽濾，DMF和甲醇分別洗滌3次(10 mL×3)。抽濾產(chǎn)物用甲醇浸泡一周，每隔24 h更換一次，7 d后抽濾得到產(chǎn)物，于60 ℃真空干燥12 h，得到黃色晶體。

1.2.4 Au NPs@Cd-MOF-74的制備將15 mL合成的Au NPs逐滴加入分散于25 mL滅菌水的0.1 g Cd-MOF-74中，攪拌12 h。離心，滅菌水洗滌3次，分散于4 mL滅菌水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Au NPs@Cd-MOF-74標(biāo)記anti-CRP取400 μL合成的Au NPs@Cd-MOF-74，加入600 μL滅菌水，搖振均勻。再取10 μL 1 mg/mL anti-CRP，按2 μL/times間隔3 min加入，于4 ℃振搖2 h。而后加入25 μL 10%BSA，4 ℃繼續(xù)振搖30 min。以4 000 r/min低溫離心6 min，并用0.01 mol/L PBS洗滌2次，最終分散于1 mL PBS中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫傳感器的制備

玻碳電極(GCE,d=3 mm)用砂紙打磨，再在麂皮上用不同粒徑的Al2O3粉末進(jìn)行拋光。而后依次用HNO3(1∶1)、無(wú)水乙醇和去離子水各超聲3 min后晾干。將合成的Au NPs@C3N4分散液與5%Nafion溶液按體積比1∶1混合，取10 μL混合液滴加到GCE表面，自然晾干，再滴加anti-CRP，于4 ℃過(guò)夜。將電極取出用PBS沖洗去除未結(jié)合的anti-CRP后，晾干，滴加1%BSA(10 μL)，于37 ℃下封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)1 h。而后將電極取出沖洗、晾干，再滴加不同濃度的抗原于37 ℃恒溫培育1 h，PBS沖洗、晾干后，最后滴加10 μL Au NPs@Cd-MOF-74標(biāo)記的anti-CRP，37 ℃培育1 h。夾心型電化學(xué)免疫傳感器制備流程如圖1所示。

圖1 夾心型電化學(xué)免疫傳感器的原理及制備Fig.1 The principle of sandwich electrochemical immunosensor

1.4 電化學(xué)測(cè)量

采用差分脈沖伏安法(DPV)，在-0.7至-0.9 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量；交流阻抗在1 Hz至100 kHz的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

2.1.1 微觀形貌本文通過(guò)掃描電鏡圖(SEM)和透射電鏡圖(TEM)表征C3N4、Au NPs@C3N4、Cd-MOF-74及Au NPs@Cd-MOF-74的微觀形貌。由圖2A可見(jiàn)，C3N4是一種片層狀的材料。Au NPs與C3N4混合均勻后，Au NPs吸附于C3N4表面得到Au NPs@C3N4復(fù)合物。如圖2B所示，Au NPs均勻的分散在C3N4上。圖2C則顯示出Cd-MOF-74為典型的棒狀結(jié)構(gòu)，與先前文獻(xiàn)的報(bào)道結(jié)果吻合[22]。當(dāng)Cd-MOF-74吸附Au NPs后，其尺寸縮小且結(jié)構(gòu)松散呈碎石狀(圖2D)。從圖2E可見(jiàn)，Au NPs在Cd-MOF-74上分散均勻，說(shuō)明Au NPs@Cd-MOF-74合成成功。

圖2 C3N4(A)和Au NPs@C3N(B)的透射電鏡(TCM)圖,Cd-MOF-74(C)和Au NPs@Cd-MOF-74(D)的掃描電鏡(SEM)圖，Au NPs@Cd-MOF-74的TEM圖(E)Fig.2 TEM images of C3N4(A) and Au NPs@C3N4(B),the SEM images of Cd-MOF-74(C) and Au NPs@Cd-MOF-74(D),the TEM image of Au NPs@Cd-MOF-74(E)

2.1.2 X射線衍射表征本實(shí)驗(yàn)采用X射線衍射(XRD)對(duì)合成的Cd-MOF-74的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比對(duì)。圖3顯示在2θ為7°與12°的峰與文獻(xiàn)報(bào)道[22]一致，表明多孔有序的Cd-MOF-74成功合成。

