李佳蕓，王欣之，韋源青，卞慧敏，劉 睿,3, ，吳 皓,

（1.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

馬氏珍珠貝（Pinctada martensiiDunker）是生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類，其育珠產(chǎn)量占海水珍珠產(chǎn)量的85%以上[1-2]。2020版《中國(guó)藥典》[3]記載珍珠味甘、咸、寒，入心、肝經(jīng)，有安神定驚、明目消翳、解毒生肌、潤(rùn)膚祛斑的功效；珍珠母味咸性寒，歸肝、心經(jīng)，具有平肝潛陽，安神定驚，明目退翳的功效。源于馬氏珍珠貝的珍珠和珍珠母應(yīng)用于中醫(yī)臨床已有千年歷史，其珍珠和貝殼均是重要的傳統(tǒng)中藥，歷代本草均有記載。盡管其軟體部分的功效鮮有記載，但現(xiàn)代研究表明馬氏珍珠貝軟體富含蛋白質(zhì)類、多烯不飽和脂肪酸類，及人體所需的各種無機(jī)鹽和微量元素[4]，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富。

近年來，酶解技術(shù)被廣泛應(yīng)用于貝類軟體活性肽制備的研究。在蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)類被水解為易吸收的小分子多肽[5]。研究表明，這類小分子多肽通常具有降血壓、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等作用[6-15]。如采用復(fù)合蛋白酶對(duì)紅島蛤蜊[16]進(jìn)行酶解，得到的蛤蜊肽具有良好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性。木瓜蛋白酶酶解聯(lián)合Plastein反應(yīng)修飾的方法得到的牡蠣[17]多肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率為82.31%。胰蛋白酶酶解貽貝[18]得到的酶解肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率的IC50為215.96 μg/mL。復(fù)合蛋白酶酶解扇貝裙邊[19]得到的酶解肽具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，可以改善正常小鼠對(duì)血糖濃度的調(diào)節(jié)能力，對(duì)機(jī)體的糖耐受能力有一定的增強(qiáng)作用。本課題組前期采用酸性蛋白酶酶解雜色蛤[20]得到的酶解肽具有二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase，DPPIV）抑制活性且可促進(jìn)胰島素抵抗細(xì)胞的葡萄糖攝取量。

軟體動(dòng)物蛋白質(zhì)類成分豐富，是酶解活性肽的重要來源，本文在前期研究基礎(chǔ)上以DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)篩選優(yōu)化酶解工藝，評(píng)價(jià)馬氏珍珠貝軟體酶解肽的降糖活性，并探究其物質(zhì)組成。通過本文的研究以期為馬氏珍珠貝軟體降糖產(chǎn)品的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮馬氏珍珠貝軟體 廣西北海；HepG-2細(xì)胞中科院上海細(xì)胞庫；酸性蛋白酶（50000 U/g）、堿性蛋白酶（200000 U/g）、中性蛋白酶（50000 U/g）、復(fù)合蛋白酶（100000 U/g）、胰蛋白酶（250000 U/g）、木瓜蛋白酶（800000 U/g）、鹽酸羅格列酮 北京索萊寶科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶（20000 U/g） 源葉試劑公司；DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；DPP-IV 美國(guó)BioLegend公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；IIe-Pro-IIe（純度＞98.0%） 南京金斯瑞生物科技有限公司。

BT 125 D型電子分析天平 德國(guó)Sartorious有限公司；FA 2004型電子分析天平 上海上平儀器設(shè)備有限公司；真空濃縮蒸發(fā)儀 美國(guó)Labconco公司；PHS-25 pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；MO-AOR型培養(yǎng)箱 美國(guó)Major Science公司；BB 150二氧化碳培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo scientific公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備公司；戴安U3000 Nano RSLC納升液相系統(tǒng) 美國(guó)DIONEX公司；Thermo Q Exactive Plus Orbitrap質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬氏珍珠貝軟體酶解工藝 稱取一定量的馬氏珍珠貝軟體（僅貝肉），按設(shè)定的料液比加入純水后勻漿，用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)至最適的pH，然后加入適量的蛋白酶，置于恒溫水浴鍋中調(diào)至最適溫度進(jìn)行攪拌酶解。酶解1 h后，沸水浴滅酶10 min，冷卻后5000 r/min離心20 min，取上清液，得馬氏珍珠貝軟體酶解液。將酶解液凍干，得馬氏珍珠貝軟體酶解液凍干粉。

