鐘亞東，潘 猛，徐德昌，孫永敢，胡婕倫，聶少平，鐘虹光，堯梅香，謝明勇,

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，中加食品科學(xué)技術(shù)聯(lián)合實驗室（南昌），江西南昌 330047；2.江中食療科技有限公司，江西九江 330000）

功能性消化不良（functional dyspepsia, FD）是一種常見的功能性胃腸道疾病，在全球的發(fā)病率為11%～29.2%[1]。FD由胃和十二指腸功能紊亂而引起，無器質(zhì)性病變，主要癥狀為餐后飽脹、早飽感、上腹疼痛等[2]。據(jù)報道，飲食不規(guī)律、喜甜食和碳酸飲料等異常飲食行為可誘發(fā)FD[3]。雖然該病癥鮮少出現(xiàn)嚴(yán)重病情或危及生命，但極大地降低患者生活質(zhì)量[4]。目前FD常見治療方法包括飲食調(diào)整、藥物治療以及心理干預(yù)，但療效有限且可能具有副作用[5]。因此，尋找包括傳統(tǒng)草藥和天然活性物質(zhì)在內(nèi)的藥物補充劑和替代品具有積極的現(xiàn)實意義[6-7]。

猴頭菇是是一種大型真菌，被認(rèn)為具有保肝、健脾、養(yǎng)胃和助消化等功效。研究發(fā)現(xiàn)猴頭菇制品可顯著改善早飽、噯氣、腹脹等癥狀，促進(jìn)胃排空，改善動力障礙型FD[8-9]。茯苓和山藥具有補脾養(yǎng)胃、健脾和胃的功效，常用于緩解胃腸道癥狀[10]。其中，多糖等活性物質(zhì)被認(rèn)為是其主要功效成分[11-14]。

目前，針對猴頭菇、山藥和茯苓對功能性消化不良癥狀的研究鮮見報道，且食物基質(zhì)可與活性物質(zhì)相互作用并影響其功效[15-17]。因此，本研究采用肝郁脾虛性功能性消化不良大鼠模型，結(jié)合劑量水平和食物基質(zhì)效應(yīng)，探討基于茯苓-山藥復(fù)配提取物和猴頭菇提取物開發(fā)的沖泡型米稀和酥性餅干對功能性消化不良癥狀的改善作用，以期為食藥兩用資源的開發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯苓-山藥復(fù)配提取物、茯苓-山藥復(fù)配米稀、猴頭菇提取物和猴頭菇餅干 本實驗室自制；番瀉葉

華柯生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；SPF級Spargue-Dawley雄性大鼠 （112只，體質(zhì)量180±20 g）、動物飼料墊料 購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限責(zé)任公司（許可證號：SCXK（湘）2016-0002）；鼠血清胃動素（motilin, MTL）、胃泌素（gastrin, GAS）、膽囊收縮素（cholecystokinin, CCK）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

超純水儀 美國Millipore公司；AL104型電子分析天平 上海梅特勒-托利多儀器公司；YP10002馬頭牌電子天平 上海光正醫(yī)療器械有限公司；TGL-5-A高速離心機 上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；正置光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司；6890N型氣相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備方法 餅干制備：將6.25%（w/w）的水提猴頭菇提取液與低筋小麥粉、玉米淀粉、起酥油、全脂乳粉等混合攪拌，制作面團(tuán)，隨之進(jìn)行成型、脫模操作。采用變溫烘烤方式處理餅干生坯6～8 min。烘烤溫度依次為200～240、220～260、180～200、140～180 ℃。

米稀制備：將8.6%（w/w）的水提茯苓-山藥復(fù)配提取物與粳米粉、燕麥粉、白砂糖、水混合，攪拌均勻，過膠體磨，滾筒干燥后過篩。

番瀉葉水煎劑制備[18]：將番瀉葉浸泡于沸水中，比例為5:100 g/mL。

營養(yǎng)性半固體糊制備[19]：5 g羧甲基纖維素鈉溶于100 mL蒸餾水，并依次加入淀粉4 g、奶粉8 g、白砂糖4 g、活性炭4 g，攪拌均勻，配成約150 mL的黑色半固體糊。

