楊 錕，車一鳴，黃斯琦，趙立鵬，羅 瑜

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

石榴花（Punica granatumL.）屬落葉灌木或小喬木石榴科石榴屬植物石榴的花，花蕾為紅色[1]。在《本草綱目》記有：“榴花主治：陰干為末，和鐵丹服，一年變白發(fā)如漆”。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2-6]，石榴花含豐富酚類、黃酮、鞣質(zhì)、糖類、色素和微量元素等成分，其粗提物具有較好的抗氧化、抗衰老、降血糖、降血壓、降血脂和抗動(dòng)脈硬化等藥理作用。初夏時(shí)節(jié)，石榴種植戶一般在石榴花剛現(xiàn)蕾時(shí)去掉不能結(jié)實(shí)的鐘狀花，其后生長(zhǎng)過程中大部分不能正常結(jié)果的花亦會(huì)自然脫落，因此，石榴花的可利用資源非常豐富。

目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在石榴產(chǎn)品的加工與保健作用，石榴皮、籽、花提取物的抗氧化、抗病毒、抑菌、防癌、降血糖等作用[7-12]，也有對(duì)石榴花精油抗氧化能力、石榴花紅色素的提取分離、石榴花中葡萄糖苷酶抑制劑篩選等的研究[13-14]。目前針對(duì)石榴花中游離型和結(jié)合型多酚粗提物的提取測(cè)定和體外抗氧化活性研究較為少見。因此，本研究采用體外化學(xué)試劑法測(cè)定石榴花多酚粗提物的抗氧化能力，運(yùn)用評(píng)價(jià)簡(jiǎn)單、靈敏度較高的吸收過氧自由基能力法（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）[15]，較為前沿、檢測(cè)迅速且對(duì)樣品中水溶性和脂溶性成分均能測(cè)定的清除過氧自由基能力法（peroxyl radical scavenging capacity，PSC）[16]，還有常用的DPPH 自由基清除法（DPPH radical scavenging activity，DRSA）[17]、總氧自由基清除法（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）[18]和還原力能力法（reducing power，RP），通過測(cè)定可對(duì)石榴花兩種類型多酚粗提物的抗氧化活性進(jìn)行一定評(píng)價(jià)，在一定程度上揭示石榴花多酚粗提物的抗氧化能力，對(duì)石榴花這一生物資源的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴花 來自云南蒙自某石榴種植場(chǎng)，收集自然掉落的完整石榴花，自然通風(fēng)晾干，磨粉50目過篩，密封后置于-20 ℃冰箱保存，備用。

96孔黑色酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司；水溶性維E（Trolox）標(biāo)準(zhǔn)品、2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、熒光素鈉鹽（FL） 美國(guó)Sigma試劑公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、水溶性維C標(biāo)準(zhǔn)品、2,2-偶氮二異丁基脒鹽酸鹽（ABAP）、磷酸鹽緩沖溶液固體（PBS）、2,2-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS） 北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TGL-20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；A360型紫外可見分光光度計(jì)翱藝儀器（上海）有限公司；Scientz-I8N型真空冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；Synergy H4型全功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司（BioTek）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石榴花多酚粗提物的制備 石榴花游離型和結(jié)合型多酚粗提物的提取分別采用丙酮提取法和氫氧化鈉消化法，參照Adom等[15]、王立峰等[19]方法稍作修改。

1.2.1.1 游離型多酚粗提物的制備 取1 g磨碎的干燥石榴花，加20 mL 70%的丙酮溶液，超聲15 min后離心（4000 r/min，10 min）取上清液，殘?jiān)蒙鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取3次。收集全部上清液后于40 ℃條件下進(jìn)行真空濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥得游離型多酚粗提物凍干粉，密封后于-20 ℃條件下保存，備用。

1.2.1.2 結(jié)合型多酚粗提物的制備 用游離型多酚粗提物提取后的殘?jiān)M(jìn)行提取。殘?jiān)屑尤?0 mL 4 mol/L氫氧化鈉溶液，避光消化4 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為2，離心（4000 r/min，30 min），取上層清液加入乙醚、乙酸乙酯，以1:1:1比例進(jìn)行萃取，取上層液保留，下層液重復(fù)萃取操作5次。合并所得全部上層萃取液后于40 ℃條件下進(jìn)行真空濃縮，濃縮液經(jīng)冷凍干燥得結(jié)合型多酚粗提物凍干粉，密封后于-20 ℃條件下保存，備用。