1.2.2 蛋白酶的篩選 稱取100 g馬氏珍珠貝軟體，按料液比1:3（w:w）加入純水，勻漿，平均分成7份。選取7種蛋白酶：酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶。在加酶量1000 U/g（每1 g軟體加入1000 U蛋白酶）以及各酶的最適pH和溫度下酶解1 h，具體酶解條件見表1。其余步驟同1.2.1，得到的酶解液凍干粉以DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量為指標(biāo)[20-21]，選出馬氏珍珠貝軟體酶解的最佳蛋白酶。

表1 不同蛋白酶酶解條件Table 1 Digestion conditions of different proteases

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶解溫度的篩選 稱取100 g馬氏珍珠貝軟體，按料液比1:3（w:w）加入純水，勻漿，平均分成5份。溫度設(shè)定為40、45、50、55、60 ℃[22]，調(diào)節(jié)pH3.0，選擇酸性蛋白酶，加酶量1000 U/g，酶解1 h。其余步驟按“1.2.2”操作。取凍干粉測(cè)DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.2.3.2 酶解時(shí)間的篩選 稱取100 g馬氏珍珠貝軟體，按料液比1:3（w:w）加入純水，勻漿，平均分成5份。溫度設(shè)定為45 ℃，調(diào)節(jié)pH3.0，選擇酸性蛋白酶，加酶量1000 U/g，各樣品分別酶解1、2、3、4、5 h。其余步驟按“1.2.2”操作。取凍干粉測(cè)DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.2.3.3 加酶量的篩選 稱取100 g馬氏珍珠貝軟體，按料液比1:3（w:w）加入純水，勻漿，平均分成5份。溫度設(shè)定為45 ℃，調(diào)節(jié)pH3.0，選擇酸性蛋白酶，各樣品加酶量分別為600、800、1000、1200、1400 U/g，酶解3 h。其余步驟按“1.2.2”操作。取凍干粉測(cè)DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.2.3.4 料液比的確定 稱取100 g馬氏珍珠貝軟體，平均分成5份，按料液比1:1、1:2、1:3、1:4、1:5（w:w）分別加入純水，勻漿。溫度設(shè)定為45 ℃，調(diào)節(jié)pH3.0，選擇酸性蛋白酶，加酶量1000 U/g，酶解3 h。其余步驟按“1.2.2”操作。取凍干粉測(cè)DPPIV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量。

1.2.4 馬氏珍珠貝軟體酶解正交試驗(yàn) 在單因素酶解實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇酶解溫度、時(shí)間、加酶量、料液比四個(gè)因素，以DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行酶解工藝的優(yōu)化，試驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 馬氏珍珠貝軟體不同極性酶解樣品的制備及活性測(cè)定 取酶解樣品凍干粉200 mg，用0.1% TFA復(fù)溶，采用Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱分離，上樣，以0.1% TFA洗脫10次后，分別用10%、15%、20%、40%乙腈（均含0.2% TFA）洗脫，收集不同濃度的乙腈洗脫液，凍干保存，待測(cè)DPP-IV抑制率。

1.2.6 馬氏珍珠貝軟體酶解肽15%乙腈洗脫部位Nano LC-MS/MS分析 色譜條件：色譜柱：Reprosil C18AQ（75 μm×150 mm, 5 μm）；進(jìn)樣量1 μL，流速400 nL/min；流動(dòng)相A（乙腈-甲酸-水 2:0.2:98），流動(dòng)相B（乙腈:甲酸:水 80:0.2:20），2%～30% B線性梯度洗脫120 min。

質(zhì)譜條件：電子能量2.5 kV；離子傳輸毛細(xì)管溫度200 ℃；質(zhì)譜一級(jí)全掃描范圍m/z 300～2000；分離寬度3。串聯(lián)質(zhì)譜分析獲得總離子色譜圖（TIC），通過碰撞誘導(dǎo)解離（CID），產(chǎn)生一系列MS/MS圖。

