余婷婷，袁蓮蓮，李瑩，焦裕冰，申莉莉，王鳳龍，黃坤，王勇，李斌，章松柏，楊金廣

摘? 要：為挖掘具有納米硒化能力的生防菌株，開(kāi)發(fā)煙草病毒病的綠色防治材料，從煙草病毒病重病田塊健株根際土壤中篩選獲得到一株熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens KBD-1，對(duì)其進(jìn)行了納米硒化，采用Real-time PCR和Western blot測(cè)定了兩者對(duì)煙草常見(jiàn)病毒基因表達(dá)的影響，并采用接種法測(cè)定了其對(duì)煙株相應(yīng)病毒病的防治作用。結(jié)果表明，納米硒化后的KBD-1菌體外部存在高密度電子顆粒，在X射線11.22 keV處出現(xiàn)硒的特征吸收峰。納米硒化后的P. fluorescens KBD-1菌液濃度在5×105 cfu/mL（單質(zhì)硒濃度0.25 mg/L）時(shí)，對(duì)煙草花葉病毒（TMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、黃瓜花葉病毒（CMV）、番茄斑萎病毒（TSWV）4種病毒病的防治效果均在88.0%以上，對(duì)CMV防治效果最高達(dá)91.4%，該濃度處理對(duì)煙株促生效果顯著。熒光假單胞菌KBD-1可成功將亞硒酸鈉還原生成納米硒，并能增強(qiáng)原始菌株的抗煙草病毒活性和促生效果。

關(guān)鍵詞：納米硒;熒光假單胞菌;煙草病毒病;病毒抑制;促生作用

Inhibition of Tobacco Virus Diseases by Nano-selenated Pseudomonas fluorescens KBD-1

YU Tingting1，2， YUAN Lianlian2， LI Ying2， JIAO Yubing2， SHEN Lili2， WANG Fenglong2， HUANG Kun3，

WANG Yong4， LI Bin5， ZHANG Songbai1*， YANG Jinguang2*

（1. College of Agronomy， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China; 2. Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 3. Honghe Company of Yunnan Tobacco Company， Kunming 650000， China; 4. Liangshan Company of Sichuan Provincial Tobacco Company， Xichang， Sichuan 615000， China; 5. Sichuan Tobacco Company， Chengdu 610000， China）

Abstract： In order to explore biocontrol strains with nano-selenized ability and develop green antiviral materials to prevent tobacco virus diseases， Pseudomonas fluorescens KBD-1 was identified from the rhizosphere soil of healthy plants in the field with serious tobacco virus diseases. The nano-selenized activity of P. fluorescens KBD-1 was investigated in this study， and its inhibitions against four main tobacco viruses were determined by using the methods including Real-time PCR and Western blot under the treatments of original strain and nano-selenized strain. The results showed that there were high density electron particles outside the nano-selenized KBD-1 and the characteristic absorption peak of selenium appeared at 11.22 keV X-ray. When the concentration of P. fluorescens KBD-1 bacterial fluid after nano-selenization was 5×105 cfu/mL （0.25 mg/L selenium）， the control effects against Tobacco mosaic virus （TMV）， Potato virus Y （PVY）， Cucumber mosaic virus （CMV） and Tomato spotted wilt virus （TSWV） were all above 88.0%， and the highest control effect against CMV was 91.4%. The treatment at this concentration also had significant growth-promoting effect on tobacco plants. This study showed that P. fluorescens KBD-1 successfully reduced sodium selenite to produce nano-selenium， and enhanced the antiviral activity and growth-promoting effect of the original strain.

