孫冬梅，蘭 韜 ，云振宇，于聰聰，初 僑，張維冰

（1.華東理工大學，上海 200237；2.中國標準化研究院，北京 100191）

火麻油是以工業(yè)大麻籽冷榨產(chǎn)生的油脂類產(chǎn)品，其含有高達80%的多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）[1]，ω-6/ω-3的比例為3:1，這與歐洲食品安全局的建議[2]一致?；鹇橛蜖I養(yǎng)豐富，長期食用可有效補充人體必需營養(yǎng)素α-亞麻酸，潤燥滑腸、有益于心腦血管健康，具有延年益壽的功效[2]。同時其中含有Δ9-四氫大麻酚（Δ9 Tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（Cannabidiol，CBD）、大麻酚（Cannabinol，CBN）、四氫大麻酚酸（Tetrahydro-cannabinolic Acid，THCA）、大麻二酚酸（Cannabidiolic acid，CBDA）等大麻酚類物質(zhì)。除THC具有影響中樞神經(jīng)的作用而受到管控外，CBD、CBN等物質(zhì)也具有降低血脂、血壓、血糖等保健功效[3-5]，CBD在醫(yī)學上對癲癇[6]、抑郁癥[7]、多發(fā)性硬化癥[8]等疾病也具有明顯的治療作用。

由于火麻油的原料及制備工藝不同，其中THC、CBD、CBDA、CBN、THCA等大麻素的含量也存在很大差異[9-11]。隨著工業(yè)大麻食品的日益普及，美國、德國、瑞士、比利時、歐洲工業(yè)大麻協(xié)會（European Industrial Hemp Association，EIHA）等許多國家相繼發(fā)布了政策和法規(guī)，對火麻油等消費產(chǎn)品中THC的上限進行了規(guī)定[12]。我國也存在大量火麻油類產(chǎn)品，卻尚未出臺關(guān)于工業(yè)大麻食品中THC、CBD等大麻素的限量標準以及檢測標準，相關(guān)標準的缺失導致無法把控產(chǎn)品質(zhì)量，造成市場上火麻油產(chǎn)品良莠不齊。為了保證火麻油類食品的安全性，同時為了兼顧火麻油類食品的功能性，需要建立標準化的火麻油中幾種常見大麻酚類物質(zhì)的檢測方法，為后續(xù)建立相應標準，以及進行相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。

由于大麻素的結(jié)構(gòu)相似以及這些物質(zhì)之間存在的轉(zhuǎn)換關(guān)系[13-15]，如圖1所示，這對分析方法的準確性提出了較高要求。目前報道了大量針對不同基質(zhì)中多種大麻素的檢測方法，主要檢測手段包括GCFID[16]、GC-MS[17]、HPLC-DAD[18-21]、HPLC-MS[22-24]

圖1 5種大麻素結(jié)構(gòu)式及相互轉(zhuǎn)換圖Fig.1 Structural formulas and mutual conversion diagrams of 5 cannabinols

等。由于GC會在加熱的過程中使一些大麻酚酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為大麻素類物質(zhì)，不利于大麻酚酸類物質(zhì)的檢測，所以在同時檢測大麻素和大麻酚酸類物質(zhì)時通常使用HPLC的方法。研究人員在早期通常采用常規(guī)的C18填料對多種大麻素進行分離分析。隨著一些特殊的選擇性固定相的誕生，研究者開始嘗試用這些新穎的固定相對這些大麻素進行選擇性地分離分析，并取得了較好的分離效果[25-26]。如H?dener等[27]基于C8核殼結(jié)構(gòu)固定相對干燥大麻植株中THC、THCA、CBD、CBDA、CBN五種大麻素進行了分離。Ciolino等[28]采用芳基改性的C18固定相，發(fā)展了工業(yè)大麻相關(guān)產(chǎn)品中11種大麻素的檢測方法，都取得了較好的分離選擇性。作為工業(yè)大麻相關(guān)產(chǎn)品中最常見的幾種大麻素，THC、THCA、CBD、CBDA、CBN被研究的最多。而針對這幾種常見的大麻素，不需要使用特殊選擇性的固定相，使用常規(guī)的C18固定相即可實現(xiàn)良好的分離效果。

