王麗華 郭 建

（安徽科技學(xué)院，安徽 鳳陽 233100）

玉米（Zeamays L.）是一年生的禾本科植物，玉米不僅可以作為糧食，還可以作為飼料、工業(yè)原料等。就種植面積而言，已經(jīng)超越水稻、小麥，成為國(guó)內(nèi)目前種植的第一大農(nóng)作物。由于玉米種植面積越來越大，對(duì)玉米新品種的需求也越來越大，這為玉米育種工作提供了機(jī)遇和挑戰(zhàn)，尤其近幾年每年參加國(guó)家和各省市的區(qū)域試驗(yàn)的玉米雜交組合達(dá)數(shù)千個(gè)。雖然玉米已經(jīng)日益凸顯其在農(nóng)業(yè)發(fā)展上的重要性，但就我國(guó)的玉米種質(zhì)資源來說，其遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。李俊芳等在對(duì)國(guó)家玉米主產(chǎn)區(qū)預(yù)試品種的SSR分析中指出我國(guó)現(xiàn)階段的玉米育種的親本組合有比較強(qiáng)的趨同趨勢(shì)，越是優(yōu)良的品種趨同趨勢(shì)越明顯。

SSR(Simple sequence Repeats)分子標(biāo)記的出現(xiàn)對(duì)玉米育種的快速發(fā)展起到了非常重要的作用，SSR 是一種以特異性引物為基礎(chǔ)的分子輔助標(biāo)記技術(shù)，也稱微衛(wèi)星DNA，是由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR分子輔助標(biāo)記技術(shù)以其標(biāo)記的多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用在育種工作中。孫友位等利用SSR標(biāo)記對(duì)85個(gè)玉米自交系進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果與自交系系譜關(guān)系基本一致，說明SSR標(biāo)記在劃分種質(zhì)資源的親緣關(guān)系是比較理想的。

試驗(yàn)選用的是2012-2015年國(guó)家東南區(qū)區(qū)域試驗(yàn)的玉米雜交組合種子，采用SSR標(biāo)記技術(shù)，對(duì)34個(gè)玉米雜交組合進(jìn)行SSR標(biāo)記及聚類分析，研究其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，對(duì)指導(dǎo)玉米育種實(shí)踐，有一定的積極作用。

1.材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為國(guó)家東南區(qū)區(qū)域試驗(yàn)2012-2015年的玉米雜交組合（見表1），分別取30粒種子于發(fā)芽盒內(nèi)砂床，28℃發(fā)芽室內(nèi)發(fā)苗。期間每天澆水兩次，待幼苗長(zhǎng)出5-6片葉子時(shí)進(jìn)行DNA的提取。

表1 試驗(yàn)材料的編號(hào)對(duì)應(yīng)試驗(yàn)材料名稱

1.2 試驗(yàn)方法

1.2 .1 DNA的提取

（1）研磨 選取生長(zhǎng)健壯的幼苗，取適量的葉片，用剪刀剪成小段，放置帶有標(biāo)記的2ml離心管中，每個(gè)離心管放置兩粒鋼珠，剪刀每次用完后都要用衛(wèi)生紙擦干凈以防止不同玉米雜交組合間DNA的混雜。把離心管放到液氮中冷凍數(shù)分鐘后，快速放入研磨機(jī)中進(jìn)行研磨，研磨后倒出鋼珠，把研磨的玉米葉片粉末倒入另一帶有標(biāo)記的2ml離心管中。

（2）裂解 將上述樣品管加入65℃預(yù)熱的SDS提取液 600μL，快速搖勻后放入到65℃的水浴鍋中，保溫30min，期間每10min輕微搖晃3-4次，從水浴鍋中取出樣品管，加入150μL 5M預(yù)冷的醋酸鉀后放入冰箱中冷凍存放30min。從冰箱中取出冷凍的樣品加入事先配好的24︰1的氯仿︰異戊醇，在振蕩器上震蕩30min，使其充分混勻。

（3）離心 將樣品管放置在離心機(jī)上12000r/min離心5min，用移液槍小心吸取上清液200μL加入到帶有標(biāo)記的1.5ml離心管中，加入1.5倍的預(yù)冷的無水乙醇，輕輕搖晃，放置冰箱中冷凍20min后取出離心，倒掉離心管中的液體。

（4）漂洗 向離心管中加入400μL 70%的乙醇，輕輕搖晃數(shù)次，靜置5min后，放入離心機(jī)中，12000r/min離心1min，棄廢液。把離心管倒扣在吸水紙上，晾干后，加入100μLddH2O后，用旋渦振蕩器進(jìn)行震蕩，待充分溶解后，冷凍保存。

1.2 .2 DNA的檢測(cè)

采用紫外光光度計(jì)（波長(zhǎng)260nm）檢測(cè)DNA濃度，結(jié)果表明，34個(gè)玉米樣品DNA的濃度都能符合本試驗(yàn)的要求。

1.2 .3 SSR的擴(kuò)增條件

對(duì)142對(duì)玉米的SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，從中選出多態(tài)性好，重復(fù)性高的引物再對(duì)34個(gè)玉米雜交組合進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。

PCR的擴(kuò)增體系：試驗(yàn)采用10μL反應(yīng)體系，其中ddH2O 4μL，Taq Buffer（含有Mg2+）1μL，引物1.5μL，dNTP 1μL，Taq聚合酶0.5μL，DNA 2.0μL。

