李志鵬,周曉嬌,水珊珊,HATAB Shaimaa Reda Abd Elkhalik,張 賓,
(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022;2.赫利奧波利斯大學(xué)食品加工系,埃及開羅 11785)
中華管鞭蝦(Solenocera crassicornis),俗稱紅蝦,因其蝦殼通透、肉質(zhì)糯軟,富含大量人們健康飲食所需的營養(yǎng)物質(zhì),而備受消費者的歡迎。中華管鞭蝦捕撈點主要分布于印度、馬來西亞、印度尼西亞、日本和中國沿海[1]。在我國,常見于黃海南部和東海附近,適宜的捕撈期為5月~8月,在5月捕獲量最高。近年來,隨著水產(chǎn)品銷售量的日益增多,以及人們對新鮮高質(zhì)量水產(chǎn)品的需求增大,中華管鞭蝦等蝦類逐漸變?yōu)槭澜缟献钪匾臐O業(yè)產(chǎn)品[2]。但冰鮮蝦類在貯藏過程中容易腐敗,尤其在長距離運輸過程中蝦肉口感及品質(zhì)劣變更為嚴重。如何有效解決冰鮮蝦類的貯藏品質(zhì)劣變問題,對保障蝦類制品價值及滿足消費者需求具有重要意義。
研究表明,蝦體肌肉軟化可能由多種原因造成。在冷藏或凍藏條件下,蝦體肌肉組織中冰晶的形成和細胞體積的變化,會導(dǎo)致細胞和肌纖維被破壞,進而導(dǎo)致蝦肉的軟化[3]。于麗霞等[4]研究了羅氏沼蝦凍藏過程中冰晶形成情況,發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦在冰箱中形成冰晶顆粒較大,其對細胞產(chǎn)生的機械損傷作用嚴重。此外,蝦肉中的組織蛋白酶會隨著貯藏時間的延長不斷作用于肌肉蛋白質(zhì),導(dǎo)致細胞骨架和肌原纖維蛋白被破壞。近年來,組織蛋白酶對水產(chǎn)品品質(zhì)的影響逐漸被人們所關(guān)注,尤其在水產(chǎn)動物死后貯藏初期,其肌肉品質(zhì)往往會發(fā)生極大的改變,組織蛋白酶被認為是對肌肉蛋白質(zhì)產(chǎn)生降解的重要影響因素[5]。沈春蕾等[6]研究發(fā)現(xiàn),在凡納濱對蝦貯藏過程中,蝦頭中部分蛋白酶可能會逐步遷移到蝦肌肉中,進而對肌肉品質(zhì)產(chǎn)生較大影響。目前,對于不同貯藏方式下蝦肌肉組織中內(nèi)源酶活性對其肌肉品質(zhì)變化產(chǎn)生的影響,還存在較多不明之處,尤其關(guān)于中華管鞭蝦等海水蝦類中組織蛋白酶活性的研究還鮮有報道[7-8]。本研究以完整的中華管鞭蝦為對照組,比較分析去頭后的蝦肌肉組織理化特性及組織蛋白酶H活性變化情況,旨在為后續(xù)海水蝦類組織蛋白酶活性及其貯藏方式的選擇提供理論基礎(chǔ)。
冰鮮中華管鞭蝦(體長13~15 cm) 浙江舟山中國舟山國際水產(chǎn)城,購買后立即放入裝有冰袋的保溫箱內(nèi),快速運回實驗室,并立即對其進行處理;磷酸氫二鈉、三(羥甲基)氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate, SDS)、過硫酸銨(Ammonium persulphate, APS)、Na2EDTA、焦磷酸鈉等 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;組織蛋白酶H測定試劑盒 上海繼錦化學(xué)科技有限公司。
751UVGD型紫外-可見光分光光度計 上海第三分析儀器廠;MS-Pro型物性測試儀 美國FTC公司;Synergy H1全功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司;HSY-A-200恒溫水浴振蕩器 天津廠草科技有限公司;DiRECT-Q超純水裝置 美國MILLIPORE公司;MDF-U53V型超低溫冰箱 日本SANYO公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。