采用Maxquant軟件進(jìn)行搜庫鑒定，選擇軟體動(dòng)物門數(shù)據(jù)庫（Mollusca，2021年1月下載于www.uniprot.org）；檢索參數(shù)：前體離子誤差20 ppm，子離子誤差0.2 Da；酶切方式：unspecific；其他為默認(rèn)參數(shù)，在上述檢索條件下所得的分值有顯著性意義（P＜0.05），被認(rèn)為有效的鑒定結(jié)果[23]。

1.2.7 HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量的測(cè)定 HepG-2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基[24-26]培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，孵育24 h后，給藥。

對(duì)照組、模型組給予單一培養(yǎng)基，陽性藥組給予0.2 mg/mL的鹽酸羅格列酮溶液，給藥組給予不同濃度樣品。給藥30 min后，對(duì)照組加全培，模型組、陽性藥組、給藥組加50 mg/mL棕櫚段誘導(dǎo)劑，孵育24 h后，更換培養(yǎng)基為低糖DMEM孵育12 h。

采用GOD-POD微量法在505 nm下測(cè)剩余葡萄糖含量，利用標(biāo)準(zhǔn)品吸光度（OD）值，計(jì)算葡萄糖消耗量[27]。

1.2.8 體外DPP-IV抑制率的測(cè)定 分為樣品組、樣品空白組、陽性藥組、陽性藥空白組、陰性對(duì)照組和空白組。樣品組和樣品空白組加入1.25 mg/mL樣品，陽性藥及陽性藥空白組加入0.3 mmol/L Ile-Pro-Ile溶液，陰性對(duì)照組和空白組加入15 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液；各組均加入3.2 mmol/L Gly-Pro-PNA 37 ℃孵育10 min后，給藥組、陽性藥組、陰性對(duì)照組加入0.1 μg/mL DPP-IV溶液，繼續(xù)孵育1 h后，加100 μL 1 mmol/L醋酸鈉水溶液終止反應(yīng)。

在405 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算DPP-IV抑制率[28-29]。

1.2.9 活性評(píng)分方法 葡萄糖消耗量評(píng)分為各種酶解方法在不同濃度的倒數(shù)與對(duì)應(yīng)葡萄糖消耗量的乘積的平均值；綜合評(píng)分為葡萄糖消耗量評(píng)分和DPPIV抑制率的和。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

本實(shí)驗(yàn)選取了7種常用的蛋白酶：酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶，以DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量為指標(biāo)，酶解結(jié)果如圖1所示。由圖1A可知，酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶酶解的馬氏珍珠貝軟體樣品在不同濃度下其葡萄糖消耗量均高于胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解的樣品；由圖1B可知，風(fēng)味蛋白酶酶解的產(chǎn)物DPP-IV抑制率最高，為53.34%，酸性蛋白酶次之，為46.61%。以葡萄糖消耗量評(píng)分和DPP-IV抑制率的和綜合評(píng)分，如圖1C所示，酸性蛋白酶酶解產(chǎn)物的綜合評(píng)分最高，為68.83%，這可能是由于酸性蛋白酶的酶切位點(diǎn)使馬氏珍珠貝軟體暴露的降糖活性位點(diǎn)更充分，故選擇酸性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 蛋白酶種類對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Effect of protease types on the effect of enzymolysis

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解溫度的篩選 酶解溫度過高或過低均會(huì)降低酸性蛋白酶的活力。酶解溫度對(duì)HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響如圖2A所示，當(dāng)HepG-2細(xì)胞的給藥濃度大于25.00 μg/mL時(shí)，在40～45 ℃范圍內(nèi)，細(xì)胞的葡萄糖消耗量隨溫度升高而增大，溫度為50 ℃時(shí)，達(dá)到最大值。酶解溫度對(duì)DPP-IV抑制率的影響如圖2B所示，在40～50 ℃范圍內(nèi)DPP-IV抑制率隨溫度升高而增大，50 ℃時(shí)酶解的產(chǎn)物表現(xiàn)出最高的DPP-IV抑制率52.74%。超過50 ℃時(shí)DPP-IV抑制率開始下降。酶解溫度增高，提高了分子碰撞的機(jī)率，有利于催化酸性蛋白酶酶解馬氏珍珠貝軟體。溫度繼續(xù)升高，酶的活性下降，酶解不充分導(dǎo)致發(fā)揮降糖作用的活性位點(diǎn)未暴露而未能發(fā)揮作用。以葡萄糖消耗量評(píng)分和DPP-IV抑制率的和綜合評(píng)分，如圖2C所示，50 ℃下酶解得到的產(chǎn)物評(píng)分最高，為63.42%，故選擇50 ℃作為酸性蛋白酶的酶解溫度。

