魏 雪，江孟遙，鐘 濤，張 曼，王智榮，ZSOLT Zalan，F(xiàn)ERENC Hegyi，

KRISZTINA Takacs3，杜木英1,2,4, *

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.中匈食品科學(xué)聯(lián)合研究中心，重慶 400715；3.匈牙利國家農(nóng)業(yè)創(chuàng)新研究中心，匈牙利布達(dá)佩斯 1022；4.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

葡萄（Vitis viniferaL.）為葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物，是世界各國廣泛種植的水果，不僅味美可口，而且營養(yǎng)價(jià)值高[1]。從2011年起，我國鮮食葡萄產(chǎn)量已穩(wěn)居世界首位，到2019我國的鮮食葡萄產(chǎn)量達(dá)到1419.5萬噸，是最大的葡萄生產(chǎn)國[2-3]。但葡萄組織水分含量高、果肉嬌嫩，采后生理代謝旺盛，因此果實(shí)在運(yùn)輸和貯藏過程中極易遭受病原真菌的侵染而發(fā)生腐爛變質(zhì)。由Botrytis cinerea引起的灰霉?。℅ray mold）是全球各種果蔬中最常見和普遍發(fā)生的病害，也是造成葡萄采后腐爛損失的主要原因。葡萄果實(shí)的貯藏條件相對(duì)濕度較大、溫度適宜，容易大面積發(fā)病，導(dǎo)致每年葡萄采后的損失率高達(dá)50%[4]。使用二氧化硫、硫化物等化學(xué)保鮮劑和吡咯類、咪唑類、甲氧基丙烯酸酯類化學(xué)殺菌劑都是生產(chǎn)上常用的防治葡萄采后灰霉病的有效方法，但使用過程中造成的病原菌抗藥性增加、化學(xué)藥物殘留、環(huán)境污染等問題日益突出[5-7]。隨著近年來消費(fèi)者對(duì)食品安全性的關(guān)注，使用安全無毒具有拮抗作用的微生物對(duì)采后果蔬進(jìn)行生物防治已經(jīng)成為果蔬防腐保鮮技術(shù)發(fā)展的新方向。

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），廣泛分布于植物根際土壤和果蔬表面，是近幾十年來最具應(yīng)用價(jià)值的一類植物病害生防菌和根際促生菌，對(duì)病原菌具有良好的防治效果。有研究顯示P. fluorescens能有效控制蘋果、番茄和草莓果實(shí)采后青霉病、酸腐病和灰霉病發(fā)病率[8-10]，對(duì)病原菌生長繁殖有顯著抑制效果。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，P. fluorescensZX能顯著抑制指狀青霉（Penicillium digitatum）的生長，有效降低采后柑橘的發(fā)病率[11-12]，但現(xiàn)階段有關(guān)P. fluorescensZX處理抑制B. cinerea的研究較少，生防菌的拮抗機(jī)理尚不明確，我們研究了P. fluorescensZX對(duì)葡萄灰霉病的防治效果，為P. fluorescensZX的深入研究提供一定的理論基礎(chǔ)。在擴(kuò)展微生物源殺菌劑途徑、減少葡萄采后損失、提高葡萄食用安全性等方面也具有積極意義[13]。因此，本研究以“巨峰”葡萄為試材，主要研究了不同處理模式下P. fluorescensZX對(duì)葡萄果實(shí)灰霉病的控制效果，著重分析了P.fluorescens對(duì)B. cinerea可能存在的作用模式，初步探討P. fluorescensZX控制B. cinerea發(fā)病的機(jī)制，旨在為進(jìn)一步開發(fā)果蔬采后保鮮方案提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“巨峰”葡萄（Vitis viniferaL.×V. labruscaL.‘Kyoho’） 采于重慶市北碚區(qū)金刀峽鎮(zhèn)詩進(jìn)葡萄種植股份合作社，商業(yè)成熟的葡萄，采摘后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，過程中注意盡量不要碰撞和損傷果實(shí)。拮抗菌 匈牙利Dr. Zsolt Zalán研究員惠贈(zèng)；B. cinerea病原菌 由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院惠贈(zèng)；葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉 成都市科龍化工試劑廠；瓊脂粉、牛肉浸粉、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、果糖標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；乙腈 色譜純，美國Spectrum公司；抑霉唑水乳劑 一帆生物科技集團(tuán)有限公司；馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g 蒸餾水1000 mL；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15～20 g；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：配方同NA，但不加瓊脂；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：制作方法同馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基但不加入瓊脂。