為了發(fā)展一個標準化的、普適性好的火麻油中THC、THCA、CBD、CBDA、CBN等大麻素的檢測方法，本文廣泛采集了國內(nèi)山西、廣西、陜西、黑龍江4個不同產(chǎn)地的火麻油，并根據(jù)不同產(chǎn)地火麻油基質(zhì)的特點，通過優(yōu)化前處理條件和色譜條件，發(fā)展了一種普適、簡單、穩(wěn)定、準確的火麻油中五種大麻素的檢測方法，并通過方法學驗證，實現(xiàn)檢測方法的標準化，為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麻素標準品：CBDA、CBD、CBN、THC、THCA標準品（1 mg/mL，1 mL） 美國Cerilliant公司；甲醇、乙腈 色譜純，德國Merck公司；異丙醇 色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；4個產(chǎn)地火麻油（山西、陜西、廣西、黑龍江） 網(wǎng)購。

iChrom5100分析型國產(chǎn)液相色譜儀（配DAD檢測器）、Supersil-ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 大連依利特分析儀器有限公司；Thmorgan-VM200型渦旋振蕩器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII離心機 日立公司；Sartorius分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；ELGA純水儀 北京誠驛恒儀科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 流動相 流動相A為純水，為實驗室純水儀自制，電導率為18.2 MΩ，使用前經(jīng)水相濾膜抽濾，超聲脫氣。

流動相B為乙腈（色譜純），使用前經(jīng)有機相濾膜抽濾，超聲脫氣。

1.2.1.2 標準溶液 混和標準儲備液：取CBDA

（1 mg/mL）、CBD（1 mg/mL）、CBN（1 mg/mL）、THC（1 mg/mL）、THCA（1 mg/mL）標準品轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入混合溶劑（甲醇:異丙醇=80:20，v/v）定容，配制成100 μg/mL的5種大麻素混和標準儲備液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為30 d。

標準工作溶液：準確吸取混合標準儲備液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，用混合溶劑（甲醇:異丙醇=80:20，v/v）定容，配制為質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的系列混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 準確稱取0.5 g（精確到0.001 g）火麻油于10 mL離心管中，加入2.5 mL混合溶劑（甲醇:異丙醇=80:20，v/v），渦旋2 min混勻，超聲提取15 min，提取液以10000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜后待測。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Supersil-ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣體積為10 μL，流速1 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測波長為220 nm，流動相A相為超純水，流動相B相為乙腈，梯度洗脫條件為0～20 min，70%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～70%B；24～30 min，70%B。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 標準曲線 將配制好的0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL標準工作溶液按“1.2.3”的液相色譜條件進樣分析，分別以5種化合物的濃度為橫坐標，峰面積響應值為縱坐標，繪制系列標準曲線，進行線性回歸，得到5種大麻素的標準曲線線性回歸方程。

1.2.4.2 定量限、檢出限 將1.2.1.2的標準系列溶液按“1.2.3”的液相色譜條件測定，測得5種大麻素的峰面積，帶入相應物質(zhì)的標準曲線回歸方程中。以最低水平標準溶液中目標組分的3倍平均信噪比為檢出限（LOD），10倍平均信噪比為定量限（LOQ），計算得本方法的LOD和LOQ。

1.2.4.3 精密度試驗 在相同儀器條件下，取1 μg/mL濃度的標準工作溶液, 按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進樣6次，測得峰面積，代入標準曲線線性回歸方程得出測定濃度值，再計算測定濃度的相對標準偏差RSD。

1.2.4.4 重復性試驗 在相同的儀器條件下，精密稱取0.5g（精確到0.001 g）火麻油6份，按“1.2.2”項下方法操作，將處理好的6份待測液按“1.2.3”色譜條件進樣分析，測得5種大麻素峰面積，代入標準曲線方程，計算測定濃度的標準偏差RSD。

1.2.4.5 加標回收率 準確稱取陜西產(chǎn)的火麻油0.5 g（精確到0.01 g）12份，編號1～12，其中1～3號作為本底，4～6號加標配成0.5 μg/mL待測液，7～9號加標配成1 μg/mL待測液，10～12號加標配成5 μg/mL待測液，按“1.2.2”項下方法操作，將處理好的本底待測液以及低、中、高3種濃度的加標樣品經(jīng)HPLC分析，測得峰面積，計算回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文標準曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)由依利特ichrom5100 workstation處理所得，其他數(shù)據(jù)采用Origin8.5和Excel2010軟件對數(shù)據(jù)進行處理并作圖，實驗數(shù)據(jù)取3次平行實驗的平均值