1.2.2 石榴花多酚粗提物多酚含量的測(cè)定 參照Adom、Chen等[20-21]的Folin-Ciocalteu法稍作修改。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 準(zhǔn)確量取0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL于25 mL容量瓶，各加入10 mL去離子水，再加入1.25 mL福林酚試劑，混勻靜置5 min，加入6.25 mL 10 %的碳酸鈉溶液，用去離子水定容。避光反應(yīng)2 h，760 nm處測(cè)定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 多酚含量的測(cè)定 將游離型和結(jié)合型多酚粗提物凍干粉分別配制成一定濃度溶液，取適量樣品液參照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行測(cè)定。所得多酚含量以每克凍干粉量等同于沒食子酸的毫克數(shù)（mg GAE/ g多酚干粉）表示。計(jì)算公式：

式中：C為帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的沒食子酸濃度，mg/mL；V為樣品液的體積，mL；m為原料質(zhì)量，g。

1.2.3 石榴花多酚粗提物體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 吸收過氧自由基能力（ORAC）測(cè)定 測(cè)定參照張怡一等[22]、李葦舟等[23]提及方法稍作修改。將試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品用（pH7.4，75 mmol/L）磷酸鹽緩沖液溶解。于96孔黑色酶標(biāo)板中分別加入20 μL磷酸緩沖液（空白）、20 μL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)液和20 μL不同濃度的待測(cè)樣品液，將96孔黑色酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中設(shè)定37 ℃溫育10 min，之后每孔加入0.96 μmol/L的熒光素（FL）工作液200 μL，再將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中設(shè)定37 ℃振蕩15 min，迅速加入119 mmol/L的ABAP工作液20 μL。設(shè)定全功能酶標(biāo)儀的激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，入射波長(zhǎng)535 nm，每5 min進(jìn)行讀數(shù)，共2.5 h。采用近似積分法和以下公式計(jì)算熒光衰退曲線下熒光面積（area under the curve，AUC）：

式中：f1和fn表示第1次和第n次測(cè)定的相對(duì)熒光強(qiáng)度值；t間隔測(cè)定時(shí)間。

ORAC值以每克多酚干粉等同于Trolox的微摩爾數(shù)表示（μmol Trolox/g多酚干粉）。

1.2.3.2 清除過氧自由基能力（PSC）測(cè)定 參照Adom 等[16]、王立峰等[24]方法進(jìn)行。DCFH反應(yīng)液制備：取1 mmol/L氫氧化鉀溶液900 μL與2.48 mmol/L的DCFH-DA溶液 80 μL，混合避光水解5 min，用（pH7.4，75 mmol/L）磷酸緩沖液定容至6 mL備用。于96孔黑色酶標(biāo)板中分別加入100 μL磷酸緩沖液（空白），100 μL不同濃度Trolox標(biāo)準(zhǔn)液和100 μL不同濃度樣品液，之后加入100 μL DCFH反應(yīng)液，迅速加入50 μL 200 mmol/L的ABAP反應(yīng)液。設(shè)定全功能酶標(biāo)儀37 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，入射波長(zhǎng)538 nm，每2 min進(jìn)行一次讀數(shù)，共40 min。

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均熒光值和熒光積累面積計(jì)算后作為計(jì)算抗氧化能力的基礎(chǔ)。根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：SA為樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的熒光積累面積；CA為空白對(duì)照的熒光積累面積。

PSC單元對(duì)應(yīng)著劑量-反應(yīng)曲線，可從曲線圖中計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度EC50值（concentration for 50% of maximal effect，EC50）。多酚樣品抗氧化能力用每毫克多酚干粉等同于Trolox的微克數(shù)表示（μg Trolox/mg多酚干粉）。