BSA224S電子天平 塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；LRHS-150-Ⅱ型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；WZT-1M型細(xì)菌濁度儀 上海勁佳科學(xué)儀器有限公司；QP201010500型GCMS氣質(zhì)聯(lián)用儀 日本島津公司；Phenom Pro10102型掃描電鏡 Phenom World公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理 將采摘回來的葡萄沿果穗逐粒剪下，留3～5 mm果梗，選擇飽滿圓潤、無病蟲害、無受傷、無干枯、成熟度和大小一致的健康果實(shí)，靜置2 h，除去田間熱后用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒，室溫晾干。

拮抗菌活化后，參照J(rèn)iang等[11]的方法制備拮抗菌原液、濾液、熱殺死液和菌懸液。拮抗菌原液：移取拮抗菌培養(yǎng)液，用濁度儀測(cè)定菌液濁度，調(diào)節(jié)濃度至0.33 MCF（約為1×108CFU/mL）；濾液：將培養(yǎng)液6000 r/min離心10 min，取上清液用無菌注射器經(jīng)0.22 μm聚碳酸酯膜過濾得到；熱殺死液：原液在121 ℃下高壓滅菌20 min。菌懸液：將拮抗菌培養(yǎng)液6000 r/min離心10 min，倒去上清，收集菌體，用無菌水（sterile distilled water，SDW）洗滌菌體兩次，最后加入SDW，調(diào)節(jié)至所需濃度。

病原菌的前處理方法，參照王智榮等[12]的方法制備病原菌孢子懸浮液，用接種環(huán)將培養(yǎng)基上的病原菌刮下，接入0.05%吐溫80無菌水中，渦旋均勻，用無菌紗布過濾，再次渦旋，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并稀釋至所需濃度。

1.2.2 不同P. fluorescensZX處理液對(duì)葡萄灰霉病的防治效果 將預(yù)處理的葡萄赤道周圍各刺一個(gè)3 mm（寬）×3 mm（深）的孔，隨機(jī)分成3組，先分別接種10 μL 0.5 MCF拮抗菌培養(yǎng)原液、濾液、熱殺死液和菌懸液，自然風(fēng)干2 h后接種10 μL病原菌孢子懸浮液（1×105spores/mL），以SDW和農(nóng)藥抑霉唑（1000倍稀釋液，商業(yè)建議用量）處理作對(duì)照，自然晾干后將果實(shí)放入周轉(zhuǎn)箱中，用保鮮膜進(jìn)行密封，以保持90%的相對(duì)濕度，置于20 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組處理30個(gè)果實(shí)，3次重復(fù)。當(dāng)葡萄果實(shí)表面灰霉病病斑直徑大于1.5 mm時(shí)，記為發(fā)病。培養(yǎng)1、3、5 d后測(cè)定果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。

1.2.3 不同接種時(shí)間對(duì)P. fluorescensZX防治葡萄灰霉病效果的影響 水果打孔后，在接種病原菌孢子懸浮液之前的24、12、6、0 h和接種之后的6、12、24 h接種相同體積麥?zhǔn)蠞岫葹?.50 MCF的P.fluorescensZX菌懸液，自然晾干后將果實(shí)放入周轉(zhuǎn)箱中，用保鮮膜進(jìn)行密封，20 ℃、90%相對(duì)濕度恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，測(cè)定果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑。

1.2.4P. fluorescensZX的生長動(dòng)態(tài)

