李彩云，肖青，李鑫輝，陳聰，杜建芳，王靜雯，陳欣

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是威脅人類(lèi)生命健康的主要疾病之一，早期恢復(fù)缺血心肌再灌注可顯著提高患者存活率，但易引發(fā)心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI）[1-2]，因此研發(fā)MIRI的靶點(diǎn)藥物對(duì)防治AMI具有重要意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）具有較強(qiáng)的促血管生成和修復(fù)血管內(nèi)皮功能[3]。Morishita等[4]研究表明，循環(huán)EPCs具有分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的能力，在心肌缺血和血管損傷時(shí)，EPCs可誘導(dǎo)血管生成和促進(jìn)血管修復(fù)。中藥干預(yù)可調(diào)控EPCs歸巢、增殖及分化，并可增強(qiáng)其保護(hù)心肌的作用[5]。Li等[6]研究表明，丹酚酸A能增加EPCs數(shù)量，提高EPCs遷移能力，促進(jìn)缺血心肌組織血管新生。另有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路參與了MIRI引起的炎癥和凋亡[7]。前期臨床研究顯示，丹參通絡(luò)解毒湯可治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛[8]，但有關(guān)丹參通絡(luò)解毒湯保護(hù)心肌的作用機(jī)制尚未完全明了。本研究從PI3K/Akt信號(hào)通路觀(guān)察丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合EPCs對(duì)MIRI模型大鼠心肌損傷的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為研發(fā)MIRI的靶點(diǎn)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

丹參通絡(luò)解毒湯（丹參15 g，玄參15 g，當(dāng)歸10 g，梔子15 g，黃連6 g，黃芪30 g），飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，常規(guī)煎煮、濃縮至含原藥材3.5 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠，3～4周齡20只，體質(zhì)量90～110 g；10～12周齡60只，體質(zhì)量180～220 g，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，明暗12 h循環(huán)，普通詞料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.3 主要試劑與儀器

內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基（EBM-2，美國(guó)Lonza公司，貨號(hào)CC3156），LY294002（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)S1105），p-PI3K一抗（美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)SAB1300436），p-Akt一抗（美國(guó)CST公司，貨號(hào)AB1019），F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗大鼠CD133（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)Abp52923），PE標(biāo)記山羊抗大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（VEGFR-2，美國(guó)Epitomics公司，貨號(hào)2296-1）。RM-6280型生理信號(hào)采集系統(tǒng)（成都儀器廠(chǎng)），HZQ-QB型恒溫振蕩搖床（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司），GE-100型凝膠電泳儀（杭州大和熱磁電子有限公司），IX71型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），DH-140型小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾特生物科技公司）。

1.4 內(nèi)皮祖細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

取3～4周齡SD大鼠，脛骨及股骨骨髓腔中采集細(xì)胞，密度梯度離心法及差數(shù)貼壁法分離EPCs，鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。免疫熒光染色鑒定EPCs，取培養(yǎng)第10～14日細(xì)胞，接種至24孔板，4%多聚甲醛固定爬片，加入FITC標(biāo)記兔抗大鼠CD133和PE標(biāo)記山羊抗大鼠VEGFR-2孵育過(guò)夜，滴加二抗孵育，DAPI染細(xì)胞核，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察。

1.5 分組、造模及給藥

將10～12周齡SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、EPCs組、丹參通絡(luò)解毒湯組（中藥組）、丹參通絡(luò)解毒湯＋EPCs組（聯(lián)合組）、丹參通絡(luò)解毒湯＋EPCs＋PI3K阻斷劑組（阻斷劑組），每組10只。參考文獻(xiàn)[9]方法，采用左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法制備MIRI大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉并固定，氣管切開(kāi)處接小動(dòng)物呼吸機(jī)，暴露胸腔，在左心耳根部1～2 mm處進(jìn)針，結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，心電圖顯示ST段弓背向上抬高，QRS波群改變，J點(diǎn)偏移超過(guò)0.1 mV，缺血區(qū)心肌顏色變白；結(jié)扎30 min后松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)實(shí)現(xiàn)再灌注，ST段出現(xiàn)回落，可見(jiàn)梗死區(qū)心肌充血，表明再灌注成功，關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組只穿線(xiàn)不結(jié)扎。EPCs組、聯(lián)合組和阻斷劑組大鼠術(shù)后尾靜脈注射含1.0×106個(gè)EPCs/pLVX-IRES-ZsGreen Vector的PBS 1 mL，其余各組大鼠尾靜脈注射1 mL PBS；阻斷劑組大鼠尾靜脈注射LY294002稀釋液（0.3 mg/kg）[10]，中藥組、聯(lián)合組和阻斷劑組大鼠術(shù)后每日予丹參通絡(luò)解毒湯藥液灌胃，參照人與大鼠體表面積換算給藥劑量，相當(dāng)于原藥材18.125 g/kg，給藥體積10 mL/kg，其余各組予等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d。