1.2.3.3 清除DPPH自由基能力（DRSA）測(cè)定 參考陳壁等[25]方法稍作調(diào)整。將石榴花多酚粗提物溶解稀釋成不同濃度，取各樣品0.5 mL，加入4 mL濃度約0.075 mmol/L的DPPH-甲醇工作液，混合避光放置30 min，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度；設(shè)空白對(duì)照。同時(shí)以VC標(biāo)準(zhǔn)品作陽性對(duì)照。最終計(jì)算DPPH自由基清除率和各樣品IC50值。

式中：A空白為DPPH乙醇溶液吸光度；A樣品為樣品溶液吸光度。

1.2.3.4 清除ABTS+自由基能力（TEAC）測(cè)定 測(cè)定參照張紅城等[26]方法稍作調(diào)整。ABTS自由基工作液：88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液 和5 mL 7 mmol/L ABTS溶液混勻避光保存過夜，得ABTS自由基儲(chǔ)備液；使用前將ABTS自由基儲(chǔ)備液與無水乙醇按一定比例進(jìn)行稀釋使用。將石榴花多酚粗提物溶解稀釋成不同濃度，取各待測(cè)樣品0.25 mL，加入4 mL ABTS自由基工作液，混勻靜置6 min，在734 nm處測(cè)定吸光度；設(shè)定空白對(duì)照。同時(shí)以VC標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照。最終計(jì)算ABTS+自由基清除率和各樣品IC50值。

式中：A空白為ABTS陽離子工作液吸光度；A樣品為樣品溶液吸光度。

1.2.3.5 還原能力（RP）測(cè)定 測(cè)定參照文獻(xiàn)[25,27]等方法進(jìn)行。將石榴花多酚粗提物用去離子水溶解并稀釋成不同濃度待測(cè)樣品，準(zhǔn)確吸取0.4 mL不同濃度的待測(cè)樣品，分別加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH6.6）和1 mL濃度為1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后置于50 ℃水浴保溫20 min，冷卻后加入1 mL濃度10%的三氯乙酸充分混勻后離心（4000 r/min，10 min）。離心后取上清液2 mL，加入1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，加去離子水定容，混勻靜置10 min后于700 nm處測(cè)定吸光值；設(shè)定空白對(duì)照。同時(shí)以VC標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)主要用SPSS 19.0，GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖表利用Origin 2018進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴花多酚粗提物多酚含量測(cè)定結(jié)果

以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=156.11X+0.0042，R2=0.9993，說明沒食子酸（GAE）在0.000～0.006 mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

將石榴花游離型和結(jié)合型多酚粗提物凍干粉所測(cè)吸光度代入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到游離型和結(jié)合型樣品多酚含量分別為244.08±10.41 mg GAE/g游離型干粉，66.50±1.04 mg GAE/ g結(jié)合型干粉，游離型多酚含量明顯高于結(jié)合型。

2.2 石榴花多酚粗提物體外抗氧化測(cè)定結(jié)果與分析

2.2.1 吸收過氧自由基能力（ORAC）測(cè)定結(jié)果 在有熒光素探針（FL）存在的條件下，添加ABAP激發(fā)產(chǎn)生過氧自由基（ROO·），熒光素探針被破壞，熒光強(qiáng)度減弱，在有抗氧化劑的條件下，可以抑制熒光強(qiáng)度的衰減[21]。通過測(cè)定可得不同濃度抗氧化劑Trolox、游離型和結(jié)合型多酚粗提物熒光強(qiáng)度隨時(shí)間衰減的時(shí)間動(dòng)力學(xué)與劑量反應(yīng)曲線圖，由圖2A可知，Trolox濃度越高，熒光衰減速度越慢，熒光積累量越大。由圖2B可知，同一濃度兩種多酚粗提物具有不同熒光強(qiáng)度衰減趨勢(shì)，同一時(shí)間游離型樣品熒光積累量最大，熒光衰減速度最慢，其次為結(jié)合型樣品，最后為空白對(duì)照。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，熒光衰退曲線下凈熒光面積（net AUC）為縱坐標(biāo)，繪制Trolox系列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線2C，通過換算得兩種多酚粗提物ORAC值分別為870.77±14.90 μmol Trolox/g游離型干粉，470.10±39.84 μmol Trolox/g結(jié)合型干粉。ORAC值越大說明樣品吸收過氧自由基能力越強(qiáng)，游離型多酚粗提物ORAC值高于結(jié)合型多酚粗提物ORAC值，表明游離型多酚粗提物吸收過氧自由基能力強(qiáng)于結(jié)合型（P＜0.05）。