1.2.4.1P. fluorescensZX在葡萄果實(shí)傷口處的生長動(dòng)態(tài) 參照嚴(yán)圓[14]的方法，稍作修改。在葡萄赤道周圍打兩個(gè)孔徑一致的傷口，后接種10 μL 0.5 MCF拮抗菌菌懸液，2 h后，再接種相同體積的病原菌孢子懸浮液（1×105spores/mL），以SDW作對(duì)照，逐果袋封。分別貯藏于4 ℃和20 ℃、90%相對(duì)濕度環(huán)境下，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)定傷口表面的拮抗菌數(shù)。20 ℃條件下的葡萄果實(shí)共測(cè)定8 d，每2 d 測(cè)定一次，4 ℃條件下的葡萄果實(shí)共測(cè)定16 d，每4 d測(cè)定一次。結(jié)果以log10CFU/傷口表示。

1.2.4.2P. fluorescensZX在葡萄果實(shí)表面的生長動(dòng)態(tài) 參照王智榮[15]的方法，分別用無菌水和麥?zhǔn)蠞岫葹?.5 MCF的P. fluorescensZX菌懸液浸漬完整無損的果實(shí)2 min，自然晾干后，再用1×105spores/mL病原菌孢子懸浮液浸泡2 min，逐果袋封。分別貯藏于4 ℃和20 ℃、90%相對(duì)濕度環(huán)境下，測(cè)定方法同上。計(jì)數(shù)結(jié)果以log10CFU/circle 表示，其中circle表示果實(shí)經(jīng)浸泡處理后表面的拮抗菌數(shù)。

1.2.5P. fluorescensZX各種處理液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響 參照J(rèn)iang等[11]的方法，在裝有14 mL PDB的試管中，加入4 mL的病原菌孢子懸浮液（1×105spores/mL）、2 mL拮抗菌各種處理液和14 mL SDW，28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔4 h觀察一次孢子萌發(fā)情況。當(dāng)芽管長度大于等于孢子直徑時(shí)，認(rèn)為孢子萌發(fā)，即可計(jì)算病原菌孢子萌發(fā)率以及芽管長度。

1.2.6P. fluorescensZX揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物（Volatile organic compounds，VOCs）的抑菌作用分析

1.2.6.1 平板抑菌試驗(yàn) 參照王智榮等[16]的方法，分別移取0.1 mL濃度為0.25、0.50、0.75、1.0 MCF的拮抗菌菌懸液和0.1 mL原液、熱殺死液、濾液于NA平板上均勻涂布，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d；另取PDA平板，中央放入病原菌絲塊（D=6 mm），兩板對(duì)扣密封，室溫培養(yǎng)7 d后，測(cè)定病原菌菌落直徑。以SDW涂布的平板作對(duì)照。

均采用十字交叉法測(cè)定病斑直徑，按下式計(jì)算相對(duì)抑菌率：

1.2.6.2P. fluorescensZX揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的GC-MS分析 王智榮等[15]報(bào)道P. fluorescensZX抑制病原微生物生長繁殖有多種方式，其抑菌途徑主要是通過營養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)，P. fluorescensZX產(chǎn)生的VOCs能明顯減緩采后錦橙的病害進(jìn)程，具有較強(qiáng)的抑菌作用。因此本實(shí)驗(yàn)考慮直接探究P. fluorescensZX中的揮發(fā)性物質(zhì)。參照Stanborough等[17]的方法并作適當(dāng)修改。將0.2 g/mL滅菌的NA培養(yǎng)基用100 mL無菌注射器等分至經(jīng)紫外滅菌的15 mL玻璃頂空瓶中。按1%的接種量培養(yǎng)P. fluorescensZX，28 ℃，150 r/min振搖培養(yǎng)12 h，制備菌懸液，調(diào)節(jié)濃度至0.5 MCF。將100 μL 0.5 MCF的菌懸液無菌加入至裝有0.2 g/mL培養(yǎng)基的玻璃頂空瓶中，對(duì)照組接種等體積的無菌水。振搖培養(yǎng)24 h后進(jìn)行測(cè)定。40 ℃預(yù)熱35 min，然后插入100 μm PDMS萃取頭，頂空取樣40 min，用GC-MS進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分分析。

