宋 潔，易 琴

1. 西南大學(xué) 附屬中學(xué)校，重慶 400700； 2. 西南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究所，重慶 400715

濕地在生態(tài)恢復(fù)中發(fā)揮著重要作用．濕地具有多種生態(tài)功能，包括元素生物地球化學(xué)循環(huán)、 作為有機(jī)碳庫減少溫室氣體如CO2，N2O和CH4釋放等．人工濕地具有較好的景觀效果和污染物處理效率，因而在生活污水處理中得到了廣泛的應(yīng)用[1]．濕地影響著細(xì)菌多樣性、 豐度和均勻度[2]，同時(shí)，細(xì)菌的種類與群落結(jié)構(gòu)對(duì)于濕地生態(tài)功能至關(guān)重要．目前對(duì)濕地細(xì)菌群落及其功能的研究主要集中在紅樹林濕地的硫代謝微生物[3]以及影響紅樹林濕地細(xì)菌區(qū)系的因素[4]，杭州西溪濕地公園的細(xì)菌多樣性、 組成和類型，用標(biāo)記基因nrfA研究上海濕地公園細(xì)菌硝酸異化性還原為氨(Dissimilatory nitrate reduction to ammonia，DNRA)涉及的高豐度微生物．有研究[5]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌豐度從高到低依次為湖球菌屬(Lacunisphaera)、 堆囊菌(Sorangium)、 氣單胞菌(Aeromonas)、 珊瑚球菌(Corallococcus)和地桿菌(Geobacter)．在濕地中還發(fā)現(xiàn)了其他細(xì)菌，如動(dòng)桿菌(Proteobacteria)、 綠彎菌(Chloroflexi)、 硬壁菌門(Firmicutes)、 酸桿菌(Acidobacteria)、 擬桿菌門(Bacteroidetes)、 硝化螺菌門(Nitrospirae)、 放線菌(Actinobacteria)、 螺旋菌門(Spirochaetae)、 浮霉菌(Planctomycetes)、 綠菌門(Chlorobi)、 脫鐵桿菌門(Deferribacteres)、 藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)、 OP8，WS3，TA06和OP11，其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為動(dòng)桿菌(Proteobacteria)、 綠彎菌門(Chloroflexi)和硬壁菌門(Firmicutes)[6]．還有研究在濕地中發(fā)現(xiàn)了降解甲苯等污染物的細(xì)菌如皮氏羅爾斯頓菌(Ralstoniapickettii)[7]．

光合細(xì)菌主要分為紫色非硫細(xì)菌、 紫色硫細(xì)菌、 綠色硫細(xì)菌和綠色絲狀菌等4類．光合細(xì)菌可以降解富營(yíng)養(yǎng)水體中的污染物，是濕地發(fā)揮生態(tài)恢復(fù)功能的關(guān)鍵細(xì)菌．在廢水處理過程中，可進(jìn)行光合作用而不產(chǎn)氧的光合細(xì)菌既可去除污染物，還可以通過生物煉制回收蛋白質(zhì)、 輔酶Q10、 5-ALA、 類胡蘿卜素、 細(xì)菌葉綠素和生物可降解塑料-聚羥基脂肪酸酯等物質(zhì)和能量，是生態(tài)友好型微生物[8]．PSB對(duì)各營(yíng)養(yǎng)型廢水的化學(xué)需氧量、 氨氮及總磷降解率可達(dá)到90%以上．光合細(xì)菌還能去除養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝態(tài)氮．光合紫色非硫細(xì)菌沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)可以作為水質(zhì)凈化的添加劑[9]．外硫紅螺菌屬(Ectothiorhodospira) 以單硫代砷酸鹽為電子供體并將其完全轉(zhuǎn)化為砷酸鹽，參與硫和碳的生物地球化學(xué)循環(huán)[10]．光合細(xì)菌還可以利用光能進(jìn)行生物脫鹽[11]．類球紅桿菌(Rhodobactersphaeroides)可以用作生物監(jiān)測(cè)和生物修復(fù)，去除放射性污染和汞污染[12]．為了防止光照產(chǎn)生活性氧和紫外損傷，光合細(xì)菌光合基因的表達(dá)受到獨(dú)特的調(diào)控．其中包括調(diào)控RNA和反義RNA，反式作用的小非編碼RNA[13]等．

但是，目前未見濕地光合細(xì)菌的研究報(bào)道，也未見生活污水對(duì)濕地光合細(xì)菌群落組成和多樣性的影響的研究．研究濕地光合細(xì)菌群落及其變化，將有助于豐富對(duì)濕地細(xì)菌區(qū)系及其功能的認(rèn)識(shí)．光反應(yīng)中心復(fù)合體的M亞基的編碼基因pufM是目前研究光合細(xì)菌的主要標(biāo)記基因．單拷貝的pufM基因廣泛用在光合細(xì)菌的鑒定[14-22]或者定量[23]．pufM用作光合細(xì)菌生態(tài)研究的一般流程是擴(kuò)增樣品的pufM基因，構(gòu)建文庫、 測(cè)序．本研究第一次揭示了濕地光合細(xì)菌種類、 群落結(jié)構(gòu)，以及生活污水排放的影響，為認(rèn)識(shí)濕地中光合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、 生態(tài)學(xué)作用，以及關(guān)鍵功能菌的富集培養(yǎng)、 分離和后續(xù)的基因組、 生物化學(xué)、 菌種之間相互作用提供了基礎(chǔ)．

