韶 萌，劉春霞

(南通大學(xué)附屬瑞慈醫(yī)院檢驗(yàn)科，南通 226010)

自2019 年12 月以來(lái)，世界各地陸續(xù)爆發(fā)了新型冠狀病毒(coronavirus disease 2019,COVID-19)感染。該病毒為β 屬冠狀病毒，為有包膜的RNA 病毒[1]，與重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndromes coronavirus,SARS-CoV)高度同源，傳染性強(qiáng)于SARS-CoV[2]。感染癥狀常表現(xiàn)為干咳、發(fā)熱和乏力，嚴(yán)重的可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒血癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官功能衰竭等。國(guó)家衛(wèi)生健康委陸續(xù)發(fā)布了8 個(gè)版本的COVID-19 診療指南，均將病原學(xué)檢測(cè)作為COVID-19 診斷的確診指標(biāo)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)是在日常工作中使用最廣泛的檢測(cè)方法[3]。為評(píng)估江蘇碩世生物科技股份有限公司的核酸檢測(cè)試劑使用樂(lè)普96 通道PCR 儀(Lepgen-96)檢測(cè)結(jié)果是否能滿足臨床需求，本文依照中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(China National Accreditation Ser vice for Conformity Assessment,CNAS)發(fā)布的CNASGL039《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》[4]進(jìn)行了性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并做出評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)使用了衛(wèi)生部2020 年第2次COVID-19 核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)發(fā)放的樣本，江蘇省臨床檢驗(yàn)中心2020 年第3 次COVID-19核酸檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)發(fā)放的樣本，樣本均為基因工程方法制備的病毒樣顆粒模擬樣本。江蘇碩世生物科技股份有限公司提供的含ORF1ab 基因、N 基因及內(nèi)標(biāo)片段的病毒樣顆粒的陽(yáng)性對(duì)照品。核酸提取及純化試劑(批號(hào)：20201105)及核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20201119)均由江蘇碩世生物科技股份有限公司生產(chǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR 儀為樂(lè)普科技Lepgen-96。

1.2 檢測(cè)方法及結(jié)果判讀 參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，循環(huán)參數(shù)為：50 ℃10 min；97 ℃1 min；97 ℃5 s；58 ℃30 s，共45 個(gè)循環(huán)，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。根據(jù)擴(kuò)增曲線判讀結(jié)果：ORF1ab 基因和N 基因通道Ct≤37且有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，結(jié)果判為陽(yáng)性；3740 或未檢出，結(jié)果為陰性。

1.3 驗(yàn)證方法和指標(biāo)

1.3.1 陰、陽(yáng)性符合率 10 例陽(yáng)性樣本采用衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)及江蘇省室間質(zhì)評(píng)樣本8 例，試劑陽(yáng)性對(duì)照2 例；10 例陰性樣本采用衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)及江蘇省室間質(zhì)評(píng)樣本各1 例，健康人咽拭子樣本8 例，參照試劑盒產(chǎn)品性能指標(biāo)陽(yáng)性符合率100%，陰性符合率100%則符合指標(biāo)。

1.3.2 精密度評(píng)價(jià) 使用1 例強(qiáng)陽(yáng)性樣本，1 例弱陽(yáng)性樣本每日重復(fù)檢測(cè)5 次，連續(xù)檢測(cè)5 d，共測(cè)定25 次。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，分別計(jì)算2 例樣本Ct 值的標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)及變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)，如CV<5%，則精密度符合要求。

1.3.3 最低檢出限 依照試劑盒產(chǎn)品性能指標(biāo)最低檢出限≤350 copies/mL 的說(shuō)明，使用定值為500 copies/mL 的江蘇省室間質(zhì)評(píng)樣本與無(wú)核糖核酸酶水按7∶3 的比例混合，配置濃度為350 copies/mL的樣本重復(fù)檢測(cè)5 次，陽(yáng)性檢出率為100%，則符合要求。

1.3.4 特異性驗(yàn)證 將加入白色念珠菌菌株的樣本保存液，加入金黃色葡萄球菌菌株的樣本保存液及包含MRAS、HCoVOC43、HCoVHKU1、HCoV229E、HCo-VNL63RNA 病毒樣顆粒(濃度均>1.0×104IU/mL)的江蘇省室間質(zhì)評(píng)樣本復(fù)管3 次進(jìn)行檢測(cè)。均無(wú)擴(kuò)增曲線則符合產(chǎn)品指標(biāo)。

1.3.5 干擾物質(zhì) 將一份弱陽(yáng)性樣本分為4 份，190 μL/份。實(shí)驗(yàn)組3 份分別加入新鮮血液(選取血紅蛋白100 g/L 的樣本，混合后血紅蛋白質(zhì)量濃度為5 g/L)、苯福平、阿奇霉素各10 μL。另有一份加入10 μL 無(wú)核糖核酸酶水作為對(duì)照。提取后重復(fù)檢測(cè)3 次，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Ct 值的絕對(duì)偏差≤1.6 為符合要求[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。精密度采用CV 表示，計(jì)數(shù)資料采用率(%)表示，計(jì)量資料采用表示，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 陰、陽(yáng)性符合率 10 例陽(yáng)性樣本均有明顯擴(kuò)增曲線，且Ct 值<37。其中定值為200 copies/mL 的樣本，ORF1ab 基因和N 基因Ct 值分別為36.56、35.11。陽(yáng)性符合率為100%。10 例陰性樣本均無(wú)擴(kuò)增曲線，陰性符合率為100%。