色譜條件：DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度280 ℃。升溫程序?yàn)椋浩鹗汲鯗?5 ℃，保持5 min，以10 ℃/min的升溫速度升至280 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件為：接口溫度280 ℃，離子源溫度280 ℃，電子能量70 eV，時(shí)間間隔0.5 s。

1.2.7 掃描電鏡觀察P. fluorescensZX與B. cinerea離體條件下的相互作用 移取0.1 mL濃度為0.5 MCF的P. fluorescensZX菌懸液于1/2 NA+1/2 PDA（添加5%新鮮葡萄汁）平板上均勻涂布，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d后于平板中央放入經(jīng)7 d培養(yǎng)的B. cinerea菌絲塊（D=6 mm），室溫培養(yǎng)5 d，參照Wallace等[18]的方法稍作修改，用無菌打孔器取下病斑，無菌牙簽挑取菌絲于載玻片，乳酸酚棉藍(lán)染色，掃描電鏡下觀察拍照。以SDW涂布的平板作為對(duì)照。

1.2.8 掃描電鏡觀察P. fluorescensZX與B. cinerea活體條件下的相互作用 用無菌接種針在葡萄赤道周圍打兩個(gè)直徑為3 mm（寬）×3 mm（深）的傷口。然后接種10 μL 0.5 MCFP. fluorescensZX菌懸液，2 h后再接種10 μL病原菌孢子懸浮液（1×105spores/mL），72 h以后，將傷口組織削下用2.5%的戊二醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，用Tukey多重比較方法進(jìn)行差異顯著性分析，Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. fluorescens ZX 對(duì)葡萄采后灰霉病的防治效果

從圖1可以看出，貯藏5 d 后P. fluorescensZX處理有效減緩了采后葡萄灰霉病的發(fā)病率和病斑直徑，但是對(duì)B. cinerea的防控效果明顯弱于農(nóng)藥抑霉唑，當(dāng)對(duì)照組葡萄果實(shí)發(fā)病率高達(dá)64.67%時(shí)，P.fluorescensZX處理僅為24.8%。根據(jù)病斑直徑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，抑霉唑處理和P. fluorescensZX處理沒有顯著性差異，P. fluorescensZX處理與對(duì)照組相比具有顯著性差異。

圖1 熒光假單胞菌ZX對(duì)葡萄采后灰霉病的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of P. fluorescens ZX on gray mold of grape berries

2.2 不同P. fluorescens ZX處理液對(duì)葡萄灰霉病的防治效果

由圖2可知，P. fluorescensZX菌懸液對(duì)葡萄果實(shí)采后灰霉病的防治效果最好，20 ℃、90%相對(duì)濕度貯藏5 d后，菌懸液處理的葡萄果實(shí)的發(fā)病率最低，為42%，病斑直徑最小，為3.5 mm，都顯著低于（P＜0.05）對(duì)照組；熱殺死液、濾液、培養(yǎng)原液對(duì)葡萄采后灰霉病也有一定的抑制作用，但其抑菌效果不及同等濃度的菌懸液。濾液和熱殺死液缺乏活細(xì)胞，對(duì)葡萄灰霉病的防治效果不明顯，P. fluorescensZX培養(yǎng)原液的發(fā)病率與病斑直徑顯著低于濾液和熱殺死液，顯著高于菌懸液（P＜0.05）。與原液相比，菌懸液去除了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，防治效果卻更強(qiáng)，說明P. fluorescensZX的對(duì)葡萄灰霉病的抑菌途徑可能是通過營養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)。這些研究結(jié)果與王智榮[15]的研究結(jié)果一致。

圖2 P. fluorescens ZX各種處理液對(duì)葡萄灰霉病的防治效果Fig.2 Control effects of various treatment solutions of P.fluorescens ZX on gray mold of grape

2.3 不同接種時(shí)間對(duì)P. fluorescens ZX葡萄灰霉病的防治效果

由圖3可知，接種拮抗菌24 h后接種病原菌孢子懸浮液發(fā)病率最低，為18%，病斑直徑也最低，與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果顯示，拮抗菌P. fluorescensZX相對(duì)于B. cinerea孢子懸浮液的接種次序和間隔時(shí)間對(duì)P. fluorescensZX防治葡萄灰病的效果具有顯著影響（P＜0.05）。接種拮抗菌24 h后接種病原菌的防治效果更好。