1 材料和方法

1.1 樣品的材料和處理

采集重慶北碚馬鞍溪濕地公園淤泥樣品(上游T1608A_B28和下游T1608A_B27，北緯29°49′33″，東經(jīng)106°25′0″，上下游距離300 m，排污口位于上下游中間，距離上游50 m處)，裝入含DNA保護(hù)液的采集管．樣品用MIO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit抽提基因組DNA．樣品一式3份．

1.2 PCR 擴(kuò)增及文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建采用兩步PCR擴(kuò)增的方法，首先采用特異引物(即內(nèi)側(cè)引物)擴(kuò)增目的片段，pufM基因引物序列F 5′-TACGGSAACCTGTWCTAC-3′，R 5′-AYNGCRAACCACCANGCCCA-3′．膠回收目的片段作為模板進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增(即外側(cè)引物)，將illumina平臺(tái)測(cè)序所需的接頭，測(cè)序引物，barcode添加到目的片段的兩端．

引物如下：

F內(nèi)側(cè)引物： 5′-TTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-特異引物-3′

F外側(cè)引物： 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-barcode-TCTTTCCCTACACGACGCTC-3′

R內(nèi)側(cè)引物： 5′-GAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-特異引物-3′

R外側(cè)引物： 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA-3′

第1次PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系： 5xBuffer 10 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，Phusion超保真DNA聚合酶1U，F(xiàn)/R內(nèi)側(cè)引物(10 μmol/L) 各1 μL，模板5～50 ng，ddH2O補(bǔ)至50 μL．ABI9700 PCR儀PCR擴(kuò)增程序： 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，10 ℃保溫．取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)．

第2次PCR擴(kuò)增 切取第1次PCR凝膠電泳產(chǎn)物，采用AXYGEN 公司的 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒回收．回收產(chǎn)物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增．第2次PCR擴(kuò)增的體系與第一次類似，只是循環(huán)為8次．取3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)．

文庫構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收(電泳槽保持干凈，更換電泳緩沖液)．采用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收．回收產(chǎn)物進(jìn)行qPCR定量．FTC-3000TM real-time PCR儀實(shí)時(shí)熒光定量，樣本按照等摩爾比混勻后完成文庫制備．

1.3 測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析

微基生物科技(上海)有限公司Illumina MiSeq 2×300 bp多個(gè)樣品混合測(cè)序．根據(jù)標(biāo)示樣本來源的barcode標(biāo)簽序列區(qū)分、 提取各個(gè)樣品的數(shù)據(jù)，以fastq格式保存．特異引物去除序列中可能含有的模糊堿基、 單堿基高重復(fù)區(qū)以及PCR過程中產(chǎn)生嵌合體．過濾拼接的長(zhǎng)Reads中的singletons(對(duì)應(yīng)reads只有一條的序列)，進(jìn)行聚類OTU(operational taxonomic units)．采用軟件為mothur V.1.39.5．

1.3.1 OTU聚類

將OTU代表序列與NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，找到相似度最高的已知物種的信息，排除未培養(yǎng)的環(huán)境樣本信息，將該物種的分類信息注釋為對(duì)應(yīng)OTU的物種分類信息，通過物種信息的登錄號(hào)得到各個(gè)級(jí)別的分類信息．

1.3.2 物種分類學(xué)統(tǒng)計(jì)

將OTU綜合分類表中的信息按門、 綱、 目、 科、 屬、 種6個(gè)分類水平提取，分別統(tǒng)計(jì)各樣品在不同分類水平比對(duì)上的序列數(shù)．

1.4 BLAST分析

序列用NCBI數(shù)據(jù)庫手動(dòng)去掉載體，應(yīng)用BLASTn程序與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對(duì)搜索，選擇同源性最高的3條序列為參比序列．采用ClustalX 2軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)，然后以Kimura-2模型計(jì)算進(jìn)化距離，以鄰接法和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.5 多樣性指數(shù)和樣品聚類分析

通過MOTHUR (http： //www.mothur.org/wiki/Main_Page)軟件進(jìn)行序列的操作OTU的聚類，以Cutoff=0.03為閾值劃分OTU．并用GenoDive軟件(http： //genodive.org/)計(jì)算出多樣性相關(guān)指數(shù)： 有效基因型數(shù)、 基因型多態(tài)性指數(shù)、 均勻度指數(shù)、 香農(nóng)-威納指數(shù)、 修正香農(nóng)-威納指數(shù)、 未校正的基因型多樣性指數(shù)．覆蓋率運(yùn)用公式：Rcov=1-(N/nInd)計(jì)算，N為整個(gè)文庫中只出現(xiàn)一次的克隆子數(shù)目；nInd為文庫中篩選出來的總的陽性序列數(shù)目．稀釋曲線運(yùn)用POST軟件計(jì)算，Excel繪圖．