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

為盡可能的將待測的五種大麻素類物質(zhì)與火麻油中的基質(zhì)成分的分離，首先對流動相梯度程序進行了優(yōu)化。以山西火麻油的甲醇提取液為本底溶液，向其中添加了5 μg/mL混合標準品，采用兩種不同的流動相梯度程序?qū)Ρ镜滓汉图訕艘悍謩e進行了色譜分離，兩種流動相梯度程序分別為：程序1：0～20 min，80%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～80%B；24～30 min，80%B。程序2：0～20 min，70%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～70%B；24～30 min，70%B。分離結(jié)果如圖2所示，并通過單標法對峰的歸屬進行了確證。結(jié)果表明在梯度程序1下CBD無法與火麻油基質(zhì)成分分離，THC和THCA分離度較差。而經(jīng)過降低初始有機相的組成，在梯度程序2下，火麻油中各個峰分離情況較好，且基質(zhì)中雜質(zhì)峰和待測的五種大麻素的色譜峰沒有相互掩蓋，所以后續(xù)實驗都采用梯度程序1進行實驗優(yōu)化和方法驗證。并且從圖2可以看出，通過調(diào)整流動相的比例，改變洗脫條件，能夠?qū)崿F(xiàn)將基質(zhì)中雜質(zhì)峰與被分析物色譜峰分離的效果，降低了雜質(zhì)峰干擾的可能，從而省去對提取液進行凈化處理的步驟，使得操作簡便、耗時較短。

圖2 兩種梯度程序下5 μg/mL加標混合標準品的火麻油甲醇提取液樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of the hemp oil methanol extract with a spiked concentration of 5 μg/mL under two different gradient programs

2.2 提取溶劑優(yōu)化

根據(jù)5種大麻素的結(jié)構(gòu)、極性、溶解性等性質(zhì)[29-30]，選擇合適的提取方法和提取溶劑是檢測的重要前提。有較多文獻[26,30]選擇使用甲醇作為提取溶劑，提取火麻油中的大麻酚類物質(zhì)?？紤]到異丙醇可以和水、脂肪類化合物以及較多有機物都有較好的互溶，并且其閃燃點、爆炸極限等安全性能都較好，對環(huán)境和人體健康影響較小，常被用于植物提取物的提取。

因此，在儀器及實驗條件相同情況下，本實驗選擇了100%甲醇；甲醇:異丙醇=80:20；甲醇:異丙醇=50:50的3種溶劑，取相同火麻油樣品，向其中添加了5 μg/mL混合標準品，采用“1.2.2”的樣品提取方式，分別用以上3種溶劑進行提取，并測定加標回收率，結(jié)果如下表1。從表1中可以看出，添加了異丙醇后，樣品的回收率可以控制在70%～100%之間，其中以甲醇:異丙醇=80:20進行提取，結(jié)果具有更好的穩(wěn)定性，可以控制RSD＜5%。所以在后續(xù)實驗中采用甲醇:異丙醇=80:20的提取溶劑進行提取。

表1 3種不同溶劑提取結(jié)果對比Table 1 Comparisonof extraction results of three different solvent

2.3 標準曲線、定量限、檢出限

對5種大麻素混合標準溶液系列進行測定，通過ichrom5100 workstation繪制標準曲線回歸方程，其線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQ如下表2所示。由表中數(shù)據(jù)可知，本方法在0.5～50 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均＞0.998。經(jīng)計算，5種大麻素的檢出限（LOD，S/N=3）均在0.10～0.25 mg/kg之間，定量限（LOQ，S/N=10）均在0.33～0.83 mg/kg之間，與國家司法鑒定技術(shù)規(guī)范方法[31]的LOD接近（0.05 ng/mg），但由于該方法使用的是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進行檢測，而本方法使用常規(guī)的HPLC進行檢測，所以本方法在經(jīng)濟適用的基礎(chǔ)上，檢測靈敏度也具有較強競爭力。

表2 5種大麻素的線性范圍、LOD和LOQTable 2 Linear range, LOD and LOQ of 5 kinds of cannabidiol

2.4 精密度

按照“1.2.4.3”實驗步驟，在1 d內(nèi)平行測定6次1 μg/mL的混合標準溶液，測得的CBDA、CBD、CBN、THC、THCA五種大麻素的濃度與RSD如下表3所示。由上表數(shù)據(jù)可知，精密度實驗結(jié)果RSD在0.7%～3.9%之間，表明儀器精密度良好，使用該儀器進行檢測，可以保證方法的結(jié)果準確。

表3 精密度實驗結(jié)果（μg/mL）Table 3 Precision test results (μg/mL)

2.5 重復性

以陜西產(chǎn)的火麻油為樣品，按照“1.2.4.4”實驗步驟，測得平行6組火麻油中CBDA、CBD、CBN、THC、THCA五種大麻素的濃度及RSD如下表4所示。由上表數(shù)據(jù)可知，6次重復實驗的RSD在1.9%～3.2%之間，表明本方法重復性較好，結(jié)果準確性較好。