圖2 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on enzymolysis effect

2.2.2 酶解時(shí)間的篩選 酶解時(shí)間對(duì)HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響如圖3A所示，酶解時(shí)間從1到5 h，細(xì)胞各給藥濃度均在3 h處達(dá)到最高點(diǎn)，表明酶解3 h的產(chǎn)物在各濃度下均表現(xiàn)出較高的葡萄糖消耗量；圖3B中酶解3 h的產(chǎn)物DPP-IV抑制率最高，為74.19%。這可能是由于酶解時(shí)間較短時(shí)軟體酶解不充分，導(dǎo)致水解度降低，發(fā)揮降糖活性的位點(diǎn)未暴露而未能發(fā)揮作用；酶解時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致副反應(yīng)發(fā)生，生成的副產(chǎn)物阻礙了酶解肽活性位點(diǎn)與相應(yīng)受體的結(jié)合，導(dǎo)致降糖活性減弱。以葡萄糖消耗量評(píng)分和DPP-IV抑制率的和綜合評(píng)分，如圖3C所示，酶解3 h的產(chǎn)物綜合評(píng)分最高，為79.74%。因此酸性蛋白酶酶解馬氏珍珠貝軟體的最佳時(shí)間為3 h。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the effect of enzymolysis

2.2.3 加酶量的篩選 加酶量對(duì)HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量影響如圖4A所示，加酶量在600～1200 U/g范圍內(nèi)，HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量均隨給藥濃度增大而呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，加酶量為1400 U/g，給藥濃度大于1.56 μg/mL時(shí)，HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量較加酶量為1200 U/g時(shí)均呈下降趨勢(shì)，這表明給藥濃度過高和加酶量過高對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞攝取葡萄糖有一定的抑制作用；加酶量對(duì)DPP-IV抑制率的影響如圖4B所示，加酶量為1000 U/g的酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出最高的DPP-IV抑制率，為78.96%。這可能是由于加酶量過低時(shí)，馬氏珍珠貝軟體未充分酶解，發(fā)揮降糖作用的位點(diǎn)未充分暴露導(dǎo)致降糖活性較弱；加酶量過高時(shí)，可能會(huì)有副反應(yīng)發(fā)生，生成的副產(chǎn)物阻礙了酶解肽活性位點(diǎn)與相應(yīng)受體的結(jié)合，導(dǎo)致降糖活性減弱。以葡萄糖消耗量評(píng)分和DPP-IV抑制率的和綜合評(píng)分，如圖4C所示，加酶量為1000 U/g的酶解產(chǎn)物綜合評(píng)分最高，為85.42%，故選擇加酶量為1000 U/g。

圖4 加酶量對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the enzymolysis effect

