張迎新，周賓寒，楊竹，丁富功，賈寶森，王超，方正武，王書(shū)平

1.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(長(zhǎng)江大學(xué))，湖北 荊州 434025 2.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025

小麥(TriticumaestivumL.)是我國(guó)最重要的旱地糧食作物之一，其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常常受到各種生物脅迫(病害、蟲(chóng)害等)和非生物脅迫(干旱、高鹽、漬害等)的影響。其中，小麥對(duì)漬害尤其敏感，漬害脅迫可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)20%～50%[1-3]。長(zhǎng)江中下游地區(qū)是我國(guó)冬小麥主產(chǎn)區(qū)之一，也是弱筋小麥的優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)區(qū)。該區(qū)域受季風(fēng)氣候的影響，年平均降雨量豐富，地下水位整體偏高，土壤長(zhǎng)期處于水分接近飽和的狀態(tài)，且稻—麥兩熟輪作制度使得土壤質(zhì)地黏重，通氣性差，這進(jìn)一步加重了漬害的危害程度[4]。因此，如何有效地減輕小麥生育期內(nèi)漬害脅迫所造成的損害一直是該種植區(qū)亟待解決的重要課題。研究發(fā)現(xiàn)，在小麥整個(gè)生育期內(nèi)無(wú)論受漬害時(shí)間長(zhǎng)短，均會(huì)使粒重、產(chǎn)量和品質(zhì)下降[4,5]。周廣生等[5]對(duì)孕穗期的12個(gè)小麥品種(系)進(jìn)行漬害脅迫處理，發(fā)現(xiàn)所有品種(系)的單株粒重及單株總粒數(shù)均比對(duì)照大幅度下降，且單株粒重的影響均大于單株總粒數(shù)；宋桂成等[6]通過(guò)對(duì)漬害脅迫的34份小麥品種(系)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，漬害脅迫對(duì)所調(diào)查籽粒的品質(zhì)性狀、面團(tuán)流變學(xué)特性及溶劑保持均有顯著或極顯著影響。此外，當(dāng)小麥遭受漬害脅迫時(shí)，其自身的生理生化特性會(huì)發(fā)生適應(yīng)性改變，并產(chǎn)生相應(yīng)的生理響應(yīng)機(jī)制，如形成一定數(shù)量通氣組織[7]、增加次生根的數(shù)量[8]、通過(guò)無(wú)氧呼吸維持能量供應(yīng)[9]等。更重要的是，漬害脅迫會(huì)對(duì)植株造成不可恢復(fù)的損傷，使小麥根系喪失功能[10]、限制水分傳導(dǎo)[7,11]、降低光合作用[12]、打破氧化還原代謝平衡[4]等。

糖是光合作用的產(chǎn)物，又是呼吸作用的底物，它為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供必不可少的碳骨架和能量[13]。糖代謝是整個(gè)生物代謝的中心，與蛋白質(zhì)代謝、脂類代謝、核酸代謝及次生物質(zhì)代謝密切相關(guān)[14]。糖除了作為代謝底物之外，也與植物激素類似，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可作為第一信使調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、同化物的分配以及細(xì)胞的分裂、分化和代謝[15]。研究表明，漬害脅迫下光合作用形成的碳水化合物向根部的運(yùn)輸能力顯著降低，根系蔗糖含量在短期漬害脅迫下呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，而在長(zhǎng)期漬害脅迫下則將快速耗竭[7]。此外，蔗糖在韌皮部的裝載和長(zhǎng)距離運(yùn)輸需要蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrose transporters，SUT)參與才能完成，該蛋白是一類典型的膜結(jié)合蛋白分子，廣泛存在于高等植物的組織和細(xì)胞中，能夠利用細(xì)胞內(nèi)外H+濃度梯度對(duì)蔗糖分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。目前已鑒定出的3個(gè)小麥蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaSUT1A、1B和1D，在小麥旗葉、莖和籽粒等多個(gè)組織中均有表達(dá)，并且3個(gè)基因的表達(dá)水平保持一致，這些基因編碼的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了多個(gè)組織的蔗糖運(yùn)輸過(guò)程[16,17]。因此，對(duì)漬害脅迫下小麥幼苗糖代謝過(guò)程的研究具有重要的意義，可為揭示小麥響應(yīng)漬害脅迫的機(jī)理提供重要理論依據(jù)。