1.2.1 樣品處理 將實驗樣品分為2組:完整蝦組和去頭蝦組,分別進行4 ℃冷藏(貯藏6 d,每2 d取樣測定1次)和-18 ℃凍藏(貯藏120 d,每20 d取樣測定1次)。
1.2.2 pH的測定 依據(jù)GB/T 5009.237-2016方法進行測定。選取多只蝦的第二腹節(jié),混合后切碎,稱取3 g樣品(精確到0.01 g),加入10倍煮沸后冷卻的蒸餾水,高速均質(zhì)30 s,搖勻后靜置30 min,過濾,取濾液。用pH計測量數(shù)值,每組實驗平行重復(fù)三次,取平均值。
1.2.3 持水力的測定 參考盧涵[9]的實驗方法,并稍作改進。選取多只蝦的第二腹節(jié),混合后切碎,稱取2 g左右蝦肉(重量記作W1,g),用濾紙包裹,1600×g離心10 min后,再次稱重(重量記作W2,g)。持水力表示樣品保持重量的百分比,計算公式如(1)所示。
1.2.4 肌原纖維蛋白含量的測定 測定方法參考李學(xué)鵬等[10]報道,并稍作修改。選取多只蝦的第二腹節(jié),混合后切碎,稱取3 g樣品,加入5倍體積10 mmol/L Tris-HCl(pH7.2)緩沖溶液,高速均質(zhì)30 s后,4 ℃條件下5000 r/min離心10 min,取沉淀。重復(fù)以上操作3次,在最后一次沉淀中加入5倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含0.6 mol/L NaCl;pH7.2),取上清液即為制備的肌原纖維蛋白溶液,其含量采用考馬斯亮藍法進行測定。
1.2.5 質(zhì)構(gòu)特性的測定 參照祁雪兒等[11]實驗方法,并稍作修改。選用TPA測量模型,測定蝦肉硬度和彈性。設(shè)定參數(shù)為:P/50探頭,測試前速度120 mm/min,測試速度60 mm/min,測后速度60 mm/min,測定部位中華管鞭蝦第二腹節(jié),樣品形變量50%。采用FTC-PRO軟件對蝦肌肉產(chǎn)生的力和時間曲線進行分析,計算蝦肉彈性和硬度。
1.2.6 水分含量的測定 參照GB 5009.3-2016直接干燥法,選取多只蝦的第二腹節(jié),混合后切碎,稱取2 g樣品(精確至0.0001 g)置于101~105 ℃烘箱中,通過干燥前、后重量變化,計算蝦肌肉中水分含量。
1.2.7 亞細胞各組分的分離 參照邱恒恒[12]和李樹紅[13]報道方法,并稍作改進。選取多只蝦的第二腹節(jié),混合后切碎,取2 g蝦肉,加入5倍體積緩沖液A(含100 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KCl、50 mmol/L Tris、10 mmol/L Na4P2O7和1 mmol/L Na2EDTA;pH7.2),混合均質(zhì)1 min;采用三層尼龍網(wǎng)過濾去除結(jié)締組織,濾液采用差速離心法分離獲得肌原纖維(4 ℃,1100×g,持續(xù)10 min),線粒體(4 ℃,3000×g,持續(xù)15 min)和溶酶體(4 ℃,16000×g,持續(xù)30 min);溶酶體經(jīng)離心后所得上清液即為肌漿部分。將以上制備的各亞細胞組分,加入貯藏液B(含85 mmol/L CH3COONa,15 mmol/L CH3COOH以及1 mmol/L EDTA-2Na)后,立即檢測組織蛋白酶H的活性。
1.2.8 組織蛋白酶H的酶活性的測定 采用試劑盒法測定各亞細胞組分中組織蛋白酶H的活性,操作過程依據(jù)試劑盒使用說明書進行。