圖2 吸收過氧自由基能力測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of oxygen radical absorbance capacity

2.2.2 清除過氧自由基能力（PSC）測(cè)定結(jié)果 加入ABAP激發(fā)產(chǎn)生過氧自由基（ROO·）氧化非熒光二氯熒光素（DCFH）為熒光二氯熒光素（DCF），可對(duì)產(chǎn)生的熒光進(jìn)行測(cè)定，通過添加能清除過氧自由基的抗氧化劑對(duì)DCFH的氧化進(jìn)行控制[21]。通過測(cè)定可得不同濃度Trolox以及游離型和結(jié)合型樣品熒光強(qiáng)度隨時(shí)間遞增的時(shí)間動(dòng)力學(xué)與劑量反應(yīng)曲線圖3A～圖3C。由圖可知，不同濃度Trolox以及兩種樣品總體趨勢(shì)均隨時(shí)間推移其熒光積累量均逐漸遞增，但低濃度樣品熒光積累量遞增急劇，高濃度樣品熒光積累量遞增平緩；從曲線平緩程度可推測(cè)樣品清除過氧自由基能力，樣品濃度越高，曲線斜率越小，清除能力越強(qiáng)；反之，樣品濃度越低，曲線斜率越大，清除能力越弱。

通過熒光積累量可換算得PSC值，樣品濃度與PSC值構(gòu)成劑量反應(yīng)曲線，見圖3D～圖3F。由圖可知不同濃度Trolox和多酚粗提物隨濃度變化產(chǎn)生不同PSC值，變化趨勢(shì)為低濃度樣品產(chǎn)生較大的熒光積累面積SA，較低的PSC值，高濃度樣品產(chǎn)生較小的熒光積累面積SA，較高的PSC值；但所有樣品到一定濃度后PSC值基本穩(wěn)定。從PSC單元構(gòu)成的劑量反應(yīng)曲線進(jìn)一步計(jì)算半數(shù)效應(yīng)濃度EC50值，Trolox的EC50=9.52 μg/mL，游離型和結(jié)合型分別為EC50=32.47、83.94 μg/mL，兩種多酚粗提物能引起50%抑制所需要的量分別約為VC量的3.4倍和8.8倍，PSC值分別為290 μg trolox/mg游離型干粉，110 μg trolox/mg結(jié)合型干粉。EC50值越低，抗氧化能力越強(qiáng)，游離型多酚粗提物樣品抗氧化能力高于結(jié)合型多酚粗提物（P＜0.05）。

2.2.3 清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力測(cè)定結(jié)果 DPPH自由基溶液和ABTS+自由基溶液分別在517 nm和734 nm處有吸光度值，當(dāng)向自由基溶液中加入待測(cè)樣品，若其吸光度值下降，則說明自由基濃度降低，待測(cè)樣品具有清除溶液中自由基的能力[5,13]。不同濃度VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物清除DPPH自由基和ABTS+自由基情況如圖4A～圖4C所示，由圖可知不同濃度的不同樣品均具有一定的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力，樣品濃度越高，清除率越強(qiáng)，清除率與樣品濃度呈良好的線性關(guān)系；但隨樣品濃度增加，自由基清除率先明顯上升后趨于平緩。

圖4 清除DPPH自由基和ABTS+自由基能力測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of DPPH and ABTS+ free radical scavenging ability