該研究以幼苗期的小麥葉片為試驗(yàn)材料，分析了不同漬害脅迫持續(xù)時(shí)間對(duì)小麥幼苗葉綠素含量、可溶性糖含量和淀粉含量的影響，并比較了漬害脅迫下蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaSUT1A的表達(dá)水平，旨在研究和揭示漬害脅迫下小麥幼苗糖代謝的變化規(guī)律，探索小麥漬害脅迫響應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而為緩解漬害對(duì)小麥的影響，確保小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試小麥品種為鄭麥9023。采用盆栽套桶法[4]，2019年10月下旬播種于相同規(guī)格的塑料盆中，盆口直徑34cm，底直徑30cm，高度27cm，土壤過(guò)篩與基肥混勻后裝盆澆水(基肥用量為每千克干土0.15gN，0.1gP2O5和0.15gK2O)，待土自然沉實(shí)后播種，每盆選種播撒15粒，兩葉一心期定植大致相同的植株10株，并于人工氣候室中進(jìn)行漬害脅迫處理，設(shè)置溫度(25±1)℃，濕度為(70±5)%。處理組均在盆外再套一塑料桶，并保持水層在2cm左右。漬害脅迫處理設(shè)置5個(gè)持續(xù)時(shí)間，分別為0、1、3、5、7d。每處理重復(fù)3次。

1.2 葉綠素的提取

葉綠素的提取參照侯澤豪等[18]的方法并略加修改。取1g小麥葉片，置于預(yù)冷的研缽中，加入提取液5mL(丙酮∶乙醇=1∶1)和少量石英砂，研磨至勻漿狀后，于25℃恒溫?fù)u床(110r/min，避光)下浸提20h，經(jīng)過(guò)濾、洗滌后定容至25mL，并立即在645nm和663nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度值。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)量3次。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Amon法修正公式[18]計(jì)算葉綠素含量。

1.3 可溶性糖及淀粉含量的測(cè)定

參照WANG等[19]的蒽酮比色法進(jìn)行。繪制葡萄糖含量與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在620nm波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)量3次。按以下公式分別計(jì)算可溶性糖及淀粉含量：

可溶性糖含量=(C×Vt×n)/(W×Vs×1000)

淀粉含量=(C×Vt×0.9)/(W×Vs×1000)

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得每管葡萄糖含量，μg；Vt為樣品提取液總體積，mL；Vs為測(cè)定時(shí)取樣體積，mL；W為樣品干重，g；n為稀釋倍數(shù)；1000為換算系數(shù)；0.9為葡萄糖換算為淀粉的系數(shù)。

1.4 熒光定量PCR分析

參考WANG等[20]的方法進(jìn)行，并按照Trizol Reagent Kit(Invitrogen公司)的操作說(shuō)明提取總RNA。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量后，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM RT Reagent Kit(TaKaRa公司)中操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成。熒光定量PCR采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa公司)在CFX96RealTime PCR System上進(jìn)行(見(jiàn)表1)，按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)測(cè)量3次。使用Actin基因作為內(nèi)參基因，并利用2-△△Ct法[20]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 相關(guān)基因熒光定量PCR引物

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并用Origin 9.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析及繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 漬害脅迫對(duì)小麥幼苗葉綠素含量的影響

注：*表示處理間的差異顯著(P<0.05)，**表示處理間的 差異顯著(P<0.01)。圖2、3同。圖1 不同漬害脅迫持續(xù)時(shí)間下小麥幼苗的葉綠素含量Fig.1 The chlorophyll content of wheat seedlings under different durations of waterlogging stress

為了揭示漬害脅迫下小麥幼苗葉綠素的變化規(guī)律，研究采用丙酮乙醇直接浸提法(浸提20h)提取不同處理時(shí)長(zhǎng)的小麥幼苗葉綠素并測(cè)定其含量。由圖1可知，正常生長(zhǎng)的小麥幼苗經(jīng)漬害處理后其葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量均呈先升高后下降的趨勢(shì)，且在漬害脅迫處理1d時(shí)顯著高于對(duì)照組并到達(dá)最大值，分別比對(duì)照組顯著增加了7.60%(葉綠素a)、21.85%(葉綠素b)和10.07%(總?cè)~綠素)。但自脅迫處理3d開(kāi)始處理組的葉綠素含量均持續(xù)和顯著的低于對(duì)照組，葉綠素a含量分別比對(duì)照組顯著降低了12.95%(3d)、21.97%(5d)和35.44%(7d)。與葉綠素a相比，葉綠素b對(duì)漬害脅迫更為敏感，在漬害處理后期的下降幅度較大，分別比對(duì)照組降低了8.20%(3d)、33.85%(5d)和44.31%(7d)。這使得漬害脅迫下幼苗總?cè)~綠素含量分別較對(duì)照組顯著降低了12.25%(3d)、24.03%(5d)和36.97%(7d)。

2.2 漬害脅迫對(duì)小麥幼苗可溶性糖和淀粉含量的影響

圖2 不同漬害脅迫持續(xù)時(shí)間下小麥幼苗的可溶性糖和淀粉含量Fig.2 The soluble sugar and starch content of wheat seedlings under different durations of waterlogging stress

圖3 不同漬害脅迫持續(xù)時(shí)間下的小麥幼苗TaSUT1基因表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of TaSUT1 gene of wheat seedlings under different durations of waterlogging stress