1.2.9 SDS-PAGE分析 參照Laemmli[14]的方法,組裝好已經(jīng)清洗晾干的電泳槽各部件,檢查是否漏水,待用。實驗采用12%的分離膠及5%的濃縮膠,電極緩沖液含0.05 mol/L Tris,0.384 mol/L甘氨酸,0.1% SDS(pH8.3)。電泳采用1 mm凝膠板;標準蛋白標記(11~245 kDa);上樣量為10 μL;電泳初始電壓為80 V,待樣品進入分離膠后改為120 V;電泳結(jié)束后,用考馬斯亮藍染色30 min,然后用不同比例的甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明。電泳膠片置于凝膠成像儀攝像,結(jié)合Tanon軟件進行分析和處理。
以上樣品測定均平行重復(fù)三次(n=3)。采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析,不同處理組之間的差異性分析,采用多重比較分析法(Duncan法,P<0.05)。采用Origin 8.0對結(jié)果數(shù)據(jù)進行制圖分析。
pH是水產(chǎn)品鮮度評價的重要指標之一[15]。如圖1所示,隨著貯藏時間延長,完整蝦和去頭蝦肌肉pH均呈不斷上升的趨勢。在0~6 d冷藏過程中,完整蝦和去頭蝦肌肉pH分別從初始的7.05和7.08上升到7.82和7.65;在凍藏第120 d,二者肌肉pH分別上升至8.01和7.82。在低溫貯藏過程中,外界污染微生物生長及其代謝產(chǎn)物、蝦體內(nèi)內(nèi)源酶作用等造成肌肉蛋白質(zhì)降解及氧化分解,致使肌肉中產(chǎn)生了氨和胺等堿性物質(zhì),因此導(dǎo)致了蝦肌肉pH的上升[16-17]。在貯藏后期,完整蝦組肌肉pH顯著高于去頭蝦組(P<0.05),可能是由于隨著貯藏時間延長,蝦頭中部分內(nèi)源性蛋白酶遷移到肌肉組織,加快了蝦肌肉蛋白質(zhì)的降解速率,使其pH高于去頭蝦組[6]。
肌肉持水力表示肌肉組織阻礙其水分流失的能力,通常采用離心前后肌肉組織重量差表示其持水力的大小,即肌肉組織在離心過后重量變化大,則表示肌肉的持水能力較差[18]。如圖2所示,隨著貯藏時間延長,完整蝦和去頭蝦組肌肉持水力均呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢,且在貯藏后期,去頭蝦肌肉持水力均顯著高于完整蝦組(P<0.05)。貯藏第0 d,蝦肉持水力為77.70%;經(jīng)冷藏6 d后,完整蝦和去頭蝦組肌肉持水力分別下降至65.87%和68.20%;而經(jīng)凍藏120 d,二者分別下降至60.28%和64.83%,同時在40~120 d凍藏期內(nèi),肌肉持水力下降速率較快。在低溫貯藏過程中,肌肉持水力的快速降低,可能主要是由于肌肉中內(nèi)源蛋白酶(如組織蛋白酶H和D、鈣蛋白酶及胰蛋白酶等)作用于肌原纖維蛋白,導(dǎo)致肌原纖維降解及收縮加劇,致使組織中相鄰纖維之間空間變大,其中水分通過形成毛細管作用而不斷流失[19]。Zhang等[20]研究也證實,肌肉中組織蛋白酶活性的大小和肌原纖維的分解程度密切相關(guān),正是由于組織蛋白酶酶解作用導(dǎo)致了肌肉持水能力的降低。此外,在凍藏過程中,肌肉中內(nèi)源酶活性雖受到一定程度的鈍化或抑制,但凍結(jié)形成的冰晶顆粒擠壓破壞肌纖維物理結(jié)構(gòu),也導(dǎo)致了肌肉組織持水能力的快速降低。在本實驗中,尤其在冷藏及凍藏后期,去頭蝦肌肉組織持水力均顯著優(yōu)于完整蝦組(P<0.05),這可能是由于蝦頭部存在大量內(nèi)源酶對蝦肌肉品質(zhì)產(chǎn)生較大的影響;在較長貯藏期內(nèi),可能存在著某種遷移機制,進而影響蝦肌肉組織的持水力等功能特性。