2.2.4 料液比的確定 料液比對(duì)HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響如圖5A所示，在各料液比條件下，HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量均隨給藥濃度的升高呈上升趨勢(shì)；料液比從1:2到1:5（w:w），給藥濃度小于6.25 μg/mL時(shí)HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量在料液比為1:3或1:4（w:w）時(shí)達(dá)到最高值。料液比過低時(shí)，底物濃度較高可催化酶解反應(yīng)進(jìn)行，但反應(yīng)體系較粘稠導(dǎo)致酶解反應(yīng)不充分，因此出現(xiàn)了圖5A所示的料液比為1:1（w:w）時(shí)細(xì)胞的葡萄糖消耗量在各給藥濃度下均高于料液比為1:2（w:w）時(shí)細(xì)胞的葡萄糖消耗量；料液比過高時(shí)，反應(yīng)體系為溶液狀態(tài)，酶和底物可以充分接觸反應(yīng)完全，但底物濃度過低導(dǎo)致酶解反應(yīng)緩慢，因此出現(xiàn)了圖5A所示的給藥濃度低于6.25 μg/mL時(shí)料液比增加到1:5（w:w），細(xì)胞的葡萄糖消耗量開始降低的現(xiàn)象。料液比對(duì)DPPIV抑制率的影響如圖5B所示，可能是由于料液比為1:3（w:w）時(shí)的反應(yīng)體系為溶液狀態(tài)且底物濃度未減緩酶解反應(yīng)的速度，此時(shí)產(chǎn)物DPP-IV抑制率最高，為68.09%。以葡萄糖消耗量評(píng)分和DPP-IV抑制率的和綜合評(píng)分，如圖5C所示，料液比為1:3（w:w）時(shí)的綜合評(píng)分最高，為77.12%。料液比為1:1和1:2（w:w）時(shí)的綜合評(píng)分分別為76.52%和76.29%，與料液比為1:3（w:w）的綜合評(píng)分相近，但考慮到料液比為1:1和1:2（w:w）時(shí)的酶解液較粘稠，離心后上清較少，樣品得率較低，仍選擇料液比為1:3（w:w）進(jìn)行酶解。

圖5 料液比對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio on enzymolysis

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

酸性蛋白酶酶解馬氏珍珠貝軟體的正交試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。由直觀分析結(jié)果可以看出，對(duì)DPPIV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量綜合評(píng)分影響的大小順序?yàn)锳（酶解溫度）＞C（加酶量）＞B（時(shí)間）＞D（料液比）。酸性蛋白酶酶解馬氏珍珠貝軟體的最佳工藝參數(shù)為：A1B2C2D3，即酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間3 h、加酶量1000 U/g、料液比1:3.5。方差分析顯示，酶解溫度、酶解時(shí)間和加酶量對(duì)DPPIV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量綜合評(píng)分有顯著影響。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experiments

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal array experimental results

2.4 最優(yōu)組合條件驗(yàn)證

取馬氏珍珠貝軟體20 g，按料液比1:3.5加入純水，勻漿后調(diào)節(jié)pH3.0，加酶量1000 U/g，于45 ℃酶解3 h后，沸水浴滅酶10 min，冷卻后5000 r/min離心20 min，取上清液，得馬氏珍珠貝軟體酶解液。將酶解液凍干，得馬氏珍珠貝軟體酶解液凍干粉。重復(fù)驗(yàn)證三次，測(cè)得馬氏珍珠貝軟體酶解液的DPP-IV抑制率和HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗量綜合評(píng)分分別為97.12%、97.66%、94.16%，RSD為1.96%，在此條件下的葡萄糖消耗量為37.53%、DPP-IV抑制率為74.21%，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.5 馬氏珍珠貝軟體酶解樣品不同極性部位DPPIV抑制活性測(cè)定

馬氏珍珠貝軟體酶解樣品不同極性部位的DPP-IV抑制活性評(píng)價(jià)結(jié)果如圖6所示，在終濃度為1.25 mg/mL的情況下，15%乙腈洗脫部位具有最佳的DPP-IV抑制活性，抑制率為52.39%±2.61%。故對(duì)15%乙腈洗脫部位進(jìn)行成分分析鑒定。

圖6 不同濃度乙腈洗脫樣品DPP-IV抑制率Fig.6 Inhibition rate of DPP-IV in samples eluted with acetonitrile at different concentrations

2.6 馬氏珍珠貝軟體酶解肽15%乙腈洗脫部位nano-LC-MS/MS數(shù)據(jù)分析

從馬氏珍珠貝軟體酶解肽15%已經(jīng)洗脫部位中共鑒定了327個(gè)肽段，這些肽段主要來源于肌動(dòng)蛋白、微管蛋白和組蛋白。已知質(zhì)譜數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)越吻合得分越高，本文列出得分較高的前20條肽段信息，如表5所示。

