徐紅梅 殷濤 趙青 羅治建 王建敏 汪如珍 熊琰

摘 要： Smal-007菌株分離自美國松材線蟲體表，具有較好森防潛能。2018～2019年連續(xù)兩年在湖北省崇陽縣項目示范區(qū)大面積噴灑Smal-007菌劑防治松材線蟲，項目實施期間取得了較好的防治效果。

關鍵詞： 松材線蟲病;生防細菌;防效

中圖分類號：S763.712?? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1004-3020（2021）05-0024-04

Control Effect of Pine Wilt Disease Using A Biological Control Agent of Smal-007 in Chongyang，Hubei Province

Xu Hongmei（1） Yin Tao（2） Zhao Qing（2） Luo Zhijian（2） Wang Jianmin（3） Wang Ruzhen（3） Xiong Yan（2）

（ 1.Hubei Academy of Forestry Wuhan 430075;

2.Hubei Forest Pest Control and Quarantine General Station Wuhan 430079;

3.Chongyang County Forest Pest Control Station Xianning 437521）

Abstract： The strain Smal-007 of Stenotrophomonas maltophilias was isolated From America as a biocontrol agent for controlling pine wilt disease.A large-scale experiment was performed in forest in Chongyang，Hubei Province.The spraying was performed for once a year，in 2018 and 2019，respectively.The number of wilting and dead pine tree was significantly reduced in experiment district.

Key words： Pine wilt disease;biocontrol bacteria;control effect

松材線蟲病，又稱為松材線蟲萎蔫病，被公認為松樹的“癌癥”。松材線蟲病主要分布于美國、加拿大、墨西哥、日本、中國、韓國、朝鮮、法國、尼日利亞和葡萄牙等多個國家[1]。中國自1982年首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲病以來，該病已迅速蔓延至天津、遼寧、江蘇、安徽、廣東、浙江、湖北等18個行政區(qū)，造成巨大的經濟損失，嚴重威脅我國森林安全[2]。

美國是松材線蟲病原產地，但很少有松樹大面積枯死。從病原、傳播媒介、寄主和環(huán)境等幾個影響松材線蟲病流行的重要因素對比分析，很多學者認為主要原因在于美國松材線蟲致病力較弱，而研究表明這與其線蟲體表附著的細菌有密切關系[3]。

南京林業(yè)大學從美國松材線蟲體表分離篩選到一株嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomnas maltophilia Smal-007具有較好生防潛能：該菌致病力弱，定殖和替代能力強，對環(huán)境安全無毒[3-6]。目前，應用該菌在安徽安慶、懷寧、當涂、福建三明市開展林間防治松材線蟲試驗，防治效果較好[7-9]。

近年來湖北省松材線蟲病呈現(xiàn)快速擴展蔓延態(tài)勢，防治松材線蟲病的形勢十分嚴峻。湖北省林業(yè)局將“松材線蟲病新型生防菌劑推廣示范”列為2017年度中央財政林業(yè)科技推廣示范項目。該項目于2018～2019年連續(xù)兩年在湖北省崇陽縣項目示范區(qū)噴灑Smal-007菌劑防治松材線蟲，總結如下。

1 材料與方法

1.1 示范區(qū)概況

本項目試驗示范區(qū)位于湖北省崇陽縣白霓鎮(zhèn)和桂花泉鎮(zhèn)。崇陽縣地處湖北省南陲，居湘、鄂、贛三省交界處，位于北緯29°12～29°41，東經113°43～114°21之間。亞熱帶季風氣候，日照充足，溫和多雨，無霜期長，年平均氣溫17.0 ℃，年均降雨量1 312 mm，試驗示范區(qū)林分類型為針闊混交林，不同的小班樹種組成（闊葉樹種類、針闊比）有所不同?？傮w說來，白霓鎮(zhèn)試驗示范林以馬尾松Pinus massoniana為主，混有少量南酸棗Choerospondias axillaris、楓香樹Liquidambar formosana、苦櫧Castanopsis sclerophylla等闊葉樹種，桂花泉鎮(zhèn)試驗示范林包含闊葉樹種比例稍高，闊葉樹種主要有苦櫧、南酸棗、柃木Eurya japonica、檫木Sassafras tzumu等。

