李英迪，曹 艷，夏其樂, ，楊 開，毛榮良

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310021；2.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江杭州 310014；3.常山縣豪鋒農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江常山 324207）

猴頭菇，又名猴頭菌、刺猬菌等，屬擔(dān)子菌門、齒菌科、猴頭屬，是藥食兩用真菌和野生美味佳肴，是中國著名的四道菜之一[1-2]。猴頭菇中含多糖類、甾醇類、萜類、酚類等活性成分，具有抗氧化、降血脂、增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗腫瘤、延緩衰老等功效[3-5]。石鳳敏等[6]指出可以通過多糖和三萜類化合物的含量評(píng)價(jià)靈芝藥用價(jià)值和品質(zhì)。萜類化合物是由甲戊二羥酸衍生而成的天然產(chǎn)物，由多個(gè)異戊二烯結(jié)構(gòu)單位構(gòu)成，其中三萜類固醇和皂苷在細(xì)胞質(zhì)中利用甲羥戊酸途徑中的IPP合成[7-8]，是一類重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，除了具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖等功能外，還具有其他活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、神經(jīng)保護(hù)等生物學(xué)和藥理學(xué)作用，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[7,9]。Bourgou等[10]從精油中分離出四種萜類化合物，通過氧自由基吸收能力評(píng)估萜類化合物的生物活性，發(fā)現(xiàn)其在體外均表現(xiàn)出抗氧化活性。凡蕓等[11]以杏鮑菇為原料，采用超聲輔助法提取三萜化合物，最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1:30 g·mL-1、超聲時(shí)間25 min、提取溫度60 ℃，在此條件下，杏鮑菇中總?cè)苹衔锏奶崛÷蔬_(dá)到1.140%。鄧春萌等[12]研究牛樟芝固態(tài)發(fā)酵菌絲體中三萜的最佳提取工藝條件為：浸提時(shí)間3 h、料液比1:30（g·mL-1）、溫度70 ℃，在此條件下，得率為3.43%。楊開等[13]對(duì)牛樟芝總?cè)瞥曒o助提取的最佳工藝條件為：提取時(shí)間41 min、提取功率80 W、料液比1:20，總?cè)频寐蕿?.84%±0.18%。牛樟芝三萜提取物具有較強(qiáng)的還原能力，并能有效清除DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基，其半清除濃度（EC50）分別為0.29、0.50、0.33 mg·mL-1。鄒思等[14]采用回流提取法提取虎奶菇菌核總?cè)谱罴压に噮?shù)為:乙醇濃度95%、提取時(shí)間2 h、提取溫度90 ℃、料液比1:15（ g·mL-1），提取率為（2.29±0.06）mg·g-1。菌核醇提物對(duì)羥自由基、DPPH自由基清除活性和ABTS自由基的清除能力半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為（0.425±0.01）、（3.25±0.05）和（18.35±2.32）mg·mL-1，其表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基和良好的DPPH自由基清除活性，對(duì)ABTS自由基的清除能力相對(duì)較弱。萜類化合物具有非常好的應(yīng)用前景，目前還沒有關(guān)于猴頭菇三萜類的研究。

本文以猴頭菇為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇三萜提取工藝，以三萜得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),并初步探索猴頭菇三萜的體外抗氧化活性，以期為開發(fā)天然抗氧化劑和功能性食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇 常山縣豪鋒農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供干制品；1, 1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、2, 2'-氨基-雙（3-乙基苯并噻唑膠-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、鐵氰化鉀 均購自上海源葉；乙醇、香草醛、冰乙酸、三氯乙酸、三氯化鐵、高氯酸 均為分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

UV-1800紫外/可見分光光度儀 日本島津公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；R1002B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LXJ-HB飛鴿低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BJ-300多功能粉碎機(jī) 德清拜杰電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將猴頭菇干制品粉碎機(jī)粉碎，過100目篩，密封后置于4 ℃冷藏，備用。

1.2.2 三萜提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。稱取一定量的猴頭菇干粉，按照不同料液比（1:10、1:20、1:30 g·mL-1）和乙醇濃度（40%、60%、80%）進(jìn)行超聲輔助（40、60、80 ℃）提取30 min（保鮮膜覆蓋，防止揮發(fā)）。所得提取液4000 r·min-1離心10 min，收集上清液，即猴頭菇三萜提取液。將所得上清液旋蒸濃縮，冷凍干燥得提取物粉末。

