張朝寧，余臣祖

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

放射性肺損傷是胸部腫瘤放療不可避免的并發(fā)癥，包括放射性肺炎和放射性肺纖維化，發(fā)生率約為25%，不僅是限制放療的主要因素，還嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。放射性肺損傷發(fā)生機(jī)制尚不明確，目前臨床無理想防治藥物，若不能盡早控制疾病進(jìn)展，將會出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的放射性肺纖維化，最終導(dǎo)致患者呼吸衰竭甚至死亡[3]。研究表明，PI3K/Akt信號通路參與放射性肺損傷的發(fā)生，抑制Akt磷酸化，可抑制膠原蛋白沉積，減輕肺纖維化[4-6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，敦煌醫(yī)學(xué)古方大補(bǔ)脾湯可改善放射性肺損傷大鼠肺部病理損害，抑制多種與放射性肺損傷密切相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)[7]，但是否與PI3K/Akt信號通路有關(guān)尚待研究?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過X射線照射大鼠右肺建立放射性肺損傷大鼠模型，觀察大補(bǔ)脾湯對模型大鼠PI3K/Akt信號通路的影響，進(jìn)一步探討大補(bǔ)脾湯治療放射性肺損傷的作用機(jī)制，為敦煌醫(yī)學(xué)古方的推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠40只，2～3月齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SYXK（甘）2015-0003。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.2 藥物及制備

大補(bǔ)脾湯（人參、炙甘草、干姜各15 g，白術(shù)、麥冬、五味子、旋覆花各5 g），飲片購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥實(shí)驗(yàn)室煎制，濃縮至含原藥材1.214 g /mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號分別為ml003142、ml160611、ml038288、ml337631），免疫組化多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0020），DAB試劑盒、抗體稀釋液、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號分別為ZLI-9018、ZLI-9028、SP9003），兔抗PI3K、Akt、p-Akt抗體（美國GeneTex，貨號分別為GTX111068、GTX121937、GTX128414），兔抗p-PI3K抗體（英國Abcam，貨號ab182651），反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Fast qPCR試劑盒（上海翌圣，貨號分別為10606ES60、H4901030）。X射線輻射儀（美國Faxitron，型號RX650），實(shí)時定量PCR儀（美國Thermo，型號StepOne Plus），高速低溫臺式離心機(jī)（德國Eppendorf，型號TGL-16），PRO200型組織勻漿器（美國Bio-Gen公司），M-2016型石蠟切片機(jī)、TEC-VEM-J2型石蠟包埋機(jī)、VIP-5JR-J2型自動組織脫水機(jī)（德國Leica公司），恒溫培養(yǎng)箱（青島澳柯瑪股份有限公司，型號BC/BD-208HNE），電泳儀（北京六一生物，型號DYY-6D），搖床（德國IKA，型號SK-O180-E），酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad，型號iMark）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SD大鼠分為空白對照組、模型組、單次給藥組、兩次給藥組，每組10只。照射前單次給藥組、兩次給藥組每日予大補(bǔ)脾湯灌胃（按人與大鼠體表面積折算，大鼠每日給藥量約為成人的10倍，即12.14 g/kg），空白對照組和模型組每日予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。照射后，兩次給藥組每日繼續(xù)予大補(bǔ)脾湯灌胃2周（劑量同前），其余各組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積均為2.6 mL。

2.2 造模

參考前期研究中放射性肺損傷大鼠模型制備方法[7]，照射前10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，除空白對照組外，其余各組大鼠用X射線輻射儀單次照射右肺，鉛皮屏蔽身體其余部位。1 Gy/min，吸收劑量為8 Gy。

2.3 標(biāo)本采集

照射后2周頸椎脫臼法處死大鼠，腹主動脈取血，12 000 r/min離心15 min，分離血清，按ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt含量。分離大鼠右肺，冰生理鹽水沖洗，分裝放入凍存管，-80 ℃冰箱凍存。行免疫組化檢測的右肺組織用4%多聚甲醛固定。

2.4 免疫組化檢測大鼠右肺組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

取大鼠右肺組織，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度4 μm），經(jīng)脫蠟、水化、修復(fù)后，封閉加PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt抗體，顯色、脫水、封片。用Olympus光學(xué)顯微鏡讀片拍照，BI-2000免疫組化分析軟件計(jì)算圖片平均灰度值，蛋白相對表達(dá)量用平均灰度值表示，灰度值越大，蛋白表達(dá)量越低。

2.5 qPCR檢測大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達(dá)

取大鼠右肺組織，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，進(jìn)行qPCR。反應(yīng)體系：SYBR Fast qPCR Mix（2×）10 μL，引物2 μL，cDNA 2 μL，加滅菌蒸餾水至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，并在GeneBank上核對證實(shí)，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.6 Western blot檢測大鼠右肺組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

取200 mg大鼠右肺組織，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交反應(yīng)，最后曝光顯影觀察，采用Image J 6.0對條帶量化分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊用Dunnett’s檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 大補(bǔ)脾湯對模型大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K/（pg/mL） Akt/（μmol/L） p-PI3K/（pg/mL） p-Akt/（μmol/L）空白對照組 10 806.55±13.86 23.95±0.79 815.79±30.96 11.85±0.51模型組 10 881.55±15.31** 28.18±0.57** 942.98±49.00** 13.41±0.52**單次給藥組 10 829.17± 9.92# 25.29±0.86# 873.25±48.13# 12.53±0.55#兩次給藥組 10 795.04±16.82## 24.67±0.53## 829.39±40.03## 11.55±0.53##