圖3 Cd-MOF-74的X射線衍射(XRD)圖Fig.3 XRD pattern of Cd-MOF-74

2.1.3 電極修飾過(guò)程的電化學(xué)表征本實(shí)驗(yàn)在10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(含0.2 mol/L KCl)溶液中進(jìn)行。由圖4可見(jiàn)，曲線a為裸的GCE，它接近一條直線證明裸電極導(dǎo)電性優(yōu)良；在電極上鋪展一層Au NPs@C3N4作為基底之后，阻抗值比裸電極略有增大(曲線b)，由于修飾了Au NPs@C3N4和Nafion膜共同形成的界面對(duì)電子的傳遞有所阻礙；曲線c為在基底之上自組裝了anti-CRP，此時(shí)阻抗值接近600左右，anti-CRP是一種蛋白質(zhì)，本身不導(dǎo)電引起阻抗值增大；用1%BSA封閉非特異性位點(diǎn)后，BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4修飾電極后的電化學(xué)阻抗(曲線d)在曲線c的基礎(chǔ)上進(jìn)一步增大，因?yàn)锽SA是一種不能傳導(dǎo)電子的蛋白質(zhì)；曲線e為滴加了CRP抗原的CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE，CRP抗體抗原特異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物，進(jìn)一步阻礙電子的傳導(dǎo)；曲線f為Au NPs@Cd-MOF-74-anti-CRP/CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4修飾在電極表面之后的電化學(xué)阻抗，MOFs標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合后，修飾電極的阻抗進(jìn)一步增大，表明Au NPs@Cd-MOF-74-anti-CRP成功組裝在電極上。從上述曲線阻抗值的逐步變化結(jié)果得出，此夾心型免疫傳感器構(gòu)建成功。

圖4 不同電極的交流阻抗譜(EIS)Fig.4 The EIS of different modified electrodes(a)bare GCE;(b)Au NPs@C3N4/GCE;(c)anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE;(d)BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE;(e)CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE;(f)Au NPs@Cd-MOF-74-anti-CRP/CRP/BSA/anti-CRP/Au NPs@C3N4/GCE.All tests were carried out in 10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4- containing 0.2 mol/L KCl.

2.2 Cd-MOF-74的響應(yīng)峰電流來(lái)源

為了確認(rèn)Cd-MOF-74的信號(hào)來(lái)源于Cd2+，本實(shí)驗(yàn)考察了DHTA在PBS中的DPV響應(yīng)電流。由圖5可見(jiàn)，配體DHTA與Cd-MOF-74在PBS中的響應(yīng)電流峰的位置差別較大，其信號(hào)峰分別位于0.4 V和-0.8 V。Cd-MOF-74材料合成過(guò)程中，只含有Cd2+和DHTA，證實(shí)Cd-MOF-74產(chǎn)生的響應(yīng)電流來(lái)源于Cd-MOF-74中的Cd2+。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到的電流信號(hào)為Cd-MOF-74中Cd2+的還原峰。

圖5 Cd-MOF-74和DHTA在PBS中的電流響應(yīng)Fig.5 Current response of Cd-MOF-74 and DHTA in PBS

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了HAc-NaAc、Na2HPO4-檸檬酸和檸檬酸-檸檬酸三鈉三種緩沖體系(0.1 mol/L，pH=5)對(duì)免疫傳感器的影響。為了排除其它因素干擾，抗體的濃度固定為40 μg/mL，抗原濃度選定為30 ng/mL。結(jié)果表明：在HAc-NaAc緩沖體系中，電流響應(yīng)最大，但是目標(biāo)與空白差值不明顯；選用Na2HPO4-檸檬酸為緩沖體系時(shí)目標(biāo)和空白相差無(wú)幾；而在檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖體系中，峰電流差值最大。本實(shí)驗(yàn)選用檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液作為底液。

考察了當(dāng)培育抗原濃度保持在30 ng/mL，檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液作為底液時(shí)，固定抗體濃度增加對(duì)響應(yīng)電流的影響。由圖6可見(jiàn)，隨著anti-CRP濃度的增大，響應(yīng)電流也隨之逐漸增大。當(dāng)抗體濃度達(dá)到40 μg/mL時(shí)，響應(yīng)電流達(dá)到峰值，且此時(shí)目標(biāo)和空白差值最大。繼續(xù)增大抗體濃度，電流峰值反而有所下降。本實(shí)驗(yàn)選擇40 μg/mL作為固定抗體的濃度。

圖6 固定抗體濃度對(duì)免疫傳感器響應(yīng)電流的影響(內(nèi)插圖為目標(biāo)與空白的差值)Fig.6 The effect of concentration of immobilized antibody on the response of immunosensors(inset graph is the current response between target and blank)

2.4 免疫傳感器的響應(yīng)性能

在最優(yōu)條件下，分別對(duì)不同濃度抗原的免疫傳感器的響應(yīng)性能進(jìn)行測(cè)試。圖7A為免疫傳感器的DPV響應(yīng)電流與CRP蛋白濃度之間的關(guān)系。由圖可見(jiàn)，響應(yīng)電流隨CRP濃度的增大而遞增。圖7B為免疫傳感器的線性曲線。CRP濃度的對(duì)數(shù)與響應(yīng)電流具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：I(μA)=20.69lgc(ng/mL)+23.83，R2=0.994，線性范圍為0.1～100 ng/mL，檢出限(S/N=3)為33.3 pg/mL(圖7B)。