采用Design Expert 10.0.3軟件進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)確定超聲輔助（功率500 W，頻率40 kHz，30 min）提取猴頭菇三萜的最佳工藝參數(shù)，中心組合試驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 猴頭菇三萜提取試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of extraction experiment triterpenoids from Hericium erinaceus

1.2.3 猴頭菇三萜含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照王豪等[15]方法，三萜測(cè)定以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，依次吸取0.2 mg·mL-1齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于25 mL比色管中，氮吹儀吹干溶劑，加入0.5 mL 50 g·L-1的香草醛-冰乙酸和1.0 mL高氯酸，混合后60 ℃水浴20 min，冰水冷卻15 min后加入3.0 mL冰乙酸，室溫反應(yīng)10 min，最后于547 nm處測(cè)吸光值，以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度W（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制三萜含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得線性回歸方程。

1.2.3.2 三萜得率的計(jì)算 取150 μL提取液，用氮吹儀吹干樣品，按1.2.3.1標(biāo)曲操作測(cè)定樣品濃度。根據(jù)標(biāo)曲方程計(jì)算樣品三萜含量。三萜得率可根據(jù)公式計(jì)算：

式中：M表示猴頭菇三萜得率（%）；C表示齊墩果酸濃度（mg·mL-1）；V表示提取液的總體積（mL）；N表示稀釋倍數(shù)；m表示猴頭菇質(zhì)量（g）。

1.2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn) 抗氧化實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)，用60%乙醇將猴頭菇三萜提取物配制成0.1～2.5 mg·mL-1濃度的樣品待測(cè)液。

1.2.4.1 DPPH·清除能力測(cè)定 將猴頭菇三萜提取液旋蒸濃縮并冷凍干燥成粉末，加60%乙醇配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1濃度的樣品待測(cè)液。參照杜麗娟等[16]方法，并據(jù)實(shí)驗(yàn)情況稍作修改。取各濃度樣品溶液0.8 mL，加入3.8 mL濃度為0.1 mmol·L-1的DPPH 溶液（無水乙醇配制），搖勻后黑暗放置30 min，并于517 nm處測(cè)吸光值。VC為陽性對(duì)照，計(jì)算DPPH·清除率公式如下：

式中：Ax為不同濃度樣品溶液的吸光值；Ax0為0.8 mL不同濃度樣品溶液和3.2 mL無水乙醇的吸光值；A0為0.8 mL蒸餾水和3.2 mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.4.2 還原力測(cè)定 將猴頭菇三萜提取液旋蒸濃縮并冷凍干燥成粉末，加60%乙醇配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1濃度的樣品待測(cè)液。參照林源等[17]方法，并據(jù)實(shí)驗(yàn)情況稍作修改。取各濃度樣品溶液2.0 mL，加入2.0 mL濃度為0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合均勻后于50 ℃水浴20 min，再加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液后離心（3000 r·min-1，5 min），取2.0 mL上清液，加入2.0 mL蒸餾水、0.4 mL 0.1%FeCl3溶液混勻，50 ℃水浴10 min后在700 nm處測(cè)吸光值。蒸餾水代替樣品溶液作為空白對(duì)照，VC為陽性對(duì)照。

1.2.4.3 ABTS+·清除能力測(cè)定 將猴頭菇三萜提取液旋蒸濃縮并冷凍干燥成粉末，加60%乙醇配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1濃度的樣品待測(cè)液。參照吳美媛等[1]方法，并據(jù)實(shí)驗(yàn)情況稍作修改。將7 mmol·L-1ABTS+·溶液與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀溶液等量混合反應(yīng)，室溫避光放置12～16 h得到ABTS+·儲(chǔ)備液。在734 nm波長(zhǎng)處，用磷酸鹽緩沖液（10 mmol·L-1，pH7.4）將ABTS+·儲(chǔ)備液稀釋至吸光值達(dá)到0.70±0.02，得到ABTS+·測(cè)定液。取各濃度樣品溶液1.0 mL與2.0 mL上述ABTS+·測(cè)定液混合均勻，室溫避光反應(yīng)6 min后于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。VC為陽性對(duì)照，計(jì)算ABTS+·清除率公式如下：

式中：Ai為不同濃度樣品溶液的吸光值；Aj為不同濃度樣品溶液和磷酸鹽緩沖液的吸光值；A0為蒸餾水和ABTS+·測(cè)定液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