4.2 大補(bǔ)脾湯對模型大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt陽性表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt在正常大鼠肺組織中表達(dá)較少，經(jīng)X射線照射后，在支氣管黏膜周圍表達(dá)增強(qiáng)，單次給藥組陽性表達(dá)減弱，兩次給藥組陽性表達(dá)減弱更為明顯。與空白對照組比較，模型組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠右肺組織PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt陽性表達(dá)（免疫組化染色，×40）

表3 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt陽性表達(dá)比較（±s，平均灰度值）

表3 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt陽性表達(dá)比較（±s，平均灰度值）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K Akt p-PI3K p-Akt空白對照組 10 0.35±0.03 0.30±0.02 0.34±0.02 0.33±0.03模型組 10 0.21±0.02** 0.20±0.02** 0.22±0.02** 0.22±0.03**單次給藥組 10 0.29±0.02# 0.25±0.03# 0.29±0.02# 0.25±0.03#兩次給藥組 10 0.24±0.01## 0.21±0.02## 0.24±0.03## 0.22±0.04##

4.3 大補(bǔ)脾湯對模型大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K Akt空白對照組 10 1.00±0.05 1.00±0.06模型組 10 1.72±0.09** 1.75±0.14**單次給藥組 10 1.46±0.03# 1.20±0.04#兩次給藥組 10 1.10±0.05## 1.10±0.08##

4.4 大補(bǔ)脾湯對模型大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，單次給藥組、兩次給藥組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖2。

表5 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

表5 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) PI3K Akt 空白對照組 10 1.00±0.08 1.00±0.03 模型組 10 1.87±0.21** 1.92±0.06** 單次給藥組 10 1.46±0.16# 1.40±0.06# 兩次給藥組 10 0.85±0.07## 0.93±0.04## p-PI3K p-Akt1.00±0.08 1.00±0.08 1.44±0.02** 1.82±0.16**1.20±0.11# 1.50±0.15#0.95±0.08## 1.17±0.10##

圖2 各組大鼠右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白免疫印跡圖

5 討論

當(dāng)肺組織遭受電離輻射時，會引起肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷或凋亡，誘導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞發(fā)生一系列炎癥反應(yīng)和趨化，聚集在組織損傷部位，進(jìn)而導(dǎo)致大量炎癥因子、趨化因子和生長因子釋放，當(dāng)這種損害持續(xù)時，最終會導(dǎo)致肺纖維化[8-9]。

PI3K/Akt信號通路參與肺組織損傷，在體外循環(huán)相關(guān)肺損傷大鼠模型中，PI3K/Akt信號通路通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用[10-11]。PI3K存在于細(xì)胞中，通過磷酸化細(xì)胞膜上的家族成員，募集和激活下游一系列靶分子（如Akt），Akt是PI3K下游的重要激酶之一，Akt被活化后會參與中性粒細(xì)胞凋亡，通過調(diào)控Akt活性可抑制肺組織炎癥反應(yīng)[12-13]。

此外，PI3K/Akt通路是介導(dǎo)肺纖維化的重要信號通路。Tsoyi等[14]發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路可抑制成纖維細(xì)胞激活，減輕放射線誘導(dǎo)的肺纖維化。脂多糖通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制自噬，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)肺纖維化[15]。彭文潘等[16]發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路是陳皮治療肺纖維化的潛在作用通路之一。饒鴻宇等[17]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)肺活血膠囊通過PI3K/Akt等關(guān)鍵信號通路緩解患者肺纖維化程度。因而，PI3K/Akt信號通路可作為防治放射性肺損傷的作用靶點(diǎn)之一。

大補(bǔ)脾湯出自敦煌醫(yī)學(xué)卷子《輔行訣臟腑用藥法要》，主治脾氣大疲，飲食不消，時自吐利，其人枯瘦如柴，立不可動轉(zhuǎn)，口中苦，干渴，汗出，氣急，脈微而時結(jié)者。方中人參益氣生津，炙甘草、白術(shù)健脾益氣，干姜溫中散寒，麥冬益胃生津，五味子斂肺生津，旋覆花降逆止嘔。諸藥合用，共奏益氣生津、補(bǔ)脾益肺之功。

肺屬金，脾屬土，脾為肺之母臟，培土生金法是根據(jù)“虛則補(bǔ)其母”原則，通過補(bǔ)益脾氣而達(dá)到補(bǔ)益肺氣。大補(bǔ)脾湯切合胸部惡性腫瘤放療患者因射線導(dǎo)致的肺脾氣陰虧虛之病機(jī)特點(diǎn)，是培土生金理論的具體體現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，大鼠右肺受8 Gy X射線照射后，與空白對照組比較，模型組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯增加（P＜0.01），右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），表明PI3K/Akt信號通路表達(dá)異常，參與介導(dǎo)了放射性肺損傷的發(fā)生。與模型組比較，單次給藥組和兩次給藥組大鼠血清PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt含量明顯減少（P＜0.05，P＜0.01），右肺組織PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），表明大補(bǔ)脾湯可抑制PI3K、Akt磷酸化，調(diào)控PI3K/Akt信號通路，從而發(fā)揮對放射性肺損傷大鼠的保護(hù)作用。其中，兩次給藥組大鼠各項(xiàng)指標(biāo)變化更明顯，說明照射前和照射后兩次給藥療效最佳。

綜上所述，PI3K/Akt信號通路參與介導(dǎo)了放射性肺損傷的發(fā)生，大補(bǔ)脾湯通過抑制PI3K、Akt磷酸化，調(diào)控PI3K/Akt信號通路，發(fā)揮對放射性肺損傷的保護(hù)作用。