Keywords： nanometer selenium; Pseudomonas fluorescens; tobacco virus diseases; virus inhibition; role in the growth

病毒病是煙草普遍發(fā)生的一類侵染性病害[1]，其中造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的種類主要包括煙草花葉病毒?。═MV）、馬鈴薯Y病毒?。≒VY）、黃瓜花葉病毒病（CMV）、番茄斑萎病毒病（TSWV）等[2]。研究表明TMV、CMV、PVY復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍，產(chǎn)量和品質(zhì)受損嚴(yán)重[3-4]，防治主要以早期預(yù)防為主，但收效甚微，迄今還沒(méi)有效果很好的單一防治措施，病害發(fā)生后有效治療藥劑更是缺乏[5]。

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司貴州省公司遵義市公司項(xiàng)目（201921）;中國(guó)煙草總公司四川省公司科技項(xiàng)目（SCYC202008）;中國(guó)煙草總公司項(xiàng)目硒是植物必需的微量元素之一[6]，然而，如果硒含量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重健康問(wèn)題。硒有4種價(jià)態(tài)，使用不當(dāng)極易造成硒中毒[7]，而納米硒（納米尺寸的紅色單質(zhì)硒）具有較高吸收率和較低毒性，這使得硒納米化研究具有更重要意義[8]。生物法制備納米硒高效且安全[9-10]，通常利用微生物進(jìn)行生物合成，如固氮紅細(xì)菌（Rhodobacter azotoformans）[11]、假單胞菌（Pseudomonas alcaliphila MBR）[12]等。目前，微生物合成納米硒在醫(yī)學(xué)上用于抗氧化劑[13]、抗菌劑[14]、生物強(qiáng)化劑[15]，工業(yè)上用于環(huán)境凈化劑[16]，農(nóng)業(yè)上可有效減少土壤中鎘污染和水稻鎘積累[17]，而關(guān)于微生物合成納米硒后抗煙草病毒病的研究較少。熒光假單胞菌[18]已被證明可作為生防菌防治植物真菌、細(xì)菌等病害，而熒光假單胞菌及其納米硒化后對(duì)煙草常見(jiàn)病毒病的拮抗作用及對(duì)煙株本身是否有影響尚未得到驗(yàn)證。

本研究篩選了一株對(duì)TMV具有顯著拮抗活性的熒光假單胞菌KBD-1（Pseudomonas fluorescens KBD-1），并制備形成P. fluorescens KBD-1納米硒菌液，探究其納米硒化菌液對(duì)煙草常見(jiàn)病毒TMV、CMV、PVY、TSWV的抑制活性，進(jìn)一步探討其對(duì)煙草的促生效應(yīng)，以期為煙草主要病毒病的綠色防治提供材料準(zhǔn)備和科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)材料? 枯斑三生煙（Nicotiana tabaccum cv. Samsun NN），K326（N. tabaccum cv. K326），TMV、CMV、TSWV、PVY毒源均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)研究中心保存。

熒光假單胞菌KBD-1及其納米硒菌液：從云南騰沖煙草病毒病高發(fā)區(qū)采集健株根際土壤，稱取2 g，加入20 mL ddH2O，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h，靜置后取上清于LB固體培養(yǎng)基劃線，28 ℃培養(yǎng)。鑒定并純化1株熒光假單胞菌菌株，命名為P. fluorescens KBD-1。挑取生長(zhǎng)良好單一菌落接種于LB液體培養(yǎng)基（2瓶，每瓶50 mL），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，隨后其中一瓶以1%接種量加入到150 mL亞硒酸鈉還原菌培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，2～5 d后觀察菌液顏色，待菌液出現(xiàn)紅色，掃描電鏡（Scanning Electron Microscope， SEM）進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定P. fluorescens KBD-1可將亞硒酸鈉還原生成紅色單質(zhì)硒，命名為P. fluorescens KBD-1-Se。

1.1.2? 主要試劑? LB培養(yǎng)基（購(gòu)自北京國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），亞硒酸鈉還原菌培養(yǎng)基：1 L LB液體培養(yǎng)基含1 mmol亞硒酸鈉，TMV、CMV、PVY、TSWV抗體（兔源，Agadia），Actin抗體（鼠源，CWBIO）。