1.6 心功能檢測(cè)

切開(kāi)大鼠氣管，接呼吸機(jī)輔助通氣后，動(dòng)脈夾阻斷右頸總動(dòng)脈血流，并在其上剪一“V”字切口，將其充滿(mǎn)肝素水，一端連接RM-6280型生理信號(hào)采集系統(tǒng)PE-50導(dǎo)管，插管至左心室，監(jiān)測(cè)左心室形成壓（LVDP）、左心室收縮壓（LVSP）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.7 病理觀(guān)察

取大鼠心肌組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（4 μm），放入二甲苯中浸泡，行HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察心肌組織病理形態(tài)。

1.8 Western blot檢測(cè)

取大鼠心肌組織，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，加入稀釋的p-PI3K、p-Akt一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗（1∶3 000），37 ℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image Pro Plus 6.0軟件分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，符合正態(tài)分布及方差齊性用方差分析，兩兩比較用LSD法，方差不齊用Games-Howell檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定

對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察VEGFR-2、CD133陽(yáng)性表達(dá)，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為EPCs。見(jiàn)圖1。

圖1 EPCs VEGFR-2和CD133陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×100）

2.2 丹參通絡(luò)解毒湯和內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)模型大鼠心功能的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，EPCs組、中藥組、聯(lián)合組及阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與EPCs組比較，中藥組、聯(lián)合組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）；與中藥組比較，聯(lián)合組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯升高（P＜0.01），阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）；與聯(lián)合組比較，阻斷劑組大鼠LVDP、LVSP和LVEF明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠LVDP、LVSP和LVEF比較（±s）

表1 各組大鼠LVDP、LVSP和LVEF比較（±s）

注：1 mm Hg＝0.133 kPa；與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與EPCs組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥組比較，▲▲P＜0.01；與聯(lián)合組比較，★★P＜0.01

組別 只數(shù) LVDP/mm Hg LVSP/mm Hg LVEF/%假手術(shù)組 10 80.03±3.54 125.50±3.31 85.75±2.21模型組 10 50.50±3.57** 92.30±3.43** 41.49±3.47**EPCs組 10 62.61±3.59## 105.94±4.45## 65.86±2.97##中藥組 10 65.90±2.96##△ 109.96±4.40##△ 68.75±2.49##△聯(lián)合組 10 72.67±3.79##△△▲▲ 115.90±2.74##△△▲▲ 75.56±3.46##△△▲▲阻斷劑組 10 53.68±3.53#△△▲▲★★ 96.03±2.78#△△▲▲★★ 44.58±2.44#△△▲▲★★

2.3 丹參通絡(luò)解毒湯和內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)模型大鼠心肌組織形態(tài)的影響

假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列較整齊，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌纖維排列紊亂、腫脹，心肌組織間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且可見(jiàn)部分心肌細(xì)胞壞死；EPCs組大鼠心肌纖維排列較模型組整齊，心肌細(xì)胞壞死程度減輕；中藥組大鼠心肌纖維排列較EPCs組整齊，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；聯(lián)合組大鼠心肌纖維排列較整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較EPCs組及中藥組有所改善；阻斷劑組大鼠心肌纖維排列紊亂，心肌纖維腫脹及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，并可見(jiàn)部分心肌細(xì)胞變性及壞死。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，×400）

2.4 丹參通絡(luò)解毒湯和內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)模型大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，EPCs組、中藥組、聯(lián)合組及阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）；與EPCs組比較，中藥組及聯(lián)合組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與中藥組比較，聯(lián)合組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與聯(lián)合組比較，阻斷劑組大鼠心肌組織p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組相比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與EPCs組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與中藥組比較，▲▲P＜0.01；與聯(lián)合組比較，★★P＜0.01