圖7 免疫傳感器對(duì)不同濃度CRP的響應(yīng)曲線(A)和免疫傳感器的校正曲線(B)Fig.7 The current response of immunosensor to different concentrations of CRP(A) and calibration curves of immunosensor(B)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本文構(gòu)建的免疫傳感器的性能，將此免疫傳感器同文獻(xiàn)所報(bào)道的CRP監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行了比較。由表1可見(jiàn)，該免疫傳感器具有較低的檢出限，更高的靈敏度，且線性范圍寬。其優(yōu)良性能歸功于：(1)作為基底材料的C3N4具有高比表面積和優(yōu)良的導(dǎo)電性；(2)作為信號(hào)源的Cd-MOF-74是一種多孔、比表面積大且能提供大量金屬活性位點(diǎn)的配位聚合物，在提供更多蛋白結(jié)合位點(diǎn)的同時(shí)，有著較強(qiáng)的響應(yīng)電流信號(hào)。

表1 不同CRP檢測(cè)方法對(duì)比Table 1 Analytical performance of correlative methods for CRP detection

2.5 免疫傳感器的選擇性

在最優(yōu)條件下，分別將500 ng/mL的凝血酶(Thrombin)、癌胚抗原(CEA)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)4種干擾物替換50 ng/mL的CRP抗原。從圖8可知，僅加入CRP抗原電流信號(hào)顯著增大，而干擾物(500 ng/mL)的電流信號(hào)和空白值相差不大。說(shuō)明此傳感器具有較好的抗干擾能力，選擇性好，可用于檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白。

圖8 免疫傳感器的選擇性Fig.8 Selectivity of the immunosensor

2.6 回收率測(cè)定

在0.01%的血清稀釋液中，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別加入3種不同濃度的CRP抗原(5、10、80 ng/mL)，以此評(píng)估本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的生物傳感器的實(shí)用價(jià)值。每種濃度平行測(cè)定3組，回收率范圍在98.4%～104.2%之間。由上述結(jié)果可知，本文設(shè)計(jì)的免疫傳感器用于復(fù)雜真實(shí)環(huán)境時(shí)取得令人滿意的結(jié)果，因此能夠用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

2.7 免疫傳感器的重現(xiàn)性

本實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，采用5根不同電極構(gòu)建免疫傳感器對(duì)50 ng/mL的抗原進(jìn)行平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%。因此，構(gòu)建的免疫傳感器具有良好的精密度和重現(xiàn)性。

2.8 與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法酶聯(lián)免疫法比較

本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)人C反應(yīng)酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)CRP進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果顯示紫外吸收光譜隨CRP濃度的增加而上升，CRP濃度在375～12 000 ng/mL之間時(shí)，紫外吸收峰值與CRP濃度線性相關(guān)良好。線性方程為：A=1.304lgc(ng/mL)-3.332(R2=0.9683)，檢測(cè)下限為125 ng/mL。將此測(cè)試結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的夾心型免疫傳感器進(jìn)行了比較。本實(shí)驗(yàn)所提出的檢測(cè)方法與ELISA Kits相比，具有更高的靈敏度(檢測(cè)下限降低了3個(gè)數(shù)量級(jí))。

僅對(duì)比檢測(cè)范圍與檢測(cè)下限不足以說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所提出的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。我們采用本實(shí)驗(yàn)所提出的檢測(cè)方法與人C反應(yīng)ELISA Kits對(duì)同一真實(shí)血清樣品再次進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè)。因?yàn)椋緦?shí)驗(yàn)所提出方法與ELISA Kits的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍不在同一數(shù)量級(jí)且無(wú)重疊區(qū)域。為了嚴(yán)謹(jǐn)起見(jiàn)，ELISA Kits直接檢測(cè)100%血清原液。而本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的免疫傳感器則檢測(cè)稀釋100倍后的1%血清，再通過(guò)稀釋倍數(shù)計(jì)算得到血清原液中CRP的濃度。在真實(shí)血清樣本中，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的免疫傳感器同商業(yè)試劑盒對(duì)比僅有-3.4%的誤差。結(jié)果證實(shí)所提出的夾心型免疫傳感器有可靠的準(zhǔn)確度，具有實(shí)用性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于Au NPs@C3N4與多孔有機(jī)框架材料Cd-MOF-74，構(gòu)建了一種新的夾心型免疫傳感器用于CRP的定量檢測(cè)。本文構(gòu)建的夾心型免疫傳感器在CRP含量為0.1～100 ng/mL范圍內(nèi)具有較高的靈敏度，檢出限(S/N=3)為33.3 pg/mL。將該免疫傳感器在對(duì)實(shí)際血清樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收檢測(cè)，并與ELISA Kits作對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該夾心型免疫傳感器在臨床上CRP的監(jiān)測(cè)中有良好的應(yīng)用前景。