1.2 樣地設置

2017年底完成樣地設置和防治前調查工作。樣地設置采用典型取樣法，即在白霓鎮(zhèn)、桂花泉鎮(zhèn)試驗示范區(qū)內按照不同的地形、坡度及林分狀況，有選擇性地設置樣地3個，大小為0.67 hm2。同時在附近未防治區(qū)，設置相同面積對照樣地1個，總共設置樣地8個。記錄每個樣地地貌（中山、丘陵、平原）、坡度、坡向、坡位、林分種類及經營等級（好、中、差）等基本情況。

每個樣地周圍設置固定標識，樣地內每株馬尾松編上編號并用紅色油漆標識。每年5～10月，在每個樣地內掛設APF-I誘捕器1個誘捕松墨天牛，用于定期監(jiān)測試驗示范區(qū)松墨天牛數(shù)量變化及攜帶Smal-007生防菌情況。

1.3 供試菌株和菌劑制備

Smal-007菌株：從美國松材線蟲體表分離，經鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌，由南京林業(yè)大學森林病理實驗室提供。

將保存于NA平板上的Smal-007菌株劃線活化，挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min于恒溫搖床上震蕩培養(yǎng)36 h，作為種子液，將種子液倒入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵主要參數(shù)參照劉侃誠方法進行[7]。發(fā)酵好的Smal-007菌劑，裝入滅菌的25 kg塑料桶中保存運輸。

1.4 噴施發(fā)酵液

2018～2019年5月噴施前密切留意天氣預報，選擇無雨的天氣進行噴灑菌劑，盡量保證噴灑后48 h內無降雨。2018年5月16日，在崇陽縣項目示范區(qū)采用歐直小松鼠AS350B3直升機吊掛美國Laolaer3900-350B2農林噴灑作業(yè)設備共飛行3個架次，每次裝藥800 kg，采取低容量噴霧，噴灑量為4.50～5.25 kg·hm-2，林間噴灑要求均勻全面，不留死角。2019年5月27日采用羅賓遜R44直升級吊掛美國農林噴灑作業(yè)設備飛行13個架次，每次裝藥200 kg，噴灑方式和噴灑量與2018年相同。各試驗林分別選取立地條件和發(fā)病條件基本相同的林地作為對照區(qū)。每年8～10月，對試驗示范區(qū)松材線蟲病枯死樹進行調查統(tǒng)計，結合對照區(qū)病死樹情況，評價Smal-007林間防治效果。

防治效果計算方法如下：

枯死株降低率（%）=（防治前平均每公頃枯死株數(shù)-防治后平均每公頃枯死株數(shù)）/防治前平均每公頃枯死株數(shù)×100%;

防治效果（%）=[（100-對照區(qū)枯死降低率）-（100-防治區(qū)枯死降低率）]/（100-對照區(qū)枯死降低率）×100%。

1.5 生防菌林間定植檢測

噴灑Smal-007菌劑后當年和第2年6～8月，在林間懸掛APF-I型引誘器誘捕松墨天牛，以選擇性培養(yǎng)基富集法，并結合DNA測序技術，檢測其攜帶的細菌來評估生防菌林間定殖情況。

制備選擇性培養(yǎng)基，將活天牛放入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)36 h。吸取0.5 mL培養(yǎng)液于選擇性培養(yǎng)基平板中央，用細菌涂布均勻涂抹在平板表面。將平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，待菌落長出后，根據(jù)菌落形態(tài)、大小進行分類并統(tǒng)計各菌落比率。隨機挑取5個疑似Smal-007菌株，在NA平板上劃線純化，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，待菌落長出后，送至生物技術有限公司進行測序，測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫比對，完成細菌16SrDNA測序驗證。根據(jù)選擇性培養(yǎng)和測序結果，計算各采集點天牛攜帶Smal-007菌株比率。以沒有噴灑菌劑林分誘捕到的松墨天牛作為對照。