在清除DPPH自由基測(cè)定中，當(dāng)VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物分別達(dá)到40、70、350 μg/mL左右濃度時(shí)，清除率基本穩(wěn)定在80%左右；Kaur等將石榴花的乙醇提取物進(jìn)行DPPH自由基清除能力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL濃度下清除率達(dá)81.6%[5]。通過曲線擬合得各樣品清除DPPH自由基的IC50值大小依次為：VC（IC50=22.75 μg/mL）＞游離型（IC50=34.56 μg/mL）＞結(jié)合型（IC50=170.1 μg/mL），游離型和結(jié)合型樣品抗氧化能力相當(dāng)于VC的66%和13%。在清除ABTS+自由基測(cè)定中，當(dāng)VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物濃度分別達(dá)到60、80、450 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)到95%左右并趨于穩(wěn)定；通過曲線擬合得各樣品清除ABTS+自由基的IC50值大小依次為：VC（IC50=26.33 μg/mL）＞游離型（IC50=34.89 μg/mL）＞結(jié)合型（IC50=214.2 μg/mL），游離型和結(jié)合型樣品抗氧化能力相當(dāng)于VC的75%和12%。總的來說，樣品無論對(duì)DPPH自由基還是ABTS+自由基均具有一定的清除作用，且清除效果與濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

2.2.4 還原力測(cè)定結(jié)果 樣品與還原力測(cè)定的試劑反應(yīng)后，在700 nm處有吸光度值。若樣品抗氧化能力越強(qiáng)，則反應(yīng)后溶液吸光度越大，可用吸光度來表示樣品的還原能力[27]。由圖5可知，不同濃度的VC、游離型和結(jié)合型多酚粗提物還原力在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)都隨濃度增加而增強(qiáng)，線性擬合方程分別為：Y（VC）=0.0074X+0.013（R2=0.9987），Y（游離型）=0.0031X-0.0215（R2=0.9960），Y（結(jié)合型）=0.0004X+0.0024（R2=0.9978），有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。從圖5可知同一濃度VC、游離型和結(jié)合型樣品吸光度值差別顯著（P＜0.05），游離型和結(jié)合型樣品還原力顯著低于VC（P＜0.05），總體還原力大小為：VC＞游離型＞結(jié)合型。

圖5 還原能力測(cè)定結(jié)果Fig.5 Determination results of reducing capacity

3 結(jié)論

對(duì)石榴花中游離型和結(jié)合型多酚粗提物進(jìn)行提取并進(jìn)行多酚含量測(cè)定和抗氧化能力評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，游離型多酚粗提物多酚含量（244.08±10.41 mg GAE/g游離型干粉）顯著高于結(jié)合型多酚粗提物（66.50±1.04 mg GAE/g結(jié)合型干粉）（P＜0.05）；兩種多酚提取物吸收過氧自由基能力（ORAC）測(cè)定中，以Trolox作為陽性對(duì)照，Trolox和兩種多酚粗提物有明顯的熒光衰減動(dòng)力學(xué)與劑量反應(yīng)趨勢(shì)，ORAC值分別為870.77±14.90 μmol Trolox/g游離型干粉，470.10±39.84 μmol Trolox/g結(jié)合型干粉；清除過氧自由基能力（PSC）測(cè)定中，以Trolox作為陽性對(duì)照，Trolox和兩種多酚粗提物有明顯的熒光遞增動(dòng)力學(xué)與劑量反應(yīng)趨勢(shì)，有明顯的PSC單元反應(yīng)劑量趨勢(shì)，EC50值分別為32.47和83.94 μg/mL，PSC值分別為290 μg Trolox/mg游離型干粉，110 μg Trolox /mg結(jié)合型干粉。清除DPPH自由基的IC50值分別為34.56和170.1 μg/mL，以VC作為陽性對(duì)照，其抗氧化能力相當(dāng)于VC的66%和13%；清除ABTS+自由基的IC50值分別為34.89和214.2 μg/mL，以VC作為陽性對(duì)照，其抗氧化能力相當(dāng)于VC的75%和12%；還原力表現(xiàn)均為樣品在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度的增加而增強(qiáng)。5項(xiàng)抗氧化活性指標(biāo)測(cè)定中游離型多酚粗提物抗氧化能力均高于結(jié)合型（P＜0.05）。

本研究表明石榴花游離型和結(jié)合型多酚粗提物均具有一定抗氧化作用，游離型抗氧化能力優(yōu)于結(jié)合型，與抗氧化劑Trolox和VC比較，抗氧化性稍弱，但作為天然抗氧化劑，具有一定研究?jī)r(jià)值，可為石榴花的深加工和應(yīng)用提供新思路，也可為天然抗氧化劑的研究與開發(fā)奠定一定理論基礎(chǔ)。