圖3 接種時(shí)間對(duì)P. fluorescens ZX防治葡萄采后灰霉病效果的影響Fig.3 Effect of inoculation time on the effect of P. fluorescens ZX on post-harvest gray mold of grape

2.4 P. fluorescens ZX 在葡萄果實(shí)上的生長動(dòng)態(tài)

從圖4可以看出，不論是低溫冷藏還是室溫貯藏亦或是接種處理還是浸泡處理，P. fluorescensZX都能在果實(shí)上快速生長繁殖；與無菌水相比，B.cinerea對(duì)P. fluorescensZX的增長有一定的抑制作用。不論是處理后2 h還是4 ℃下培養(yǎng)16 d，浸泡P. fluorescensZX+無菌水葡萄果實(shí)表面處的拮抗菌數(shù)量都明顯高于浸泡P. fluorescensZX+灰霉孢子的拮抗菌數(shù)量；接種P. fluorescensZX+無菌水果實(shí)傷口處的拮抗菌數(shù)量明顯高于P. fluorescensZX+灰霉孢子的拮抗菌數(shù)量?？梢钥闯鲈谫A藏期間，果實(shí)傷口處的拮抗菌生長速度明顯高于果實(shí)表面，說明拮抗菌在果實(shí)傷口處更能搶占位置，消耗營養(yǎng)，從而抑制B.cinerea的生長。

圖4 20 ℃和4 ℃下P. fluorescens ZX在葡萄果實(shí)上的動(dòng)態(tài)生長Fig.4 Dynamic growth of P. fluorescens ZX at grape fruits in 20 ℃ and 4 ℃

2.5 P. fluorescens ZX不同處理液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)情況的影響

由表1可知，與P. fluorescensZX共培養(yǎng)時(shí)B.cinerea孢子萌發(fā)受到顯著抑制，原液和菌懸液的作用效力明顯高于熱殺死液和濾液。28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)16 h后，對(duì)照組的孢子懸浮液萌發(fā)率達(dá)到了79.46%，而菌懸液處理組的B. cinerea孢子僅為萌發(fā)率23.72%，B. cinerea孢子的芽管長度也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 P. fluorescens ZX不同處理液對(duì)B. cinerea孢子萌發(fā)情況的影響Table 1 The effects of various treatments of P. fluorescens ZX to conidial germination of B. cinerea

2.6 P. fluorescens ZX不同處理液對(duì)病原菌的抑制作用

由圖5可知，P. fluorescensZX各種處理液都對(duì)B. cinerea菌絲生長具有明顯影響，熱殺死液和濾液的抑菌效果相近，但其相對(duì)抑菌率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于菌懸液和原液；菌懸液和原液都具有較好的抑菌效果，0.5和0.75 MCF的P. fluorescensZX菌懸液對(duì)B.cinerea的相對(duì)抑菌率分別高達(dá)63.21%±1.50%和72.02%±0.53%。

圖5 P. fluorescens ZX不同處理液對(duì)B. cinerea的抑制作用Fig.5 Different treatment fluids of P. fluorescens ZX to B. cinerea

2.7 P. fluorescens ZX揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的GC-MS分析

從表2可以看出，P. fluorescensZX在葡萄汁培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)一定時(shí)間后，分別有21種物質(zhì)被檢測(cè)出，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的檢出物質(zhì)中主要是由醛、酸、醇、含硫化合物組成；葡萄汁培養(yǎng)基的檢出物質(zhì)中主要由酮、酸、醇組成。Hernández-León等[19]報(bào)道發(fā)現(xiàn)P. fluorescensUM16、UM240、UM256、UM270均能產(chǎn)生VOCs，其主要成分是小分子的乙醛、酮和醇等，而主要的抑菌成分可能是含硫化合物。菌株P(guān). fluorescensZX能在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中產(chǎn)生相當(dāng)比例的含硫化合物，對(duì)于是否含硫化合物主要是哪些含硫化合物起主要抑菌作用還需進(jìn)一步研究。