1.2.2 模型的建立 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機抽取8只大鼠作為正常組，其余進(jìn)行造模。采用適度夾尾刺激、不規(guī)則喂養(yǎng)、苦寒瀉下的復(fù)合因素聯(lián)合造模法建立肝郁脾虛型FD大鼠模型[20]。方法如下：

大鼠夾尾刺激2次/d，每次30 min，即用長拆線剪鉗夾大鼠尾巴末端約1/3處（若有破損，碘伏消毒傷口），使其怒叫掙脫，并與其他大鼠打斗廝咬；采用單日喂食、雙日禁食的不規(guī)則喂養(yǎng)方式，且禁食日按2 mL/100 g體重灌胃大鼠番瀉葉水煎劑（苦寒瀉下），2次/d；飲水正常。14 d后，造模結(jié)束，大鼠進(jìn)食恢復(fù)正常。依《中醫(yī)實驗動物模型方法學(xué)》[20]，肝郁脾虛型FD模型有以下癥狀：情緒激動，易怒；瞇眼（眼球僅暴露一半以上）；食欲不振，食量減少；體重增加緩慢，甚至下降；毛色暗黃，毛發(fā)粗亂；糞便時干時稀，拉尾排便反應(yīng)陽性；精神萎靡，乏力倦怠；胃黏膜未發(fā)生器質(zhì)性病變。

取造模成功大鼠分為模型組（M；生理鹽水1 mL/100 g）、陽性組（P；多潘立酮混懸液，2.7 mg/kg）、茯苓-山藥復(fù)配提取物組低、中、高劑量組（FL、FM、FH；116.1、232.2和464.4 mg/kg）、茯苓-山藥復(fù)配米稀低、中、高劑量組（FPL、FPM、FPH；675、1350和2700 mg/kg）、猴頭菇提取物低、中、高劑量組（HL、HM、HH；135、270和540 mg/kg）、猴頭菇餅干低、中、高劑量組（HPL、HPM、HPH；2160、4320和8640 mg/kg），共14組，每組8只，正常組灌胃生理鹽水（N；1 mL/100 g），持續(xù)灌胃14 d。各組大鼠末次給藥后，禁食不禁水24 h，次日上午各組大鼠均注入5%半固體糊，按10 mL/kg灌胃。30 min后處死，取相關(guān)臟器和血清，并于-80℃保存。

灌胃中劑量依照根據(jù)藥典所確定的人的推薦量（茯苓-山藥復(fù)配提取物2.58 g/70 kg/d，猴頭菇提取物3 g/70 kg/d，米稀30 g/70 kg/d，猴頭菇餅干48 g/70 kg/d），與大鼠進(jìn)行等效劑量換算，換算系數(shù)為0.018。

1.2.3 大鼠行為觀察 每天觀測大鼠行為表現(xiàn)，記錄懶動、倦怠、瞇眼、扎堆，體形逐漸消瘦，排便次數(shù)增多等現(xiàn)象，判定是否造模成功。

1.2.4 大鼠體重與食量變化 適應(yīng)期開始至實驗結(jié)束期間，每天記錄大鼠體重和采食量。

1.2.5 胃組織病理觀察 剪取胃部約10 mm×2 mm的組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定，HE染色病理觀察。

1.2.6 胃排空率和小腸推進(jìn)率的測定 胃排空率測定：取胃結(jié)扎幽門賁門，并稱量胃總質(zhì)量（即胃內(nèi)容物+胃組織重量），沿胃大彎剪開，洗去胃內(nèi)容物后吸干稱量胃凈質(zhì)量（即胃組織重量），胃排空率計算如公式（1）所示：

小腸推進(jìn)率測定：取上端自幽門、下端至回盲部的整段小腸，輕輕剝離后不加牽引直鋪于白紙上，測量幽門至黑色半固體糊前沿的距離和小腸的總長度。按照公式（2）計算小腸推進(jìn)率：

