梁子成，陳泓秀，文璐，張振，郭垠梅，田莎，黃曉蒂

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208

細(xì)胞焦亡是發(fā)生在炎性小體激活下游的細(xì)胞程序性死亡，是免疫反應(yīng)的重要組成部分[1]。細(xì)胞焦亡可發(fā)生在巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等諸多細(xì)胞，是神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等眾多系統(tǒng)疾病的重要病機(jī)[2]。此外，細(xì)胞焦亡與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。因此，積極探討細(xì)胞焦亡相關(guān)機(jī)制、探索干預(yù)方法并開發(fā)相關(guān)藥物已成為研究熱點(diǎn)之一。

近年來，中藥與細(xì)胞焦亡相關(guān)研究迅速增加，存在一定數(shù)量的中藥干預(yù)細(xì)胞焦亡研究報(bào)道[4-6]。然而，現(xiàn)有報(bào)道多針對不同領(lǐng)域，且多為中藥單體或單藥調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的作用研究，未能體現(xiàn)中藥多種類、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。因此，系統(tǒng)研究細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)、化合物及中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)和用藥規(guī)律存在必要性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)集藥理學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科優(yōu)勢于一體，可系統(tǒng)分析靶點(diǎn)、化合物及中藥的關(guān)聯(lián)性[7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)、化合物與中藥之間的關(guān)系，借助分子對接驗(yàn)證靶點(diǎn)與化合物的結(jié)合能力，分析相關(guān)中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和用藥規(guī)律，以期為中藥調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的理論探討、臨床研究及藥物研發(fā)提供參考。

1 資料與方法

1.1 靶點(diǎn)獲取及靶點(diǎn)機(jī)制分析

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、CTD（http://ctdbase.org/）、GenCLip 3（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）數(shù)據(jù)庫，以“Pyroptosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)。利用UniProt（https://www.uniprot.org/）、STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”，獲得靶點(diǎn)全稱。采用R3.6.3軟件對靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG富集分析。

1.2 候選化合物篩選及靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）共納入502味中藥、13 729個(gè)化合物及相關(guān)的3 339個(gè)靶點(diǎn)，其中包含成藥類似性正相關(guān)的類藥性（drug likeness，DL）等信息[8]。以細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)全稱為檢索詞，通過TCMSP獲取細(xì)胞焦亡相關(guān)化合物的名稱、DL、PubChem CID等信息，以DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選，獲得候選化合物。將潛在靶點(diǎn)、候選化合物導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)，并利用其插件CytoNCA進(jìn)行分析。

1.3 分子對接驗(yàn)證

為驗(yàn)證細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)與候選化合物作用關(guān)系的結(jié)合度，根據(jù)靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，選取度值前3位的靶點(diǎn)與度值前5位的化合物進(jìn)行分子對接。通過PDB數(shù)據(jù)庫（http://www1.rcsb.org/）以靶點(diǎn)蛋白全稱獲取蛋白質(zhì)模型文件，通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）以PubChem CID獲取小分子配體文件，經(jīng)AutoDockTools處理后，使用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接，使用PyMOL軟件作圖及繪制氫鍵。

1.4 候選中藥獲取及靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用TCMSP收集含有候選化合物的中藥，并根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）[9]、《中藥學(xué)》[10]進(jìn)行篩選得到候選中藥，利用中醫(yī)傳承輔助平臺V2.5進(jìn)行中藥性味歸經(jīng)分析，導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)及候選化合物

通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)139個(gè)，其中可通過TCMSP匹配到化合物的靶點(diǎn)34個(gè)，其中化合物DL≥0.18的相關(guān)靶點(diǎn)31個(gè)，將31個(gè)靶點(diǎn)定義為化合物作用于細(xì)胞焦亡的潛在靶點(diǎn)（見表1）。以潛在靶點(diǎn)名稱與“DL≥0.18”為條件，通過TCMSP檢索獲得化合物101個(gè)，將其定義為細(xì)胞焦亡相關(guān)候選化合物，其中度值≥6的化合物見表2。

表1 化合物作用于細(xì)胞焦亡的潛在靶點(diǎn)