糖和淀粉是光合作用的主要終產(chǎn)物，在植物糖代謝中具有特殊的位置[21]。因此，研究對(duì)不同漬害脅迫持續(xù)時(shí)間的小麥幼苗的可溶性糖和淀粉含量進(jìn)行了分析。結(jié)果(見(jiàn)圖2)顯示,與對(duì)照組相比，可溶性糖和淀粉含量均呈現(xiàn)“升高-降低”的趨勢(shì)，且在漬害脅迫處理1d時(shí)，二者的含量均顯著高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.06倍(可溶性糖)和1.20倍(淀粉)。但隨著漬害脅迫時(shí)間的持續(xù)，可溶性糖和淀粉含量自脅迫處理3d開(kāi)始均顯著低于對(duì)照組，其中，可溶性糖含量分別較對(duì)照組降低了12.67%(3d)、22.57%(5d)和35.22%(7d)，淀粉含量則分別較對(duì)照組降低了31.20%(3d)、44.67%(5d)和59.84%(7d)。

2.3 漬害脅迫對(duì)小麥幼苗中TaSUT1基因表達(dá)模式的分析

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TaSUT1基因的表達(dá)水平。結(jié)果(見(jiàn)圖3)表明，在漬害脅迫1d時(shí)，TaSUT1基因的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異。但隨著脅迫時(shí)間的持續(xù)，與對(duì)照組相比，漬害脅迫顯著降低了TaSUT1基因的表達(dá)水平，分別比對(duì)照組降低了34.98%(3d)、56.49%(5d)和58.51%(7d)。

3 討論

小麥?zhǔn)且环N重要的糧食作物，但是各種環(huán)境脅迫(如生物脅迫和非生物脅迫)往往對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育造成巨大的影響，使小麥產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度降低[3,22]。因此，研究小麥抗性機(jī)制，提高其耐受性，能夠顯著提高小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[22]。逆境脅迫對(duì)小麥光合元件有多種形式的影響，尤其是對(duì)光合作用的影響極為顯著[3,22]。葉綠素是植物體內(nèi)葉綠體的重要組成成分，是植物光合作用中吸收光的主要色素，能將捕捉到的光能轉(zhuǎn)化為生物能，為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量[3,18]。幼苗期的小麥處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的初期，需要通過(guò)葉片的光合作用為其快速生長(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。研究表明在鹽分和干旱交叉脅迫下，小麥幼苗葉綠素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并隨著脅迫程度的加重其含量下降加速[23]。張朝明[22]研究認(rèn)為在高溫和高光共同作用下，小麥葉綠素含量呈顯著降低的趨勢(shì)。程貫召[24]則以不同濃度Cu2+對(duì)小麥種子幼苗的生理生化特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著Cu2+濃度的升高，小麥幼苗的葉綠素含量降低，從而抑制了小麥幼苗的光合作用，影響了幼苗的進(jìn)一步生長(zhǎng)和發(fā)育。該研究中，在漬害脅迫的初期，小麥葉綠素含量呈現(xiàn)短暫升高的趨勢(shì)，這表明小麥幼苗在遭受漬害脅迫時(shí)表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，通過(guò)提高葉綠素的含量來(lái)增強(qiáng)其自身的光合效率，從而提高其抗逆性。但隨著漬害脅迫時(shí)間的持續(xù)，小麥光合色素的合成遭到破壞，表現(xiàn)為葉綠素含量呈現(xiàn)較大的降幅，進(jìn)而影響幼苗期小麥的光合作用，減緩或抑制植株的正常生長(zhǎng)。

淀粉和蔗糖是幼苗期小麥光合作用的主要終產(chǎn)物，也是碳水化合物運(yùn)輸和貯藏的主要形式[21]。葉片光合作用所合成的糖分，可以通過(guò)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將蔗糖分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。研究表明，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與蔗糖在韌皮部的裝載和長(zhǎng)距離運(yùn)輸，并在庫(kù)器官卸載的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。此外，在小麥植株的碳代謝中，蔗糖代謝和淀粉合成既相互依存，又相互制約，是一個(gè)不可分割的整體[25]。在該研究中，漬害脅迫對(duì)幼苗期小麥糖代謝造成了一定的影響，脅迫初期由于光合作用效率的增強(qiáng)，從而促進(jìn)了蔗糖的生物合成，加之參與蔗糖長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)腡aSUT1基因的表達(dá)水平并未顯著提高，導(dǎo)致大量蔗糖在葉片內(nèi)積累，并開(kāi)始轉(zhuǎn)化為淀粉進(jìn)行儲(chǔ)存，使得幼苗葉片內(nèi)可溶性糖含量和淀粉含量均顯著升高。但隨著脅迫時(shí)間的持續(xù)，葉片光合作用受到顯著抑制，導(dǎo)致碳同化過(guò)程受阻，葉片中可溶性糖和淀粉含量均急劇降低，TaSUT1基因的表達(dá)水平也顯著降低，進(jìn)而使得處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)初期階段的小麥幼苗因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺失而處于畸形的發(fā)育狀態(tài)甚至死亡。