表2 P. fluorescens ZX產(chǎn)生的揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物分析結(jié)果Table 2 Analysis results of the VOCs produced by P. fluorescens ZX

2.8 P. fluorescens ZX對(duì)病原菌平板上的重寄生作用

P. fluorescensZX與B. cinerea在PDA平板上經(jīng)過7 d共培養(yǎng)后，經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，P. fluorescensZX能夠附著在B. cinerea的菌絲體上對(duì)其產(chǎn)生重寄生作用，破壞B. cinerea的菌絲形態(tài)，造成菌絲褶皺、產(chǎn)生水解孔，影響B(tài). cinerea正常生長（圖6）。

圖6 B. cinerea（左）和B. cinerea與P. fluorescens ZX（右）離體條件下相互作用的掃描電子顯微照片F(xiàn)ig.6 Scanning electron micrograph of healthy B. cinerea (left)and B. cinerea interacting with P. fluorescens ZX in vitro

2.9 P. fluorescens ZX對(duì)病原菌活體上的重寄生作用

P. fluorescensZX與B. cinerea在葡萄果實(shí)上經(jīng)過72 h共培養(yǎng)后，經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，P. fluorescensZX能夠附著在B. cinerea菌絲上破壞B.cinerea菌絲形態(tài)、造成菌絲褶皺，影響B(tài). cinerea正常生長（圖7），說明活體條件下P. fluorescensZX亦能夠?qū). cinerea產(chǎn)生重寄生作用。

圖7 B. cinerea（左）和B. cinerea與P. fluorescens ZX（右）在葡萄果實(shí)上相互作用的掃描電子顯微照片F(xiàn)ig.7 Scanning electron micrograph of healthy B. cinerea(left)and B. cinerea interacting with P. fluorescens ZX(right) on grape berries

3 討論

由于具有分布廣、適應(yīng)能力強(qiáng)、營養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、繁殖快、競(jìng)爭(zhēng)定殖能力強(qiáng)、易于人工培養(yǎng)、遺傳背景清楚、對(duì)人和環(huán)境無害、能防治多種病原微生物等特點(diǎn)，P. fluorescens越來越受到專家學(xué)者的關(guān)注，成為近幾十年來研究報(bào)道最多、最具應(yīng)用價(jià)值的一類生防菌和根際促生菌[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中，P. fluorescensZX對(duì)葡萄采后灰霉病有明顯的防治效果，就發(fā)病率來看，P. fluorescensZX處理后發(fā)病率僅顯著低于對(duì)照組；從病斑直徑看，P. fluorescensZX處理與農(nóng)藥抑霉唑處理的沒有顯著性差異；拮抗菌菌懸液處理的B. cinerea孢子萌發(fā)率顯著低于對(duì)照組的萌發(fā)率，P. fluorescensZX能夠明顯抑制B. cinerea的孢子萌發(fā)、芽管伸長，降低葡萄采后灰霉病的發(fā)病率和病斑直徑，從而有效控制葡萄采后灰霉病的發(fā)生，延緩病害速度；對(duì)比P. fluorescensZX不同處理液的作用效果，菌懸液處理的果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑都是最小的，熱殺死液、濾液、原液也具有一定的防治作用，這些結(jié)果表明P. fluorescensZX可能具有產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的能力，但具體是什么抑菌物質(zhì)還需要進(jìn)一步探究。

P. fluorescensZX在葡萄果實(shí)上的生長動(dòng)態(tài)結(jié)果表明，無論是接種還是浸泡處理P. fluorescensZX都能在葡萄果實(shí)上快速生長定殖，消耗營養(yǎng)，搶占生態(tài)位點(diǎn)，從而使B. cinerea無法獲得足夠的營養(yǎng)和空間從而無法進(jìn)行正常的生命活動(dòng)?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，與病原物進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)與空間位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)是拮抗微生物防治病害最主要的作用機(jī)制之一[22-24]。而浸泡處理的P. fluorescensZX生長速度明顯低于接種處理，說明P. fluorescensZX能夠更快地利用果實(shí)機(jī)械傷口處的營養(yǎng)，這也很好解釋了為什么越早接種拮抗菌生防效果越好。