表2 細(xì)胞焦亡相關(guān)候選化合物信息（度值≥6）

2.2 潛在靶點(diǎn)機(jī)制分析

潛在靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果顯示：生物過程（biological process，BP）主要參與脂多糖反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、I-κB激酶/NF-κB信號傳導(dǎo)，細(xì)胞組分（cellular component，CC）主要與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等相關(guān)，分子功能（molecular function，MF）主要集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合、半胱氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，主要信號通路為NOD樣信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路，此外，可能與細(xì)胞凋亡、沙門菌感染、甲型流感、志賀菌等相關(guān)。見圖1。

圖1 化合物作用于細(xì)胞焦亡的潛在靶點(diǎn)機(jī)制分析

2.3 靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

將潛在靶點(diǎn)與候選化合物構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)（見圖2），該網(wǎng)絡(luò)由132個(gè)節(jié)點(diǎn)與313條邊構(gòu)成。網(wǎng)絡(luò)中，度值前3位的靶點(diǎn)為CASP3、TNF、BCL2，分別與50、39、37個(gè)化合物相關(guān)；度值前5位的化合物為槲皮素（quercetin）、染料木黃酮（genistein）、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate]、漆黃素（fisetin）、熊果酸（ursolic acid），分別與15、13、13、11、10個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)。

圖2 細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)

2.4 分子對接結(jié)果

將高度值靶點(diǎn)CASP3、TNF、BCL2與高度值化合物槲皮素、染料木黃酮、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯、漆黃素、熊果酸進(jìn)行分子對接，靶點(diǎn)CASP3、TNF、BCL2的PDB ID分別為1RE1、2AZ5、6O0p。結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol表示靶點(diǎn)與化合物結(jié)合活性較好。對接結(jié)果顯示，各靶點(diǎn)與化合物的對接結(jié)合能均小于-6.0 kcal/mol，最低為-10.0 kcal/mol，最高為-6.3 kcal/mol。氫鍵數(shù)是評估靶點(diǎn)蛋白-分子配體結(jié)合能力的重要指標(biāo)。對接結(jié)果顯示，CASP3與槲皮素、表沒食子兒茶素表沒食子酸酯、漆黃素，TNF與表沒食子兒茶素沒食子酸酯均形成了5個(gè)氫鍵，表明其對接質(zhì)量較好，見表3。依據(jù)結(jié)合能≤-7.5 kcal/mol及氫鍵數(shù)選擇部分對接結(jié)果進(jìn)行展示，見圖3。

圖3 細(xì)胞焦亡靶點(diǎn)與化合物分子對接示意圖

表3 細(xì)胞焦亡相關(guān)高度值靶點(diǎn)與化合物分子對接結(jié)果

2.5 靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP獲得101個(gè)候選化合物的相關(guān)中藥共423種，其中2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）及《中藥學(xué)》收錄373種，將其定義為候選中藥。以潛在靶點(diǎn)、候選化合物及候選中藥構(gòu)建靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)（見圖4），網(wǎng)絡(luò)中包含505個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 742條邊。度值前4位的中藥為麻黃（70）、沙棘（70）、紅花（68）、連翹（68），靶點(diǎn)數(shù)前4位的中藥為沙棘（21）、杜仲（20）、女貞子（20）、枇杷葉（20），見圖5。

圖4 細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)

圖5 細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)高度值和靶點(diǎn)數(shù)中藥（前18位）

2.6 中藥性味歸經(jīng)

應(yīng)用中醫(yī)傳承輔助平臺V2.5對373種候選中藥進(jìn)行性味歸經(jīng)分析，并依據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）及《中藥學(xué)》進(jìn)行核對。結(jié)果以寒性（38.61%）、苦味（36.68%）及入肝經(jīng)（21.48%）、肺經(jīng)（16.78%）藥物居多，見表4、表5、圖6。

圖6 調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡候選中藥歸經(jīng)分析

表4 調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡候選中藥藥性分布

表5 調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡候選中藥藥味分布

3 討論

有別于脹亡、自噬等細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞焦亡表現(xiàn)為細(xì)胞表面形成孔洞，細(xì)胞膜破裂、胞內(nèi)容物外漏等引發(fā)炎癥反應(yīng)[11-12]。細(xì)胞表面孔洞是由于GSDMD受到CASP3的特異性切割，其N末端生成的切片通過胞膜時(shí)形成，而CASP3激活又與腫瘤壞死因子（TNF）誘導(dǎo)作用有關(guān)[13-14]。細(xì)胞焦亡的發(fā)生和表現(xiàn)形式與肝、腎疾病[15-16]及腦損傷[17]、糖尿病[18]等發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此，對細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，可為相關(guān)疾病研究提供理論參考。