1.2? KBD-1及其納米硒菌液對(duì)煙草病毒病抗性測(cè)定

1.2.1? KBD-1及其納米硒菌液對(duì)煙草常見(jiàn)病毒基因表達(dá)的影響? 各取10 mL KBD-1（濃度為108 cfu/mL）和KBD-1-Se菌液（單質(zhì)硒含量為0.25 mg/L、菌濃度108 cfu/mL），分別與等體積40倍TMV（或CMV、PVY、TSWV）汁液（毒源葉片研磨，1∶40稀釋，過(guò)濾）混合15 min，摩擦接種大小一致的4葉期K326煙株同位葉片1片，每個(gè)處理重復(fù)3株，25 ℃，16 h光照培養(yǎng)，5 d后取接種葉，液氮冷凍。Real-time PCR檢測(cè)：Trizol法提取葉片總RNA，合成cDNA。Actin為內(nèi)參，浸潤(rùn)PBS樣品的CT值為標(biāo)準(zhǔn)1，用相對(duì)CT法公式2-??CT，利用表1引物于7500 Fast上進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，計(jì)算不同處理葉片CP基因RNA相對(duì)表達(dá)量。Western blot檢測(cè)：提取接種葉總蛋白，保持上樣蛋白濃度一致，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜封閉1 h，按1∶2000分別稀釋TMV-CP、CMV-CP、PVY-CP、TSWV-CP一抗（兔源）4 ℃孵育過(guò)夜，按1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，搖床上孵育2 h。TBST洗膜后涂抹發(fā)光液ECL（SuperSignal West Pico Trial Kit），于化學(xué)發(fā)光成像分析儀中測(cè)定相應(yīng)病毒CP蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2? KBD-1及其納米硒菌液對(duì)枯斑三生煙葉TMV的室內(nèi)防治效果? 半葉法檢測(cè)試驗(yàn)：按照1.2.1方法制成KBD-1及其納米硒菌液與TMV汁液混合液，摩擦接種長(zhǎng)勢(shì)一致的枯斑三生煙葉片，3次生物重復(fù)，對(duì)照組（亞硒酸鈉還原菌培養(yǎng)基混合等體積40倍TMV汁液），3～5 d調(diào)查枯斑數(shù)，比較防治效果。

1.2.3? KBD-1納米硒菌液對(duì)煙草常見(jiàn)病毒病的田間防治效果? 制備50 L納米硒合成菌液（硒含量為0.25 mg/L、菌濃度5×105 cfu/mL），制備TMV、CMV、PVY、TSWV侵染汁液。無(wú)毒K326煙苗設(shè)4個(gè)小區(qū)，標(biāo)記1（TMV）、2（CMV）、3（PVY）、4（TSWV），小區(qū)間設(shè)保護(hù)行，每小區(qū)50株，5～6葉期接種。共5種處理：處理I，菌液與等體積40倍TMV病毒汁液混合15 min后接種;處理II，先噴菌液，2 h后接種病毒;處理III，先接毒，2 h后噴施菌液。處理PC：寧南霉素與等體積TMV病毒汁液混合作陽(yáng)性對(duì)照;CK，滅菌亞硒酸鈉還原菌培養(yǎng)基混合等體積TMV病毒作空白對(duì)照，每組處理10株煙苗。CMV、PVY、TSWV小區(qū)的處理方式與TMV一致，30 d后調(diào)查發(fā)病率，與空白對(duì)照相比計(jì)算防治效果。

1.2.4? KBD-1及其納米硒菌液對(duì)煙株生長(zhǎng)的影響? 稀釋KBD-1納米硒菌液至單質(zhì)硒含量為0.25 mg/L、菌濃度105 cfu/mL，K326生長(zhǎng)至5～6片真葉，納米硒合成活性菌液灌根處理，緩苗3 d后連續(xù)灌根2次，間隔時(shí)間3 d，每次每株10 mL，以熒光假單胞菌KBD-1菌液（菌濃度105 cfu/mL）、滅菌亞硒酸鈉還原菌培養(yǎng)基灌根作為對(duì)照，重復(fù)3次。末次灌根3 d后調(diào)查鮮質(zhì)量及最大葉長(zhǎng)寬。