表4 重復性實驗結(jié)果（μg/mL）Table 4 Repeatability experiment results (μg/mL)

2.6 加標回收率

在陜西產(chǎn)的火麻油實際樣品中添加0.5、1、5 μg/mL的低、中、高三種濃度水平的大麻素混合標準溶液，用本實驗方法進行測定，并計算回收率，結(jié)果如表5所示。由表中數(shù)據(jù)可知，5種大麻素的回收率在77.1%～103.3%，相對標準偏差RSD≤4.7%，表明本方法回收率好，結(jié)果準確可靠。

表5 加標回收率實驗結(jié)果（n=3）Table 5 Recovery rate of three different spiked levels (n=3)

2.7 實際樣品測定

以本方法的提取工藝和色譜條件對廣西、黑龍江、山西、陜西4個產(chǎn)地的火麻油樣品進行了分離分析，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，4個產(chǎn)地的火麻油中均或多或少的存在一定量的5種大麻素，這5種大麻素與基質(zhì)中的其他物質(zhì)實現(xiàn)了良好的分離，不影響這5種大麻素的定量分析。對山西、廣西、陜西、黑龍江4個不同產(chǎn)地的火麻油中5種大麻素含量進行計算，計算結(jié)果見表6。實際樣品分析結(jié)果表明，除山西火麻油中不含CBDA和THCA外，陜西、廣西、黑龍江等3個產(chǎn)地的火麻油中5種大麻素都有檢出，且具有成癮性的THC的含量均＞3.2 mg/kg，其中陜西火麻油中THC含量甚至高達11.9 mg/kg。歐盟國家對工業(yè)大麻食品中特征大麻素THC含量的限定標準為10 mg/kg；2017年，澳大利亞和新西蘭在澳新食品標準法典中修訂了大麻籽及相關(guān)食品標準，規(guī)定火麻油中THC含量不高于10 mg/kg[32]；智利在2016年發(fā)布的通報中也規(guī)定大麻子食品中THC含量不得超過10 mg/kg。我國廣西壯族自治區(qū)分別于2014、2015、2018年制定火麻油、火麻仁以及火麻糊的地方標準，允許以火麻籽為原料，經(jīng)加工工藝制成的非直接食用的火麻仁添加到食品中[33-35]，但是都未對其中THC含量進行規(guī)定。從目前國內(nèi)4個產(chǎn)地火麻油的監(jiān)測結(jié)果可以看出，只有陜西火麻油中THC含量為11.9 mg/kg，超過了世界上主流國家對于工業(yè)大麻食品中THC含量的要求，有一定的食品安全風險，有關(guān)部門應加強監(jiān)測，建議在火麻油標準中增加THC含量的限定指標，不應超過10 mg/kg。同時應制定相應的火麻油中大麻酚素檢測方法標準，完善監(jiān)管制度以保障食品安全。

表6 不同產(chǎn)地火麻油中5種大麻素含量（mg/kg）（n=3）Table 6 Contents of 5 cannabinols in hemp oil from different producing areas (mg/kg) (n=3)

圖3 4個產(chǎn)區(qū)火麻油的分離譜圖Fig.3 Chromatogram of hempseed oil from four different regions

3 結(jié)論

大麻籽和大麻籽油相關(guān)產(chǎn)品具有較高的蛋白質(zhì)含量和營養(yǎng)價值，在消費者中很受歡迎，本文建立了一種基于高效液相色譜法的同時檢測火麻油中5種大麻素的分析方法。通過調(diào)節(jié)流動相配比，優(yōu)化色譜條件實現(xiàn)被測組分色譜峰與基質(zhì)中雜質(zhì)峰的有效分離，該分析方法操作簡便、耗時較短、經(jīng)濟。同時經(jīng)過精密度實驗、重復性實驗以及加標回收率實驗等對本方法的有效性進行驗證，結(jié)果表明，本方法的檢出限、定量限、精密度、回收率等結(jié)果均較好，可用于實際樣品的分析確證，同時可為相關(guān)檢測方法標準的建立奠定方法學基礎(chǔ)。通過對國內(nèi)4個產(chǎn)地的火麻油進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中均含有THC，而且有部分產(chǎn)地火麻油中THC含量超過了世界上主流國家對于工業(yè)大麻食品中THC含量的要求（10 mg/kg），存在一定的食品安全風險，建議在火麻油標準中增加THC含量的限定指標，不應超過10 mg/kg，同時制定相應的火麻油中大麻素檢測方法標準，實現(xiàn)對相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制，保障人民群眾健康。