對細(xì)胞焦亡潛在靶點(diǎn)的GO富集分析結(jié)果顯示，潛在靶點(diǎn)參與的生物過程主要為脂多糖反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、I-κB激酶/NF-κB信號傳導(dǎo)等。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制脂多糖可通過非經(jīng)典途徑抑制細(xì)胞焦亡發(fā)生，其機(jī)制是外膜囊和冠苷基結(jié)合蛋白介導(dǎo)脂多糖直接與胞內(nèi)Caspases家族受體結(jié)合，脂多糖可誘導(dǎo)Caspases激活，進(jìn)而導(dǎo)致GSDMD發(fā)生裂解[19-20]，而病原體和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式可與胞膜上Toll樣受體共同影響核因子-κB（NF-κB），觸發(fā)炎性小體轉(zhuǎn)錄，炎性小體可介導(dǎo)焦亡發(fā)生[21]。潛在靶點(diǎn)主要與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等細(xì)胞組分相關(guān)，提示細(xì)胞焦亡形成過程中，孔洞形成位置可能與潛在靶點(diǎn)作用相關(guān)。潛在靶點(diǎn)的分子功能主要集中在細(xì)胞因子受體結(jié)合、半胱氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等，顯示潛在靶點(diǎn)主要與半胱氨酸的活性反應(yīng)相關(guān)，而Caspases家族炎性蛋白酶的活性在焦亡發(fā)生過程中起決定性作用[22]。KEGG富集分析結(jié)果顯示，細(xì)胞焦亡潛在靶點(diǎn)的主要相關(guān)信號通路為NOD樣信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路等。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NOD受體家族成員NLRP3的活化，可有效減少GSDMD N末端切片的生成，進(jìn)而抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生[23]。Hu等[24]使用馬錢子苷抑制NF-κB信號通路，可有效降低軟骨基質(zhì)分解代謝，抑制關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細(xì)胞焦亡。Tavakoli等[25]發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞來源的外來體可抑制Toll樣受體信號通路相關(guān)的TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡。TNF-α是TNF信號通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。Pei等[26]發(fā)現(xiàn)，TNF-α是三氧化二砷誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡的關(guān)鍵靶點(diǎn)，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，抑制TNF-α產(chǎn)生可有效減少焦亡的發(fā)生。KEGG富集分析結(jié)果提示，細(xì)胞焦亡可能與一些疾病和病理過程的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性，如沙門菌、甲型流感病毒、志賀菌感染。沙門菌的致病性分泌系統(tǒng)與鞭毛可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞焦亡，甲型流感病毒感染通過Ⅰ型干擾素信號通路引起呼吸上皮細(xì)胞發(fā)生焦亡，志賀菌可通過效應(yīng)蛋白IpaB及其離子通道活性誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，從而對宿主感染產(chǎn)生保護(hù)性炎癥反應(yīng)[27-29]。綜上可見，潛在靶點(diǎn)通過諸多機(jī)制參與調(diào)控細(xì)胞焦亡，富集分析的部分結(jié)果已在現(xiàn)有研究中得到較好的證實(shí)。同時(shí)，富集分析發(fā)現(xiàn)存在尚未報(bào)道的機(jī)制，可為后續(xù)相關(guān)領(lǐng)域研究提供參考，如焦亡發(fā)生的細(xì)胞多泡體定位、百日咳與細(xì)胞焦亡的關(guān)系等。