圖2 冷藏(a)和凍藏(b)條件下中華管鞭蝦肌肉持水力變化情況Fig.2 Changes of water holding capacity of red shrimp muscle during cold storage (a) and frozen storage (b)
肌原纖維蛋白在蝦肌肉中含量最高,在某種程度上其含量的高低即可表明蝦肉品質(zhì)變化情況[21]。如圖3所示,隨著貯藏時間延長,中華管鞭蝦肌肉中肌原纖維蛋白含量一直呈下降趨勢。貯藏第0 d時,蝦肉中肌原纖維蛋白含量為57.42 mg/g;在0~4 d冷藏過程內(nèi),其下降速率較快,4~6 d時下降幅度逐漸減弱,在6 d時完整蝦和去頭蝦組肌肉肌原纖維蛋白含量分別下降了38.32%和30.88%;在0~20 d凍藏過程內(nèi),其含量下降幅度較大,20~80 d時呈線性下降趨勢,最后趨于平緩,而在凍藏120 d后,二者分別下降了61.67%和52.09%。這可能是由于隨著貯藏時間的延長,蝦肌肉中組織蛋白酶分解了肌原纖維蛋白,使得其蛋白含量逐漸下降[13]。在冷藏和凍藏后期時,完整蝦組的肌原纖維蛋白含量均顯著低于去頭蝦組(P<0.05),可能是由于實驗中蝦頭內(nèi)部分內(nèi)源酶發(fā)生遷移,使得完整蝦肌肉中組織蛋白酶活性高于去頭蝦組,導(dǎo)致其肌原纖維蛋白降解速率比去頭蝦組快[18]。
圖3 冷藏(a)和凍藏(b)條件下中華管鞭蝦蝦肉肌原纖維蛋白變化情況Fig.3 Changes of myofibrillar protein of red shrimp muscle during cold storage (a) and frozen storage (b)
硬度和彈性是影響水產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性的主要因素,在貯藏過程中,肌肉間結(jié)合力的大小和肌纖維損傷,會導(dǎo)致肌肉的彈性和硬度發(fā)生改變[22]。如表1所示,貯藏第0 d,完整蝦和去頭蝦組肌肉硬度分別為19.24和19.33 N;經(jīng)冷藏至6 d時,二者分別下降至16.12和17.31 N;經(jīng)凍藏至120 d時,二者分別下降至16.73與18.50 N。貯藏第0 d時,完整蝦和去頭蝦組肌肉的彈性為2.01和1.98 mm;冷藏至6 d時,其肌肉彈性分別降至1.24和1.38 mm;凍藏至120 d時,二者分別降至1.70和1.77 mm。隨著冷藏周期的延長,蝦肌肉的硬度和彈性均呈現(xiàn)不斷下降的趨勢,而在凍藏期間其硬度和彈性出現(xiàn)了先上升后下降的趨勢;在貯藏后期,完整蝦組的硬度和彈性顯著低于去頭蝦組(P<0.05)。該現(xiàn)象推測可能是由于在冷藏過程中,中華管鞭蝦肌肉蛋白氧化速度加快,肌肉細胞間結(jié)合力減小,從而使得蝦組織結(jié)構(gòu)崩解[22]。在凍藏前期蝦肌肉硬度和彈性的上升,可能是由于細胞中自由水的流失,使得肌原纖維密度變大,從而導(dǎo)致蝦體肌肉硬度和彈性增大[23]。但隨著貯藏時間延長,肌原纖維蛋白被蛋白酶降解以及凍藏期間冰晶的出現(xiàn)破壞了膠原結(jié)構(gòu),因此二者的硬度和彈性又逐漸降低[24]。此外,Bahuaud等[25]研究表明,凍藏條件下質(zhì)構(gòu)特性與組織蛋白酶活性呈負相關(guān)關(guān)系,即肌肉中組織蛋白酶活性越高,硬度及彈性下降得越多。因此,在完整蝦組貯藏期間,可能發(fā)生了蝦頭內(nèi)組織蛋白酶的遷移,引起完整蝦組肌肉中組織蛋白酶活性上升幅度大,加快了完整蝦組硬度和彈性劣變速率。