組別 只數(shù) p-PI3K/GAPDH p-Akt/GAPDH假手術(shù)組 10 0.66±0.04 0.04±0.02模型組 10 0.89±0.04** 0.09±0.02**EPCs組 10 1.01±0.02## 0.17±0.02##中藥組 10 1.05±0.03##△ 0.20±0.02##△聯(lián)合組 10 1.20±0.03##△△▲▲ 0.25±0.03##△△▲▲阻斷劑組 10 0.92±0.04#△△▲▲★★ 0.12±0.03#△△▲▲★★

圖3 各組大鼠p-PI3K、p-Akt蛋白免疫印跡圖

3 討論

目前臨床對(duì)AMI多采用介入、抗凝治療，但無(wú)法調(diào)節(jié)梗死后心肌的再生和修復(fù)能力，因此效果并不理想。EPCs是骨髓和外周血的干細(xì)胞，具有較強(qiáng)的促血管生成和修復(fù)血管內(nèi)皮功能[11]。中藥可通過(guò)調(diào)控EPCs促進(jìn)心血管疾病恢復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能改善體外培養(yǎng)的人EPCs生物學(xué)功能，具有調(diào)節(jié)EPCs介導(dǎo)的血管新生潛能[12]，黃芪多糖可通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及相關(guān)受體的表達(dá)保護(hù)EPCs[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，EPCs組較模型組心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞壞死程度減輕，LVDP、LVSP、LVEF明顯升高（P＜0.01），提示EPCs移植可改善MIRI病理形態(tài)，提高心功能，保護(hù)心肌組織。EPCs聯(lián)合丹參通絡(luò)解毒湯灌胃治療后，大鼠心肌纖維較單用EPCs或丹參通絡(luò)解毒湯排列整齊，心功能明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明丹參通絡(luò)解毒湯能促進(jìn)EPCs改善MIRI病理形態(tài)及心功能，保護(hù)心肌組織。

PI3K/Akt信號(hào)通路是再灌注損傷補(bǔ)救激酶信號(hào)通路之一，在MIRI中有重要作用。PI3K可被細(xì)胞外信號(hào)通路受體激活，活化的PI3K以磷酸化形式存在，可進(jìn)一步激活二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）和三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），PIP3可將細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)至下游Akt，p-Akt具有保護(hù)MIRI的作用[14]。馬陽(yáng)等[15]研究表明，Id-1和E2-2協(xié)同對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路起調(diào)控作用，進(jìn)而影響EPCs的增殖。吳海衛(wèi)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素能降低EPCs凋亡率，其作用依賴(lài)PI3K/Akt信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，EPCs聯(lián)合丹參通絡(luò)解毒湯灌胃治療后，大鼠心肌組織p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)較單用EPCs或丹參通絡(luò)解毒湯明顯升高（P＜0.01），采用PI3K阻斷劑后，p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），提示丹參通絡(luò)解毒湯可促進(jìn)EPCs保護(hù)心肌組織，可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

MIRI可歸屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心悸”等范疇?；稹⒍?、瘀在胸痹發(fā)病中有重要作用，火熱積聚成毒，損傷心營(yíng)，灼傷血脈，日久成瘀，導(dǎo)致“火”“毒”“瘀”積聚于心脈，引發(fā)胸痹[17]。MIRI從血瘀向毒證轉(zhuǎn)化時(shí)，增加了急性心血管事件的發(fā)生，治療當(dāng)用活血解毒法[18]。丹參通絡(luò)解毒湯由丹參、玄參、當(dāng)歸、黃連、梔子、黃芪組成，具有活血通絡(luò)、清營(yíng)解毒、益氣養(yǎng)陰功效。本實(shí)驗(yàn)雖未完全闡明丹參通絡(luò)解毒湯促進(jìn)EPCs保護(hù)MIRI的作用機(jī)制，但結(jié)果提示，該方干預(yù)EPCs保護(hù)MIRI具有優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、協(xié)同增效的特點(diǎn)，推測(cè)該方還可能在EPCs動(dòng)員、歸巢、增殖和分化中起多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，有待今后進(jìn)一步研究。

綜上，丹參通絡(luò)解毒湯聯(lián)合EPCs移植可顯著保護(hù)MIRI，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果可為中醫(yī)藥干預(yù)干細(xì)胞移植、防治AMI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。