靶點(diǎn)-化合物網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)可直觀體現(xiàn)中藥的多種類、多成分、多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)。CASP3是細(xì)胞焦亡的介導(dǎo)因子，在調(diào)節(jié)GSDMD裂解作用中起關(guān)鍵作用，CASP3缺失可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)發(fā)生改變，引發(fā)組織器官發(fā)生損害[30]。TNF-α表達(dá)增加可促進(jìn)焦亡的發(fā)生，而BCL2可減弱D275處CASP1、4、5對GSDMD的裂解，增強(qiáng)D87處GSDMD的裂解，兩者均對細(xì)胞焦亡的發(fā)生具有調(diào)節(jié)作用[31-32]。本研究結(jié)果顯示，多個(gè)化合物可與多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用，尤以槲皮素關(guān)聯(lián)最多。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可有效清除H2O2和HOCl，降低IL-1β水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[33]。分子對接結(jié)果提示，靶蛋白與小分子配體結(jié)合能力較好，驗(yàn)證了靶點(diǎn)-化合物互動的可靠性，可為細(xì)胞焦亡相關(guān)的新藥開發(fā)提供思路。

本研究發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞焦亡相關(guān)的中藥主要有麻黃、沙棘、敗醬草、杜仲、女貞子、金銀花、半枝蓮、木蝴蝶、白果等。麻黃、敗醬草、杜仲、女貞子、金銀花等所含山柰酚可通過抑制CASP1的表達(dá)和活性，增加TLR4、NLRP3的表達(dá)，抑制GSDMD分解，發(fā)揮抑制焦亡發(fā)生的作用[34-35]。燈盞花乙素為半枝蓮有效成分，可調(diào)節(jié)CASP1活化及成熟IL-1β、HMGB1的釋放，降低NLRP3的激活率，抑制焦亡發(fā)生[36-37]。木蝴蝶所含大黃素可通過TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3通路減輕心肌細(xì)胞損傷，抑制心肌細(xì)胞焦亡[38]。其余中藥尚未見細(xì)胞焦亡相關(guān)報(bào)道，但有研究顯示其有效成分或提取物存在干預(yù)炎性小體激活的作用[39-41]，有待進(jìn)一步研究。

現(xiàn)有細(xì)胞焦亡相關(guān)中藥研究多為單藥或單藥成分的動物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，缺少相對全面系統(tǒng)的分析。本研究基于細(xì)胞焦亡相關(guān)中藥的性味歸經(jīng)分析用藥規(guī)律，可較好體現(xiàn)中藥調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的內(nèi)在規(guī)律。細(xì)胞焦亡是一種炎性細(xì)胞死亡方式，以調(diào)控炎性小體來實(shí)現(xiàn)，而體內(nèi)炎性因子聚集處多發(fā)生炎癥發(fā)熱反應(yīng)，與中醫(yī)“火毒”致病的認(rèn)識相符?；鸲舅壑幎喑霈F(xiàn)發(fā)熱、紅腫等體征，用藥以苦寒為主，輔以辛溫，以防傷正。本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞焦亡相關(guān)中藥以寒性、苦味最多，辛溫等為輔，體現(xiàn)了中醫(yī)“太過與不及”理論[42]。細(xì)胞焦亡相關(guān)中藥多入肝經(jīng)、肺經(jīng)。肝主藏血、主疏泄，焦亡發(fā)生依賴于炎性因子的調(diào)控，炎性因子的產(chǎn)生和發(fā)揮作用離不開血液濡養(yǎng)與運(yùn)行；而疏泄功能與炎性因子的代謝相關(guān)，可調(diào)控體內(nèi)炎性因子的分布。肺主一身之氣，協(xié)調(diào)全身氣機(jī)運(yùn)行，氣機(jī)失常則痰濕內(nèi)生，痰濕蘊(yùn)久可內(nèi)生火毒，同時(shí)痰濕也與焦亡的發(fā)生密切相關(guān)[43-44]。由此可見，中藥調(diào)控細(xì)胞焦亡應(yīng)注重對“火毒”的辨證施治，用藥以苦寒清熱解毒為主，輔以辛溫，同時(shí)應(yīng)注重維持肝的藏血與疏泄功能、協(xié)調(diào)肺等諸臟功能。

本研究雖聯(lián)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得較為全面的細(xì)胞焦亡相關(guān)靶點(diǎn)，但因數(shù)據(jù)庫信息更新等因素，可能導(dǎo)致化合物和中藥收集不全。此外，本研究分析了靶點(diǎn)、化合物、中藥之間的關(guān)系及其頻次，但未考慮量效關(guān)系等實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)際因素，所得結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。