2 結果與分析

2.1 菌劑林間防治效果

2018年5月噴灑菌劑時，當日天氣條件比較好，噴灑后36 h有降雨，雨量中等。2019年5月噴灑后48 h有降雨，雨量較大。分別于2017年、2018年和2019年10月底對試驗地防治區(qū)和對照區(qū)進行松材線蟲病枯死樹調查，結果見表1。

2019年試驗區(qū)所處鄂東南地區(qū)遭遇五十年一遇極端干旱天氣，崇陽縣自7月14日以后，高溫少雨天氣持續(xù)幾個月，旱情十分嚴重，導致大量林木樹勢衰退甚至死亡。經調查，2019年項目示范區(qū)內有部分松樹因干旱枯死。對因干旱枯死與松材線蟲致死松樹進行了區(qū)分，統(tǒng)計防治效果時將前者剔除。

根據(jù)表1結果計算枯死株降低率和防治效果。由表2可知，飛機噴灑Smal-007菌劑的白霓鎮(zhèn)試驗地，松樹枯死株數(shù)明顯減少，2018年較防治前（2017年）松樹枯死株降低率為86.67%，2019年較防治前（2017年）年松樹枯死株降低率為92.2%。對照區(qū)松樹枯死株率沒有降低。防治區(qū)與對照區(qū)相比，2018年防治效果為86.67%，2019年防治效果92.2%。飛機噴灑Smal-007菌劑的桂花泉鎮(zhèn)試驗林，松樹枯死株數(shù)也顯著減少，2018年較防治前（2017年）松樹枯死株降低率為48.89%，2019年較防治前（2017年）松樹枯死株降低率為91.1%。對照區(qū)松樹枯死株降低率2018年和2019年均為11.11%。防治區(qū)與對照區(qū)相比，2018年防治效果為42.07%，2019年防治效果為90.1%。

2.2 生防菌林間定殖檢測結果

2018年和2019年6～8月，在試驗林誘捕松墨天牛，檢測攜帶生防菌的松墨天牛數(shù)量，在此基礎上評估生防菌在林間的定植情況，結果見表3。

噴灑Smal-007菌劑當年，總計誘捕到37頭活松墨天牛，其中9頭攜帶生防菌，攜帶生防菌天牛比例為24.3%;連續(xù)噴灑菌劑2年后，總計誘捕到41頭活松墨天牛，其中19頭攜帶生防菌，攜帶生防菌天牛比例為46.3%。未噴灑Smal-007菌劑的對照區(qū)誘捕到的天牛不攜帶生防菌。到由此看來，林間連續(xù)噴灑Smal-007菌劑兩年后，松墨天牛攜帶生防菌的比例逐步增加，表明該菌劑逐步在林間定殖和繁衍。

本項目監(jiān)測到攜帶Smal-007生防菌劑天牛比例比姚伍等人在福建三明市應用Smal-007生防菌防治松材線蟲時監(jiān)測數(shù)據(jù)偏低，除了不同地區(qū)的林分、氣候等因素影響Smal-007生防菌定殖效果等原因，另一個重要影響因素為二者所使用的檢測方法不同：姚伍等人采用的用酶聯(lián)免疫儀抗體標記法更加靈敏高效，而本項目采用的16SrDNA測序法相對更加耗時，工作量大，效率偏低。

3 結論與討論

研究人員推測，Smal-007生防菌通過替代松材線蟲體表的產毒細菌，以使松材線蟲喪失致病性，從而實現(xiàn)防治作用。Smal-007菌劑噴灑到林間后，可在松樹的針葉、樹皮甚至雜草表面定殖和繁衍。松墨天牛成蟲在林間黏附生防菌。Smal-007極易在松墨天牛攜帶的松材線蟲體表繁殖，迅速替代其體表致病細菌，從而導致被生防菌定殖的松材線蟲喪失致病能力。另外，由于攜帶生防菌的線蟲產生毒素能力較低，不能致死松樹細胞，線蟲也不易在樹體內擴大繁殖，傷口會慢慢愈合。