1.2.7 血清胃腸激素的測定 眼球取血后靜置1 h，3500 r/min離心20 min（4 ℃），取上清并依照試劑盒說明書測定中MTL、GAS和CCK含量。

1.2.8 結(jié)腸短鏈脂肪酸的測定 參照文獻(xiàn)[21]的方法，精確稱取結(jié)腸內(nèi)容物并加入磷酸鹽緩沖液勻漿，在4 ℃下以14000 r/min離心20 min后取上清，過0.22 μm水系濾膜。取400 μL上清，乙醚提取后進(jìn)行氣相分離測定。色譜柱起始溫度100 ℃，7.5 ℃/min升溫至140 ℃，再以15 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口和火焰離子化檢測器的溫度分別240和300 ℃。氮氣流量12.5 mL/min，分流比為1:10。氫氣和空氣的流速分別為30和400 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間差異采用單因素ANOVA進(jìn)行分析；主效應(yīng)分析采用雙因素ANOVA方法，若無交互作用，即可分別對劑量和受試物種類進(jìn)行主效應(yīng)分析。使用Dunnetts和Tukey方法分別對單因素和雙因素ANOVA進(jìn)行事后比較（Graphpad Prism 8）。交互作用，P＜0.1表示差異顯著；其他情況，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 采食量

如圖1所示，適應(yīng)期間，所有組采食量無區(qū)別；造模后，與正常組相比，模型組采食量顯著下降（P＜0.05）；受試物或藥物干預(yù)后，大鼠采食量相比于模型組顯著（P＜0.05）升高，但仍顯著低于正常組（P＜0.05）。

受試物種類效應(yīng)和劑量效應(yīng)如表1和表2所示。干預(yù)期間，受試物種類對采食量無影響，即食物基質(zhì)的存在與否以及功能活性物質(zhì)的種類均不影響大鼠在干預(yù)期的采食量。與之相反，灌胃劑量水平顯著影響采食量，且高劑量組顯著（P＜0.05）高于低劑量組。

2.2 體重

如圖1所示，造模前，所有動物體重?zé)o差別；造模后大鼠體重與正常組相比顯著下降（P＜0.05）；飲食或藥物干預(yù)后，大鼠體重顯著回升（P＜0.05）。其中陽性組、FM組、FH組體重恢復(fù)至正常水平（P＞0.05）。

圖1 四種受試物對大鼠采食量和體重的影響（n=8）Fig.1 Effect of four test materials on feed intake and body weight in rats（n=8）

干預(yù)期間，不同受試物種類對采食量差異不大（表1茯苓-山藥復(fù)配提取物組體重顯著高于猴頭菇餅干組（P＜0.05），灌胃劑量對體重?zé)o顯著影響（P＞0.05）（表2）。

表1 受試物種類對功能性消化不良大鼠測試指標(biāo)的影響的雙因素方差分析（n=24）Table 1 Two-way ANOVA analysis for effect of the type of test materials on test parameters in rats with functional dyspepsia (n=24)

表2 灌胃劑量對功能性消化不良大鼠測試指標(biāo)影響的雙因素方差分析（n=32）Table 2 Two-way ANOVA analysis for effect of dosage on test parameters in rats with functional dyspepsia (n=32)

2.3 胃排空率與小腸推進(jìn)率

如圖2所示，與正常組大鼠（70.3%±5.8%）相比，模型組大鼠胃排空率顯著降低（41.9%±6.4%；P＜0.05）。與模型組相比，各干預(yù)組（56.4%±8.0%～66.1%±6.8%）的胃排空速率顯著升高（P＜0.05），且茯苓-山藥復(fù)配各組、HPH組以及陽性組均恢復(fù)至正常組水平（P＞0.05）。小腸推進(jìn)率的變化與胃排空率情況相似。結(jié)果表明四種受試物作用與陽性藥物多潘立酮效果一致，可有效改善胃腸動力。

圖2 四種受試物對功能性消化不良大鼠胃排空率（A）和小腸推進(jìn)率（B）的影響（n=8）Fig.2 Effect of four test materials on gastric emptying rate (A)and small intestine propulsion rate (B) of rats with functional dyspepsia (n=8)