表1 冷藏和凍藏條件下中華管鞭蝦蝦肉質(zhì)構(gòu)特性變化情況Table 1 Changes of muscle texture characteristics of shrimps(Solenocera crassicornis) during cold storage and frozen storage
如圖4所示,隨著貯藏周期延長,蝦肌肉的水分含量呈不斷下降趨勢,且在貯藏后期,完整蝦組肌肉的水分含量顯著低于比去頭蝦組(P<0.05)。貯藏第0 d時,完整蝦組和去頭蝦組肌肉的水分含量為77.35%和77.30%;經(jīng)冷藏6 d后,其分別下降4.74%和3.89%;而經(jīng)凍藏120 d后,二者分別下降12.62%和10.67%。在貯藏過程中,蝦肌肉的肌原纖維會被組織蛋白酶快速分解,導(dǎo)致其含量下降,細胞間空隙變大,加劇了水分流失[18]。此外,李玲等[26]發(fā)現(xiàn)肌肉中蛋白質(zhì)的氧化降解,以及在貯藏過程中冰晶的形成均會對細胞膜產(chǎn)生破壞,使細胞中水分在滲透壓的作用下流出,最終導(dǎo)致其水分含量降低。在本研究中,完整蝦組肌肉水分含量一直低于去頭蝦組,可能是由于在完整蝦組貯藏期內(nèi),蝦頭中內(nèi)源性蛋白酶存在某種遷移機制,使完整蝦組中內(nèi)源酶活性高于去頭蝦組,加快了蛋白氧化和肌纖維的降解,導(dǎo)致蝦肌肉的水分含量快速下降。
圖4 冷藏(a)和凍藏(b)條件下中華管鞭蝦肌肉水分含量變化情況Fig.4 Changes of moisture content of red shrimp muscle during cold storage (a) and frozen storage (b)
組織蛋白酶H是一種內(nèi)肽-氨肽酶,在貯藏過程中,其活性的上升會加快蝦體肌原纖維結(jié)構(gòu)劣化速率,從而影響蝦肌肉品質(zhì)[27-28]。如圖5b和圖6b所示,隨著貯藏周期延長,整蝦和去頭蝦組溶酶體中組織蛋白酶H活性呈不斷下降的趨勢,在冷藏6 d和凍藏120 d后分別下降14.04%、11.29%和56.96%、61.12%。這可能主要是由于蝦體死后,細胞內(nèi)溶酶體膜失穩(wěn)而發(fā)生破裂,導(dǎo)致溶酶體中組織蛋白酶被釋放出去,轉(zhuǎn)移到了其它細胞組織中[9]。而在凍藏過程中,冰晶的生成加速了組織的破裂,溶酶體中組織蛋白酶轉(zhuǎn)移速度加快,這導(dǎo)致其活性快速下降[12]。細胞線粒體中組織蛋白酶H活性變化情況,如圖5c和圖6c所示,在0~2 d冷藏過程中,二者下降幅度較小,2 d后開始快速下降;而在凍藏過程中出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。該現(xiàn)象推測可能是由于溶酶體破裂后,其中的組織蛋白酶轉(zhuǎn)移到線粒體中,使得線粒體中酶活性稍微上升,隨著組織蛋白酶接觸并破壞線粒體結(jié)構(gòu),促使線粒體發(fā)生凋亡現(xiàn)象,最終導(dǎo)致整體酶活性呈下降趨勢[29-30]。在肌原纖維中組織蛋白酶H活性變化情況(圖5a和圖6a),與線粒體中變化趨勢大致相似。在貯藏初期,組織蛋白酶H活性呈上升趨勢,這可能也與溶酶體的分解有關(guān)。肌漿中組織蛋白酶H活性變化情況,如圖5d和圖6d所示,在冷藏過程中,完整蝦和去頭蝦組肌漿中組織蛋白酶H活性呈不斷下降趨勢;而在凍藏過程中,兩者酶活性呈先上升后下降再上升的趨勢,且在貯藏后期,去頭蝦組肌漿中組織蛋白酶活性顯著低于完整蝦組(P<0.05),在冷藏6 d和凍藏120 d后兩者酶活性分別下降6.97%、14.00%和12.26%、22.43%。