根據(jù)其作用原理，Smal-007生防菌防治效果受到以下因素制約：一是生防菌不能主動侵入樹體殺死線蟲，對已經感染線蟲并發(fā)病的松樹沒有治愈能力;二是Smal-007菌劑噴灑到林間后，需要一定的時間生長繁殖，難以在短期內被大量松墨天牛攜帶。顯著防效不僅要求連續(xù)2年噴灑菌劑，還要求一定的防治面積以達到規(guī)模效應。另外Smal-007生防菌林間定殖和繁衍容易受到氣候因素影響，尤其是噴菌后48 h內降雨會對細菌初步定殖產生影響，從而影響防治效果。

2018年白霓鎮(zhèn)示范區(qū)松樹枯死株數(shù)明顯減少，2018年較防治前（2017年）松樹枯死株率降低86.67%，防治效果為86.67%。2018年桂花泉鎮(zhèn)試驗地，松樹枯死株數(shù)也明顯減少，2018年較防治前（2017年）松樹枯死株率降低48.89%，防治效果為42.07%。2018年桂花泉鎮(zhèn)防治效果稍低，主要影響因素有：一是桂花泉鎮(zhèn)示范區(qū)面積較小，只有91.13 hm2，未完全體現(xiàn)出規(guī)模效應;二是桂花泉鎮(zhèn)示范林松材線蟲病防治前已經發(fā)病嚴重，已經感染松材線蟲并發(fā)病的馬尾松數(shù)量偏多。

2019年白霓鎮(zhèn)示范區(qū)較防治前（2017年）年松樹枯死株率降低92.2%，防治效果為92.2%。2019年桂花泉鎮(zhèn)試驗地，松樹枯死株數(shù)顯著減少，2019年較防治前（2017年）松樹枯死株率降低91.1%，防治效果為90.1%。

總體說來，本項目在崇陽縣白霓鎮(zhèn)和桂花泉鎮(zhèn)應用Smal-007生防菌防治松材線蟲，取得了較好的防治效果。

參 考 文 獻

[1]楊寶君，潘宏陽，湯堅，等.松材線蟲?。˙ursaphelenchus xylophilus）[M].北京：中國林業(yè)出版社，2003：1-9.

[2]國家林業(yè)和草原局.2019年全國松材線蟲病疫區(qū)公告（國家林業(yè)和草原局公告2019年第4號）[EB/OL].（2019-01-24）[2020-08-02]http：//www.forestry.gov.cn.

[3]曾腓力，賁愛玲，鄭敬榮，等.美國松材線蟲體表攜帶優(yōu)勢細菌的鑒定及致病性[J].浙江農林大學學報，2012（5）：696-702.

[4]喬雪娟.美國松材線蟲體表優(yōu)勢菌株定殖及生存能力研究[D]南京：南京林業(yè)大學，2013.

[5]韓正敏，賁愛玲，曾腓力，等.利用美國松材線蟲體表細菌防治松材線蟲病的方法：CN102630534A[P].2012-08-15.

[6]韓正敏，曾腓力，賁愛玲，等.用于防治松材線蟲病的菌株Smal-007及其應用：CN103205385A[P].2013-07-17.

[7]劉侃誠.松材線蟲病生防細菌的研究.[D]南京：南京林業(yè)大學，2013.

[8]孫京天.美國菌株Smal-007對松樹萎蔫病生防作用的研究.[D]南京：南京林業(yè)大學，2014.

[9]姚伍，鄭催云，陳紅梅，等.福建三明市應用Smal-007菌劑防治松材線蟲病的效果[J].林業(yè)科學，2018（1）：168-173.

（責任編輯：唐 嵐）