平行實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，數(shù)據(jù)采用SAS 8.1進(jìn)行顯著性分析，使用Microsoft Excel繪圖，Design Expert 10.0.3軟件得到響應(yīng)面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)1.2.3.1標(biāo)曲測(cè)定方法，分別以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，547 nm處吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：y=0.0349x+0.0018，R2=0.9907。結(jié)果表明三萜含量在0～25 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

乙醇濃度、溫度和料液比對(duì)三萜提取均有影響，為探究各因素之間的相互作用，確定最優(yōu)條件，由Box-Behnken法設(shè)計(jì)試驗(yàn)[18]，有5個(gè)試驗(yàn)中心點(diǎn)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，以三萜得率為響應(yīng)值，響應(yīng)面法對(duì)猴頭菇三萜類化合物提取工藝優(yōu)化的試驗(yàn)方案及真實(shí)值如表2所示。與傳統(tǒng)的多因素單變量?jī)?yōu)化實(shí)驗(yàn)相比，響應(yīng)曲面法可以研究各因素之間的相互作用，具有試驗(yàn)次數(shù)少、省時(shí)省力、精確等優(yōu)點(diǎn)[19]。

對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到三萜得率的二次多項(xiàng)回歸模型為：

表2 猴頭菇三萜類化合物提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of triterpenoid extracts from Hericium erinaceus

其中，Y代表三萜得率的預(yù)測(cè)響應(yīng)值，X1代表乙醇濃度（%）的編碼值，X2代表溫度（℃）的編碼值，X3代表料液比（g/mL）的編碼值。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析結(jié)果見表3，回歸模型具有較高的F值（150.87）和極低的P值（＜0.0001），表明該模型是高度顯著的。復(fù)決定系數(shù)R2=0.9949，表明料液比、乙醇濃度和提取溫度存在良好線性關(guān)系，模型誤差小、擬合度較高。決定系數(shù)R2Adj為0.9883，說明該模型可信度較高，能夠解釋98.83%的響應(yīng)值變化。信噪比Adeq Precision為38.837＞4，表明方程的擬合度和可信度極高，可用此模型對(duì)猴頭菇三萜類化合物提取的影響因素進(jìn)行可靠分析和預(yù)測(cè)。由表3各因素F值可知，各個(gè)因素對(duì)三萜類化合得率的影響程度為乙醇濃度（X1）＞溫度（X2）＞料液比（X3）。

表3 三萜類化合物回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model of triterpenes

2.3 三萜提取工藝的響應(yīng)曲面分析、最佳工藝參數(shù)確定

Design Expert 10.0.3軟件得到響應(yīng)面圖（圖2～圖4）顯示了不同試驗(yàn)因素（乙醇濃度、溫度以及料液比）對(duì)猴頭菇三萜類化合物提取的影響。由圖2～圖4可以看出各因素及其相互作用的影響，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)最高點(diǎn)，即為三萜得率較高點(diǎn)，響應(yīng)面圖所示最大響應(yīng)值與回歸方程所得結(jié)果一致。黑育榮等[20]對(duì)樺菌芝三萜最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度70%，超聲溫度70 ℃，時(shí)間15 min，料液比1:15，提取率為3.87 mg·g-1。溫慧萍等[21]對(duì)靈芝孢子粉三萜最佳提取條件:乙醇濃度80%，固液比1:23，超聲功率540 W，提取溫度40 ℃，提取時(shí)間15 min，提取率7.054 mg·g-1。由于原材料不同，最優(yōu)提取條件下的得率也會(huì)有所差別。由Design Expert 10.0.3軟件分析結(jié)果可知，猴頭菇三萜類化合物超聲波輔助提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度58.57%，溫度57.25 ℃，料液比1:14.61（g:mL）。工藝參數(shù)預(yù)測(cè)的三萜得率為0.28%。為了操作方便，將最佳工藝參數(shù)設(shè)定為乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1:15（g:mL）。為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法可靠性，采用上述最優(yōu)條件3次重復(fù)試驗(yàn)得率為0.28%，與預(yù)測(cè)值較為接近，表明該模型對(duì)猴頭菇三萜類化合物的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖2 提取溫度與料液比對(duì)猴頭菇三萜得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface graph and contour plot of the effect of extraction temperature and material-liquid ratio on the yield of Hericium erinaceus triterpenes