PCR擴(kuò)增的程序：PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性7min，94℃變性30s，50℃退火50s，72℃延伸1min，共36個(gè)循環(huán)。72℃再延伸7min，反應(yīng)結(jié)束后，4℃的冰箱中保存。

1.2 .4 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，用0.2%的硝酸銀溶液進(jìn)行染色，染色15min，染色完成后，加入200ml的顯色液，放置在脫色搖床上，加入2ml甲醛溶液，顯色10min，條帶清晰時(shí)，倒掉廢液，用自來水緩慢沖洗幾次后，取出，掃描成像并記錄。

1.2 .5 數(shù)據(jù)處理

SSR是共顯性標(biāo)記，同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶具有同源性。有帶記為1，無帶記為0，形成SSR數(shù)據(jù)矩陣。用DPS7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以Jaccard系數(shù)、用UPGMA（類平均數(shù)）法進(jìn)行聚類分析。

2.結(jié)果與分析

2.1 34個(gè)玉米雜交組合的引物篩選

試驗(yàn)共有142對(duì)SSR引物，在對(duì)引物的篩選過程中，首先隨機(jī)選取多個(gè)SSR引物對(duì)34個(gè)玉米雜交組合進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。電泳檢測(cè)后選取清晰的條帶進(jìn)行比較，選出2015A1、2015A4玉米雜交組合的DNA，進(jìn)行SSR 引物的篩選。共篩選出多態(tài)性較好、條帶清晰的引物50對(duì)。

圖1 SSR引物篩選圖

2.2 SSR標(biāo)記在34個(gè)玉米雜交組合間的多態(tài)性分析

用篩選出的50對(duì)SSR引物對(duì)34個(gè)玉米雜交組合進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶的數(shù)目隨引物和樣品DNA的不同在1~8之間變化，多態(tài)位點(diǎn)百分率最低為62.5%，最高為100%。（見表2）通過與Marker比較可以看出，SSR引物擴(kuò)增出的條帶集中在100-500bp之間。

表2 SSR引物序列與擴(kuò)增結(jié)果

圖2 1號(hào)引物擴(kuò)增結(jié)果

2.3 34個(gè)玉米雜交組合的聚類分析

利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明（見圖3）：以Jaccard系數(shù)0.80為標(biāo)準(zhǔn)，可以將2012-2015年參加國(guó)家東南區(qū)區(qū)域試驗(yàn)的玉米雜交組合分為三大類：第一類為1、3、2、6、12、10、17、26、22、33、18、31、11、21、30、28、25、5、16、4、13、29、27、34、8、14、24、9、20、23，共30個(gè)，占88.2%，且雜交組合數(shù)量很多，說明近幾年參加區(qū)試品種的遺傳基礎(chǔ)差異較窄。第二類為32，第三類為7、15、19，從圖中可以看出第一類的親緣關(guān)系較近，第三類的Jaccard系數(shù)最大，與第一類相比，其親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，但從整體上來看，34個(gè)雜交組合的Jaccard系數(shù)集中在0.26-0.94之間，說明34個(gè)玉米雜交組合間的親緣關(guān)系差別不大。

圖3 34 個(gè)玉米雜交組合的SSR 標(biāo)記聚類圖

3.討論

3.1 SSR的穩(wěn)定性及多態(tài)性

大量研究表明，SSR標(biāo)記的試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、省時(shí)且成本較低。利用SSR標(biāo)記的多態(tài)性高，結(jié)合相應(yīng)的分析如相關(guān)分析、聚類分析等數(shù)量遺傳分析手段，可以對(duì)不同的玉米雜交組合進(jìn)行分類，判斷其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。韓萌等利用23對(duì)SSR引物對(duì)101份貴州地方種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，SSR多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)擴(kuò)增條帶為7-21個(gè)，平均11個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量變幅為0.753-0.945，平均0.857。與之相比，本試驗(yàn)利用50對(duì)SSR引物對(duì)34個(gè)玉米雜交組合進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，SSR多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)擴(kuò)增條帶為1-8個(gè)，平均3個(gè)，每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息量變幅為0.625-1.000，平均0.984。所以試驗(yàn)從142對(duì)SSR引物篩選出的50對(duì)引物對(duì)34個(gè)玉米雜交組合的SSR多態(tài)性分析結(jié)果是可信的。

由于玉米是異交授粉作物，存在自交衰退現(xiàn)象，而異交可以增強(qiáng)后代的產(chǎn)量、品質(zhì)等，所以大田上的生產(chǎn)用種是通過自交系間雜交得到的F1。玉米自交系的遺傳多樣性是育成新品種的重要基礎(chǔ)。大量研究表明SSR標(biāo)記可以有效地應(yīng)用在玉米等農(nóng)作物種質(zhì)的遺傳變異研究及類群的劃分。

3.2 親緣關(guān)系

利用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，Jaccard系數(shù)主要集中在0.26-0.94之間，說明這些雜交組合親緣關(guān)系差別不大，遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，不利于玉米品種多樣性的形成，也不利于玉米品種抵抗風(fēng)險(xiǎn)的能力，所以在玉米育種上，利用更加豐富的種質(zhì)資源。