這可能主要是由于在貯藏前期,溶酶體的破裂使其中組織蛋白酶釋放到肌漿中;在20~80 d凍藏過程中,組織蛋白酶活性受低溫抑制逐漸減少;而在凍藏80 d后,酶活性逐漸上升,這可能是由于在凍藏80 d后低溫對酶活性的抑制能力降低,從而導(dǎo)致組織蛋白酶活性的上升,這與柳佳彤[31]的研究結(jié)論相似。在本研究中,完整蝦組肌肉的酶活性在貯藏前期明顯高于去頭蝦組,推測可能是由于在貯藏過程中,蝦頭內(nèi)組織蛋白酶存在某種遷移機制,使得蝦頭部中的酶轉(zhuǎn)移到蝦肌肉中。
圖5 冷藏下中華管鞭蝦蝦肉各亞細胞組分中組織蛋白酶H的活性變化情況Fig.5 Changes of cathepsin H activity in subcellular components of red shrimp muscle during cold storage
圖6 凍藏下中華管鞭蝦蝦肉各亞細胞組分中組織蛋白酶H的活性變化情況Fig.6 Changes of cathepsin H activity in subcellular components of red shrimp muscle during frozen storage
SDS-PAGE能夠檢測蝦肌原纖維蛋白在不同貯藏方式下降解情況。研究表明,在貯藏過程中,部分蛋白質(zhì)如肌球蛋白重鏈(MHC,~180 kDa)、副肌球蛋白(~110 kDa)、肌動蛋白(~45 kDa)、肌鈣蛋白T(~34 kDa)和肌球蛋白輕鏈(MLC,~17 kDa),變化相對明顯[32-33]。中華管鞭蝦完整蝦和去頭蝦肌原纖維蛋白的變化如圖7所示,在不同貯藏方法下蛋白質(zhì)圖譜存在明顯差異。新鮮蝦(A)的蛋白條帶最清晰,冷藏6 d(B、C)、凍藏120 d(D、E)后,MHC、肌鈣蛋白和MLC等蛋白條帶強度下降,肌動蛋白無明顯變化。這是由于蝦肌肉中蛋白在貯藏過程中發(fā)生降解,從而影響其結(jié)構(gòu)特性。而肌肉肌原纖維蛋白的水解被認為與肌肉質(zhì)量和內(nèi)源酶活性的變化有關(guān),并已證明其會損害肌肉纖維結(jié)構(gòu),且與肌肉硬度和彈性的降低有關(guān)[34]。Bhat等[35]研究表明,在肌肉中,MHC被認為是最容易降解的蛋白質(zhì),而低于MHC的90和110 kDa蛋白帶的強度則被認為是肌球蛋白重鏈蛋白水解的指標。從圖中可以發(fā)現(xiàn),副肌球蛋白等鹽溶性蛋白在貯藏一段時間后蛋白條帶強度明顯變?nèi)?,且完整蝦組蛋白條帶變化更為明顯。這可能是由于在低溫凍藏下,冰晶的形成使得肌肉組織中水分減少,使未被凍結(jié)的細胞液濃縮,從而使離子強度和pH發(fā)生很大的變化,有機溶劑和金屬鹽的濃度也相對增大,最終導(dǎo)致蛋白發(fā)生冷凍變性,其含量下降[22]。同時實驗表明,在不同的貯藏方法下,蝦肌肉中內(nèi)源酶活性的升高加快了肌肉蛋白的降解速度,從而導(dǎo)致大多數(shù)蛋白條帶的強度降低。這些結(jié)果論證了上述關(guān)于肌原纖維蛋白含量、酶活性、質(zhì)構(gòu)等的研究結(jié)果。
本文通過對中華管鞭蝦在不同貯藏方式下肌肉品質(zhì)及不同亞細胞結(jié)構(gòu)中蛋白酶活性的研究發(fā)現(xiàn),隨著貯藏周期的延長,中華管鞭蝦肌肉的pH不斷升高,水分含量、持水力和肌原纖維蛋白含量不斷下降,其硬度和彈性均呈先上升后下降趨勢;在凍藏方式下,蝦肉劣化速度慢于冷藏,且蝦在去頭后,其部分蛋白降解速率低于完整蝦;同時在不同亞細胞組分中,完整蝦組肌肉酶活性在貯藏前期均明顯高于去頭蝦組。由此可以得出,低溫凍藏下去頭的方式更適合中華管鞭蝦的貯藏。