2.2 精密度評(píng)價(jià) 強(qiáng)陽(yáng)性樣本ORF1ab 基因與N基因Ct 均值分別為22.47、23.58，CV 為1.26%、1.3%。弱陽(yáng)性樣本ORF1ab 基因與N 基因Ct 均值分別為34.15、34.31，CV 為1.24%、1.06%。CV 值均<5%，結(jié)果符合要求，見(jiàn)表1。

表1 兩種樣本精密度結(jié)果

2.3 最低檢出限 重復(fù)檢測(cè)濃度為350 copies/mL的樣本5 次，Orf1ab 基因和N 基因均有明顯擴(kuò)增曲線且Ct 值<37，陽(yáng)性檢出率為100%，符合廠家性能指標(biāo)，見(jiàn)圖1A。

2.4 特異性驗(yàn)證 3 次復(fù)管在陰陽(yáng)性對(duì)照管結(jié)果均正常的情況下，白色念珠菌樣本、金黃色葡萄球菌樣本及包含MRAS、HCoVOC43、HCoVHKU1、HCoV229E、HCoVNL63RNA 病毒樣顆粒的樣本均無(wú)擴(kuò)增曲線，證明以上幾種病原微生物均不存在交叉反應(yīng)。

2.5 干擾物質(zhì) 實(shí)驗(yàn)管與對(duì)照管的ORF1ab 基因、N 基因Ct 差值均<1.6，證明血紅蛋白、苯福平及阿奇霉素不會(huì)對(duì)新冠病毒核酸結(jié)果產(chǎn)生明顯干擾，驗(yàn)證結(jié)果符合要求。圖1B～D 為3 次干擾實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線,表2 所示為通過(guò)計(jì)算得出的結(jié)果。

表2 干擾實(shí)驗(yàn)各組ORF1ab 基因及N 基因結(jié)果

圖1 ORF1ab 和N 基因擴(kuò)增曲線圖

3 討 論

始于2019 年底的新冠肺炎疫情是新中國(guó)成立以來(lái)，傳播速度最快、感染范圍最廣、防控難度最大的重大突發(fā)公共衛(wèi)生事件[6]。為防止疫情反復(fù)，國(guó)家衛(wèi)生健康委在2020 年6 月8 日發(fā)布的《關(guān)于加快推進(jìn)新冠病毒核酸檢測(cè)的實(shí)施意見(jiàn)》中指出：要落實(shí)加快提升檢測(cè)能力所需的人員、設(shè)備和資金，對(duì)重點(diǎn)人群要做到應(yīng)檢盡檢[7]。依據(jù)文件要求，各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)陸續(xù)開(kāi)展了COVID-19 的RT-PCR 檢測(cè)，直接造成了美國(guó)應(yīng)用生物、羅氏等常用的知名品牌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀供應(yīng)短缺，保有量相對(duì)較少的各種品牌PCR 擴(kuò)增儀開(kāi)始大量投入使用。黃玉蘭等[8]發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增儀與試劑匹配性不好可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。采購(gòu)新儀器，保證其檢驗(yàn)結(jié)果能滿足臨床需求成為新儀器投入使用的必要先決條件。

COVID-19 核酸檢測(cè)性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)有助于新冠核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。另外在控制檢測(cè)結(jié)果的同時(shí)也需注意，日常使用的鼻咽拭子標(biāo)本陰性結(jié)果并不能完全確定未感染COVID-19，普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子；咽拭子標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率也低于深咳痰液標(biāo)本[9]。COVID-19 核酸結(jié)果結(jié)合臨床及影像學(xué)結(jié)果綜合判斷，對(duì)疑似患者的確診有重要意義[10]。

本研究通過(guò)使用樂(lè)普科技Lepgen-96 PCR 儀對(duì)碩世生物的新冠核酸試劑盒進(jìn)行性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了在該套系統(tǒng)下陰、陽(yáng)性符合率為100%；弱陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本的精密度均CV<5%；最低檢出限與試劑盒注明的≤350 copies/mL 相符；與白色念珠菌，金黃色葡萄球菌、MRAS、HCoVOC43、HCoVHKU1、HCoV229E、HCoVNL63RNA 均不存在交叉反應(yīng)；血紅蛋白、苯福平及阿奇霉素不會(huì)明顯干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明使用樂(lè)普科技Lepgen-96 PCR 儀及碩世生物新冠核酸試劑盒對(duì)COVID-19 核酸進(jìn)行檢測(cè)符合率高，重復(fù)性好，最低檢出限、特異性及抗干擾能力均能符合產(chǎn)品性能說(shuō)明，可以滿足臨床需求。