采用兩板對(duì)扣法使得P. fluorescensZX和B.cinerea同步培養(yǎng)但彼此不接觸，結(jié)果表明P. fluorescensZX能夠產(chǎn)生多種具有較強(qiáng)抑菌作用的VOCs，明顯抑制B. cinerea的菌絲生長，產(chǎn)生的VOCs主要為醇、酮、醛、酸和含硫化合物。而Li等[25]發(fā)現(xiàn)球孢鏈霉菌（Streptomyces globisporus）JK-1產(chǎn)生的VOCs主要為二甲基二硫、二甲基三硫和苯乙酮，能夠?qū)σ獯罄嗝梗≒enicillium italicum）的生長產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。相似的，Elsherbiny等[26]發(fā)現(xiàn)兩株木霉菌（Trichoderma spp.）產(chǎn)生的VOCs中，異戊醇和2-甲基-1-丙醇對(duì)馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）的菌絲擴(kuò)展有較強(qiáng)的抑制作用，在10 μL時(shí)可完全抑制病原菌的生長。但供試菌株具體是產(chǎn)生哪些VOCs起主要抑菌作用，還需進(jìn)一步研究。

重寄生作用是指有的拮抗菌可以在病原菌菌絲上附著定殖，通過分泌細(xì)胞壁降解酶對(duì)病原菌的細(xì)胞壁及菌絲體進(jìn)行分解，達(dá)到抑制病原菌生長的作用，如Elangovan等[27]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉（Trichoderma harzianum）能夠分泌幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、纖維素酶和蛋白酶，表現(xiàn)出對(duì)甘蔗炭疽?。–olletotrichum falcatum）的重寄生潛力。Wallace等[8]在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)P. fluorescens可吸附于擴(kuò)展青霉（P. expansum）菌絲體上，導(dǎo)致病原菌菌絲體嚴(yán)重皺縮。本實(shí)驗(yàn)中，在掃描電鏡下觀察到P. fluorescensZX能夠吸附于B. cinerea菌絲體上，破壞B. cinerea菌絲形態(tài)，這也是P. fluorescensZX抑制B. cinerea的重要機(jī)制之一。拮抗菌和病原菌之間的互作效應(yīng)十分復(fù)雜，P. fluorescensZX對(duì)B. cinerea是否還存在其他的作用機(jī)制以及各種機(jī)制之間是否有協(xié)同作用，還需更深入地研究?？偟膩碚f，P. fluorescensZX對(duì)于葡萄采后灰霉病具有良好的生物防治效果，能夠有效減少損失，可以作為果蔬采后保鮮防腐的新選擇。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：a.P. fluorescensZX菌懸液能夠顯著抑制B. cinerea的孢子萌發(fā)、芽管伸長，降低葡萄采后灰霉病的發(fā)病率和病斑直徑；b. 無論是接種還是浸泡處理P. fluorescensZX都能搶占葡萄果實(shí)上營養(yǎng)與空間，使B. cinerea無法獲得足夠的營養(yǎng)和空間從而無法進(jìn)行正常的生命活動(dòng)；c.P.fluorescensZX能夠產(chǎn)生多種具有較強(qiáng)抑菌作用的VOCs，明顯抑制B. cinerea的菌絲生長；d.P. fluorescensZX抑制B. cinerea的重要機(jī)制之一是P.fluorescensZX能夠附著在B. cinerea菌絲體上破壞菌絲形態(tài)。研究P. fluorescensZX對(duì)葡萄采后灰霉病的防治作用對(duì)提高P. fluorescensZX的生防效果奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為P. fluorescensZX在實(shí)際應(yīng)用中提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究表明P. fluorescensZX能產(chǎn)生抑菌作用強(qiáng)的VOCs，但具體是哪幾種物質(zhì)發(fā)揮抑菌作用還需要更深入的研究；對(duì)于P.fluorescensZX對(duì)B. cinerea產(chǎn)生的拮抗作用其中P. fluorescensZX的代謝通路是怎樣的，有必要進(jìn)一步研究。