表5 得分最高的前20種多肽Table 5 Top 20 peptides with the highest score

以肽段YASGRTTGIVLDSGDGVTH為例，說明肽段的鑒定過程：該肽段[M+H]2+m/z 1906.923，MS/MS（圖7）顯示其主要碎片離子有b9+（900.41）、b10+（1006.53）、b11+（1119.61）、b12+（1237.64）、b15+（1493.72）、b16+（1553.75）、b17+（1651.80）、b18+（1742.87）；y1+（155.08）、y2+（257.12）、y4+（408.16）、y7+（672.29）、y8+（787.32），經(jīng)搜庫確定該肽段來自肌動(dòng)蛋白，具體位置見如下。質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫結(jié)果吻合，確定肽段的序列為YASGRTTGI VLDSGDGVTH，源于肌動(dòng)蛋白序列的144至162位。

圖7 YASGRTTGIVLDSGDGVTH的MS/MS Fig.7 MS/MS of YASGRTTGIVLDSGDGVTH

本次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了327個(gè)肽段中每種氨基酸出現(xiàn)的頻次，如圖8A，其中親水性氨基酸2219個(gè)，疏水性氨基酸1875個(gè)；數(shù)量最多的前5種氨基酸分別是：疏水性氨基酸甘氨酸（Gly，G，452個(gè)）、丙氨酸（Ala，A，333個(gè)）和親水性氨基酸絲氨酸（Ser，S，361個(gè)）、蘇氨酸（Thr，T，340個(gè)）、谷氨酸（Glu，E，327個(gè)），親水性氨基酸與疏水性氨基酸數(shù)量比例為1.18:1。如圖8B，通過計(jì)算親水平均值來評(píng)估肽段的親水性和疏水性，GRAVY值小于0則具有親水性，結(jié)果顯示77.37%為親水性多肽，26.61%的肽段N-末端側(cè)的兩個(gè)氨基酸為疏水氨基酸，74.92%的肽段N-末端側(cè)的兩個(gè)氨基酸中至少含有一個(gè)疏水氨基酸。已有研究表明，疏水氨基酸的存在能增強(qiáng)與DPP-IV活性位點(diǎn)的相互作用，DPP-IV S1亞位點(diǎn)的疏水口袋在DPP-IV抑制中起著非常重要的作用，且位于N端側(cè)兩個(gè)氨基酸的疏水性與肽的DPP-IV效力呈正相關(guān)[30]。如圖8C，對(duì)多肽分子量分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示多肽分子量（MW）主要分布在711.30至2602.12 Da之間，其中93.88%的肽段分子量低于2000 Da。Puneet Tyagi[31]研究顯示，肽段的效價(jià)、口服利用度與分子量呈反比趨勢(shì)，這表明馬氏珍珠貝軟體酶解肽具有成為口服藥物穿過膜屏障發(fā)揮生物效應(yīng)的潛能。

圖8 肽段分析Fig.8 Peptide analysis

3 結(jié)論

本文以馬氏珍珠貝軟體為研究對(duì)象，以DPPIV抑制率和葡萄糖消耗量為指標(biāo)優(yōu)化確定了馬氏珍珠貝軟體的酶解工藝，即以酸性蛋白酶酶解，在45 ℃，酶解時(shí)間3 h，料液比1:3.5（w:w），加酶量1000 U/g的條件下，制備得到的酶解液的DPP-IV抑制率和葡萄糖消耗量綜合評(píng)分最高，DPP-IV抑制率為74.21%，HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗量為37.53%。經(jīng)過Nano LC-MS/MS鑒定發(fā)現(xiàn)馬氏珍珠貝軟體酶解肽15%乙腈洗脫部位中，22.63%的肽段為疏水性肽段，74.92%的肽段N端至少有含有一個(gè)疏水性氨基酸，93.88%的肽段分子量低于2000 Da。本實(shí)驗(yàn)研究表明馬氏珍珠貝軟體酶解肽有作為健康食品和功能食品生物活性原料的潛能，這在很大程度上解決了馬氏珍珠貝綜合利用程度低的問題。將馬氏珍珠貝剝?nèi)≌渲楹蟊粡U棄的軟體資源加以開發(fā)利用，形成具有潛在降糖作用的酶解物，對(duì)促進(jìn)馬氏珍珠貝的綜合利用、開發(fā)健康產(chǎn)品具有較好的指導(dǎo)意義。