如表1和表2所示，受試物種類及灌胃劑量對胃排空率無顯著性影響（P＞0.05），但前者明顯影響小腸推進(jìn)率：茯苓-山藥復(fù)配提取物組（58.1%±6.8%）顯著（P＜0.05）高于各猴頭菇組（52.4%±5.5%～53.2%±6.2%），而茯苓-山藥復(fù)配米稀組（57.5%±5.8%）顯著（P＜0.05）高于猴頭菇提取物組（52.4%±6.2%）。表明食物基質(zhì)無作用，而不同活性物質(zhì)之間差異顯著。

2.4 胃組織病理學(xué)

如圖3所示，所有組大鼠胃組織結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，未見胃黏膜上皮細(xì)胞脫落、水腫及充血現(xiàn)象，未見胃器官實質(zhì)性損傷。

圖3 四種受試物對功能性消化不良大鼠胃組織病理學(xué)觀察（40×）Fig.3 Effect of four test materials on morphological changes in gastric tissue of rats with functional dyspepsia（40×）

2.5 血清胃腸激素

如圖4所示，與正常組大鼠相比（MTL：193.6 ng/L；GAS：38.2±5.6 ng/L），模型組大鼠血清MTL（126.6±13.6 ng/L）和GAS水平（21.4±4.0 ng/L）顯著（P＜0.05）降低。與模型組相比，各干預(yù)組血清MTL（153.4±13.6～182.5±14.9 ng/L）和GAS（28.5±3.6～35.0±3.9 ng/L）水平均顯著增加（P＜0.05），其中兩者在陽性組和FM組，以及GAS在FPM組的水平均恢復(fù)至正常（P＞0.05）。

圖4 四種受試物對功能性消化不良大鼠血清胃動素（A）、胃泌素（B）和膽囊收縮素（C）水平的影響（n=8）Fig.4 Effects of four test materials on the serum levels of motilin (A), gastrin (B) and cholecystokinin (C) in rats with functional dyspepsia (n=8)

相比于正常組（267.6±14.4 ng/L），模型組血清CCK水平（357.6±20.7 ng/L）顯著（P＜0.05）增加。相比于模型組，除HL組（338.2±19.1 ng/L）外，其他組血清CCK水平（288.2±16.2～327.9±15.1 ng/L）均顯著（P＜0.05）降低。

如表1和表2所示，受試物種類顯著（P＜0.05）影響血清MTL水平，其中茯苓-山藥復(fù)配提取物組（167.6±17.0 ng/L）顯著高于猴頭菇餅干組（156.0±15.5 ng/L），而劑量無影響。受試物種類與劑量對血清GAS水平無影響，但均顯著（P＜0.05）影響血清CCK水平：茯苓-山藥復(fù)配提取物組血清CCK水平（310.6±17.3 ng/L）顯著低于各猴頭菇組（324.1±15.0～329.1±17.7 ng/L），而米稀組（314.0±17.0 ng/L）顯著低于猴頭菇提取物組（329.1±17.7 ng/L）；低劑量組（326.1±17.9 ng/L）顯著高于中劑量組（315.1±18.2 ng/L）。結(jié)果表明通過選擇受試物的種類和灌胃劑量，可優(yōu)化受試物對血清胃腸激素水平的調(diào)節(jié)作用，且食物基質(zhì)不干擾提取物質(zhì)的相關(guān)調(diào)節(jié)作用。

2.6 結(jié)腸短鏈脂肪酸水平

如表3所示，模型組結(jié)腸總短鏈脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFAs）水平顯著（P＜0.05）低于正常組，這與其6種組成SCFA的情況一致。與模型組相比，除戊酸與異戊酸外，陽性組各SCFAs及總SCFAs水平均顯著（P＜0.05）提高；茯苓-山藥復(fù)配各組結(jié)腸乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和總SCFAs水平顯著（P＜0.05）升高；猴頭菇提取物及餅干組的結(jié)果較復(fù)雜，中劑量組的結(jié)果與茯苓-山藥復(fù)配各組相似，而低劑量組乙酸和丙酸含量顯著（P＜0.05）提高，高劑量僅增加乙酸和丁酸（限餅干組）水平（P＜0.05）。此外，結(jié)腸異戊酸和戊酸水平僅分別在FM組和陽性組檢測到顯著升高（P＜0.05）。干預(yù)后，茯苓-山藥復(fù)配各組的丙酸（除提取物低劑量組）、丁酸水平，F(xiàn)M組的異丁酸與總SCFAs水平，以及HM組的丙酸、丁酸恢復(fù)到正常水平。