2? 結(jié)? 果

2.1? 熒光假單胞菌分離鑒定及納米硒合成菌液制備

經(jīng)掃描電鏡檢測(cè)菌株形態(tài)（圖1），確定分離到一株菌株熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），命名為KBD-1。在活化KBD-1菌液中加入無(wú)色亞硒酸鈉，發(fā)酵2～5 d后，可觀察菌液中有紅色物質(zhì)出現(xiàn)（圖2），結(jié)果暗示KBD-1可將無(wú)色亞硒酸鈉還原成紅色單質(zhì)硒，命名該菌體KBD-1-Se。掃描電鏡（圖3）發(fā)現(xiàn)KBD-1樣品外部存在高密度電子顆粒，繼而對(duì)這些高密度電子顆粒進(jìn)行EDS分析，在11.22 keV出現(xiàn)了硒的特征吸收峰，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]，進(jìn)一步確定KBD-1具有還原特性，可將亞硒酸鈉還原生成紅色單質(zhì)硒。

2.2? KBD-1及KBD-1-Se菌液對(duì)煙草常見(jiàn)病毒基因表達(dá)的抑制作用

利用Real-time PCR和Western blot分別對(duì)KBD-1和KBD-1-Se處理煙草4種常見(jiàn)病毒的CP基因RNA相對(duì)表達(dá)量和CP蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果（圖4、5）顯示， KBD-1與KBD-1-Se菌液均可顯著減少TMV、CMV、PVY、TSWV四種病毒CP基因RNA相對(duì)表達(dá)量和CP蛋白相對(duì)表達(dá)量，且KBD-1-Se處理后TMV、CMV、PVY和TSWV四種病毒CP基因與CP蛋白的表達(dá)量的抑制效果均較KBD-1處理明顯。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了KBD-1-Se對(duì)煙草RNA病毒具有較好的抑制效果，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.3? KBD-1及KBD-1-Se菌液對(duì)枯斑三生煙TMV室內(nèi)防治效果

基于枯斑三生煙的半葉檢測(cè)法測(cè)定，無(wú)論是KBD-1還是KBD-1-Se均對(duì)TMV具有顯著抑制作用，結(jié)果如表2所示，KBD-1與KBD-1-Se對(duì)TMV防治效果分別為89.2%、95.5%，KBD-1-Se的鈍化效率顯著高于KBD-1。結(jié)果表明KBD-1納米硒化后可增強(qiáng)原始菌株對(duì)TMV的抑制作用。

2.4? KBD-1-Se菌液對(duì)煙草常見(jiàn)病毒病的田間防治效果

為探究KBD-1-Se對(duì)煙草常見(jiàn)病毒病的防治效果，利用KBD-1-Se（5×105 cfu/mL）菌液對(duì)煙株和病毒進(jìn)行處理，結(jié)果顯示（表3）KBD-1-Se不同處理對(duì)TMV、CMV、PVY、TSWV均具有抑制作用。

菌液與病毒直接混合抑制效果最佳，防治效果均在88.0%以上，對(duì)CMV防效最高達(dá)91.4%;菌液噴施后接種病毒，防治效果在47.4%～70.5%之間;接種病毒后的菌液噴施，防效不足20.0%，未經(jīng)菌液處理的植株發(fā)病率達(dá)到85.5%以上。以上結(jié)果表明菌液與病毒混合接種后，菌液具有良好的抑制作用，并具有預(yù)防效果。

2.5? KBD-1及KBD-1-Se菌液對(duì)煙株的促生作用

為驗(yàn)證KBD-1-Se對(duì)煙草的生長(zhǎng)調(diào)控，連續(xù)3次灌施KBD-1-Se（單質(zhì)硒含量0.25 mg/L，濃度5×105 cfu/mL）后，表4顯示，K326煙株鮮質(zhì)量及最大葉長(zhǎng)寬均高于KBD-1菌液和CK處理，促生效果明顯。

3? 討? 論

在煙葉生產(chǎn)過(guò)程中，病毒消毒鈍化和煙株促生催長(zhǎng)是常見(jiàn)煙草病毒病防控途徑，一是通過(guò)消毒和病毒鈍化，降低病毒初始侵染源，二是在病毒侵染后，通過(guò)促生催長(zhǎng)保證煙株正常生長(zhǎng)發(fā)育，延緩病毒典型癥狀。本研究以生物鈍化菌株KBD-1為主要研究材料，通過(guò)其自身的強(qiáng)還原性，將亞硒酸鈉中的正四價(jià)硒還原成零價(jià)納米硒，既可增強(qiáng)菌株自身的病毒鈍化消毒活性，又能增加其對(duì)煙株促生催長(zhǎng)，減弱煙草病毒病典型癥狀（矮縮、花葉、斑駁和壞死）。