圖3 乙醇濃度與料液比對(duì)猴頭菇三萜得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.3 Response surface graph and contour plot of the effect of ethanol concentration and material-liquid ratio on the yield of Hericium erinaceus triterpenes

圖4 乙醇濃度與提取溫度對(duì)猴頭菇三萜得率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.4 Response surface graph and contour plots of the effect of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of Hericium erinaceus triterpenes

2.4 猴頭菇三萜抗氧化活性

2.4.1 DPPH·清除能力 如圖5所示，當(dāng)提取物濃度在0.5～2.5 mg·mL-1范圍時(shí)，隨著提取物濃度的增加對(duì)DPPH·清除率逐漸增加，提取物濃度與DPPH·清除率呈正相關(guān)量效關(guān)系。在質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·清除率為25.4%，清除率相對(duì)較低。帥良等[22]研究百香果果皮多糖對(duì)DPPH·清除能力時(shí)，也發(fā)現(xiàn)其清除率相對(duì)較低，質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，清除率為32.8%。而VC質(zhì)量濃度在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)增加顯著，超過0.03 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·清除率趨于平緩，0.05 mg·mL-1時(shí)達(dá)到95.2%。由圖5可知，猴頭菇三萜對(duì)DPPH·具有一定的清除能力，其中，IC50值（6.375±0.020） mg·mL-1明顯高于VC的IC50值（0.0194±0.0060） mg·mL-1，說明猴頭菇三萜抗氧化能力相比VC較弱，這與張意笠等[23]研究結(jié)香花總黃酮對(duì)DPPH·清除率弱于VC的結(jié)果一致。

圖5 猴頭菇三萜對(duì)DPPH·清除率Fig.5 DPPH· scavenging rate of Hericium erinaceus triterpenes

2.4.2 還原能力 樣品的抗氧化能力與還原性有關(guān)，還原力越強(qiáng)，抗氧化能力越強(qiáng)。由圖6可知，樣品濃度為0.5～2.5 mg·mL-1時(shí)，提取物還原能力隨樣品濃度的增加呈明顯的量效關(guān)系，測(cè)得700 nm處的吸光值由0.107增加到0.553。其中，2.5 mg·mL-1提取物還原力與0.05 mg·mL-1的VC相當(dāng)，雖然提取物還原力較VC弱，但也表現(xiàn)出一定的還原能力。

圖6 猴頭菇三萜還原能力Fig.6 Reducing power of Hericium erinaceus triterpenes

2.4.3 ABTS+·清除能力 如圖7所示，當(dāng)提取物濃度在0.1～0.5 mg·mL-1范圍時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率隨著提取物濃度的增加而增加，具有良好的線性關(guān)系和劑量關(guān)系。當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg·mL-1時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率達(dá)到64.4%，其IC50值為（0.355±0.040）mg·mL-1，表明猴頭菇三萜對(duì)ABTS+·具有良好的清除作用。結(jié)合參考文獻(xiàn)[24]及前期實(shí)驗(yàn)濃度VC濃度在0.01～0.05 mg·mL-1范圍時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率穩(wěn)定在97%左右，由此可見，猴頭菇三萜與VC相比對(duì)ABTS+·清除能力較弱。分 的 分 離 與 鑒 定[J]. 食 品 工 業(yè) 科 技，2019，40（21）：32-37.［ZHOU C H, HUANG Y, LIU T T, et al. Isolation and identification of the components of the fractions in ethyl acetate phase from ethanol extract ofHericium erinaceus[J]. Food Industry Technology，2019，40（21）：32-37.］

圖7 猴頭菇三萜對(duì)ABTS+·清除率Fig.7 ABTS+· scavenging rate of Hericium erinaceus triterpenes

3 結(jié)論

本研究通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化猴頭菇三萜提取的影響因素乙醇濃度、提取溫度、料液比，最終確定最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1:15（g:mL），三萜得率相對(duì)較高，為0.28%，與預(yù)測(cè)值接近，說明響應(yīng)曲面法準(zhǔn)確可靠，能合理優(yōu)化猴頭菇三萜的提取工藝，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論參考。以DPPH·自由基清除率、還原力、ABTS+·自由基清除率為指標(biāo)測(cè)定抗氧化活性，DPPH和ABTS+的IC50值分別為（6.375±0.020）和（0.355±0.040） mg·mL-1，說明猴頭菇三萜具有一定的抗氧化性。