如表1和表2所示，受試物種類及灌胃劑量作為主效應(yīng)均顯著影響乙酸、丁酸和總SCFA水平（P＜0.05），而異戊酸只受受試物種類因素影響（P＜0.05）：茯苓-山藥復(fù)配組的丁酸、異戊酸和總SCFAs水平，以及其提取物組的乙酸水平均顯著高于猴頭菇組（P＜0.05）；中劑量組的乙酸、丁酸和總SCFAs水平均顯著高于低、高劑量組（P＜0.05）。丙酸、異丁酸、戊酸存在主效應(yīng)交互作用（P＜0.1），未進(jìn)行分析。結(jié)果表明通過選擇活性物質(zhì)種類和劑量和優(yōu)受試物對結(jié)腸乙酸、丁酸、異戊酸或總短鏈脂肪酸水平的調(diào)節(jié)作用，而食物基質(zhì)對此無影響。

3 討論與結(jié)論

胃腸消化動力不足是FD的重要發(fā)病機理，針對FD患者的治療目標(biāo)之一即為改善胃腸動力。本研究給與FD大鼠茯苓-山藥或猴頭菇相關(guān)提取物和產(chǎn)品均能改善胃排空率和小腸推進(jìn)率，同時血清胃腸道激素（MTL、GAS和CCK）水平相應(yīng)發(fā)送變化。MTL和GAS可通過刺激胃收縮，加速胃排空和/或改善小腸蠕動，而CCK作用相反。多糖是茯苓、山藥和猴頭菇的主要功能活性物質(zhì)[21-23]，通常由水提法獲取。研究發(fā)現(xiàn)某些多糖如黃芪多糖和香菇多糖可顯著促進(jìn)胃腸蠕動，并改變胃腸激素[24,25]，推測多糖是本研究中FD大鼠癥狀改善的主要功能性物質(zhì)。

本研究灌胃FD大鼠各受試物后，各劑量均能不同程度地增加結(jié)腸SCFAs的水平。多糖是腸道菌群生成SCFAs的主要底物，而后者可調(diào)節(jié)宿主各項生理代謝活動，包括能量代、腸道蠕動、腸道屏障功能、腸道免疫等方面，因而多糖被視為潛在的益生元[26]。一項系統(tǒng)回顧與薈萃分析發(fā)現(xiàn)益生元在治療FD中具有一定作用[27]，這進(jìn)一步表明益生元型多糖可用于治療FD。此外，Reilly等[28]報道大鼠結(jié)腸中灌輸SCFAs促進(jìn)了腸道GAS的分泌，結(jié)合本研究關(guān)于血清胃腸激素的結(jié)果，推測多糖是通過促進(jìn)SCFAs的生成進(jìn)而改變胃腸激素的分泌，進(jìn)而改善FD癥狀。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，受試物組大鼠的體重均能恢復(fù)到正常水平，但采食量仍低于正常組，這表明其他因素可能參與其中，如腸道SCFAs水平升高，影響大鼠能量代謝，進(jìn)而調(diào)節(jié)體重[29]。

本研究通過比較提取物與相應(yīng)產(chǎn)品對FD的改善作用，未發(fā)現(xiàn)米稀和餅干的基質(zhì)影響茯苓-山藥復(fù)配提取物和猴頭菇提取物發(fā)揮功能活性。某些常用食物成分，如NaCl等鹽類可降低多糖的黏度[30]，從而影響其構(gòu)象及相應(yīng)的功能活性相關(guān)，如免疫活性，但可能對改善FD無作用。

綜上所述，茯苓-山藥復(fù)配米稀及猴頭菇餅干可有效緩解FD引起的食量下降和體重減輕等癥狀，改善胃腸動力。推測其作用與SCFAs的生成及胃腸動力相關(guān)血清胃腸激素的變化相關(guān)。此外米稀及餅干的作用與原功能性提取物無差異。