在煙葉生產(chǎn)中，防控?zé)煵莶《静〉乃巹┲饕形宕箢怺20]，包括寡糖類、多糖類、蛋白類、小分子化學(xué)物類和脂肪酸/醇類等，而利用生防菌株防治煙草病毒病研究和應(yīng)用較少。熒光假單胞菌在真菌、細(xì)菌、線蟲(chóng)等方面的研究和應(yīng)用有較多報(bào)道，不同分離株系對(duì)真菌脈沖病原菌鐮刀菌（Fusarium spp.）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、稻瘟病菌（Macrophomina phaseolina）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、番茄灰霉病病原菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、二孢白粉病菌（Erysiphe cichoracearum）[21-23]和細(xì)菌病原菌青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum）[24]以及線蟲(chóng)類茄子根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne javanica）[25]等均表現(xiàn)出良好的防控效果。本論文研究的主要材料P. fluorescens KBD-1系從煙草病毒病重病田塊健株根際土壤中篩選獲得，不僅對(duì)煙草TMV病毒具有顯著拮抗活性，同時(shí)還對(duì)煙草其他重要病毒（PVY、CMV和TSWV）也具有顯著拮抗和癥狀修復(fù)功能。熒光假單胞菌作為抗病毒應(yīng)用的首選菌株之一廣闊的應(yīng)用前景。

硒元素具有多種生物學(xué)功能，是一種調(diào)控生物機(jī)能的重要元素，但自然界多數(shù)硒以硒酸鹽（Se6+）、亞硒酸鹽（Se4+）存在，這些形態(tài)的硒具有一定生物毒性，且植物利用率低或難以利用。通常利用一些方法制備零價(jià)納米硒，例如化學(xué)還原法、物理合成法，但是這些技術(shù)均存在污染環(huán)境、轉(zhuǎn)化效率低、成本較高、對(duì)植物生長(zhǎng)促生效果不顯著等問(wèn)題。而通過(guò)微生物合成來(lái)實(shí)現(xiàn)零價(jià)納米硒制備的生物合成法是在綠色環(huán)保理念下發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)單、安全、生物相容性好、環(huán)保和可回收的方式。微生物具有分布廣、數(shù)量多、生命力強(qiáng)、適應(yīng)性高和代謝產(chǎn)物多樣的特點(diǎn)，利用微生物制備納米硒取材便捷，成本低，更重要的是生物法合成的納米硒粒徑小、熱穩(wěn)定性高[26]，如FESHARAKI等[27]研究微生物法合成納米硒，選取肺炎克雷伯氏菌將硒的氯化物轉(zhuǎn)化成納米硒，制備的納米硒粒徑是10～550 nm，具有耐壓性與耐高溫性。本研究通過(guò)P. fluorescens KBD-1對(duì)亞硒酸鈉進(jìn)行了生物還原，使其在細(xì)菌菌體內(nèi)形成零價(jià)納米硒，在煙株抗病毒應(yīng)用中，以菌液噴施和灌施施用，在制備和應(yīng)用過(guò)程中，無(wú)任何廢氣、廢液產(chǎn)生，具有顯著環(huán)境友好的特點(diǎn)，有效解決了化學(xué)合成法污染嚴(yán)重和物理法所需設(shè)備條件要求較高的問(wèn)題。

4? 結(jié)? 論

本研究系統(tǒng)揭示了P. fluorescens KBD-1不僅具有抗病毒拮抗活性，還具有強(qiáng)還原性，可將亞硒酸鈉還原為納米硒。相比較P. fluorescens KBD-1菌液，P. fluorescens KBD-1-Se菌液可增強(qiáng)原始菌株對(duì)煙草常見(jiàn)病毒的抑制效果和對(duì)煙株的促生作用。因此，納米硒與生防菌的有機(jī)融合為生防菌株深度挖掘和利用提供了新思路，開(kāi)拓了新路徑，為煙草病毒病的綠色防治提供基礎(chǔ)科研材料和數(shù)據(jù)支撐。

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