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增獲得了pufM片段

取第1次擴(kuò)增的3 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1a．顯示成功擴(kuò)增pufM．圖1b為第2次PCR擴(kuò)增結(jié)果．圖中可見條帶單一，亮度適中，可進(jìn)行后續(xù)膠回收實(shí)驗(yàn)．

分子量Marker為DL2000，從上至下條帶依次為2 000 bp，1 000，bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp，上樣量為3 μL，亮帶為30 mg/L，其余條帶均為10 mg/L．圖1 兩次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 兩個(gè)樣點(diǎn)的光合細(xì)菌測(cè)序深度合理

每個(gè)采樣點(diǎn)采集3個(gè)樣品，以下數(shù)據(jù)僅呈現(xiàn)代表性的結(jié)果．T1608A_B27和T1608A_B28兩個(gè)樣本的優(yōu)化序列數(shù)分別為10，576和16，494．為了確定樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理，比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，從樣本序列中隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線．當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，反之則表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU．從稀釋曲線(圖2)可看出光合細(xì)菌的測(cè)序數(shù)量合理，多樣性采集較為充分．

2.3 生活污水排放影響光合細(xì)菌物種豐度和物種均勻度

為了分析生活污水排放對(duì)光合細(xì)菌多樣性的影響，統(tǒng)計(jì)兩個(gè)采樣點(diǎn)6份樣品的結(jié)果．下文描述其中代表性樣品中每一個(gè)OTU所含的序列數(shù)，將OTUs按豐度(所含有的序列條數(shù))由大到小的等級(jí)排序，再以O(shè)TU等級(jí)為橫坐標(biāo)，以每個(gè)OTU中所含的序列數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，構(gòu)建豐度等級(jí)圖．從圖3可見，生活污水排放影響馬鞍溪濕地光合細(xì)菌的多樣性，這體現(xiàn)在生活污水排放影響樣品中光合細(xì)菌群落的豐富度，即群落中光合細(xì)菌的種類多少，不考慮群落中每種光合細(xì)菌的豐度．這可以用chao指數(shù)和ace指數(shù)衡量，指數(shù)越大，說明樣品中的物種越豐富．

圖中水平方向，曲線的寬度反映物種的豐度，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大； 曲線的形狀(平滑程度)反映了樣品中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻．

圖2 稀釋曲線表明兩處樣品的測(cè)序深度符合要求

圖3 生活污水排放影響濕地光合細(xì)菌多樣性

從表1中可見，無生活污水排放的樣品T1608A_B27中，光合細(xì)菌的種類較多，但進(jìn)一步分析顯示主要集中在低豐度的光合細(xì)菌．生活污水排放降低了低豐度光合細(xì)菌的種類和數(shù)量．

表1 兩個(gè)采樣點(diǎn)的多樣性指數(shù)

生活污水排放影響群落的多樣性．群落多樣性受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響．相同物種豐富度的情況下，群落中各物種均勻度越大，則群落多樣性越大．香農(nóng)-威納指數(shù)越大，說明物種越豐富．從表中可見，無生活污水排放的T1608A_B27樣品中，香農(nóng)-威納指數(shù)更大，提示光合細(xì)菌群落多樣性更大．而生活污水排放，降低了光合細(xì)菌的多樣性．辛普森指數(shù)越小，說明樣品中的物種越豐富．從表中可見，未受生活污水排放樣品的辛普森指數(shù)更小，說明其中物種更豐富．

為了找出兩個(gè)樣點(diǎn)中相同的光合細(xì)菌，選用相似水平為 97%的OTU樣品，構(gòu)建維思圖．從圖4a可見，兩個(gè)樣本中115個(gè)OTU相同，相似度達(dá)到76%，提示OTU組成非常相似．

為了分析兩個(gè)樣點(diǎn)間的差異和距離，我們分析兩個(gè)代表性樣品OTU(97%相似性)組成，進(jìn)行主成分分析PCA(Principal Component Analysis)．根據(jù)每個(gè)樣品OTU在每個(gè)樣品的豐度文件計(jì)算出每個(gè)OTU在每個(gè)樣品的比例，利用這個(gè)比例信息進(jìn)行OTU的PCA分析．從圖4b可見，生活污水排放對(duì)光合細(xì)菌的影響大．

生活污水排放對(duì)兩個(gè)樣點(diǎn)的光合細(xì)菌多樣性影響很大．圖4c顯示生活污水排放后，光合細(xì)菌的beta多樣性也明顯降低，辛普森指數(shù)更高，提示β多樣性降低．

2.4 生活污水通過影響光合細(xì)菌群落中的少數(shù)種類而改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)

為了確定生活污水排放對(duì)光合細(xì)菌群落中哪些具體類群有顯著影響，比較了兩個(gè)樣品中具體的微生物種類和相對(duì)豐度(序列數(shù))．我們分別從綱、 屬和種3個(gè)水平進(jìn)行了分析．從圖5a可見，在綱水平上，組成都是α-變形菌、 β-變形菌和γ-變形菌．但是，生活污水排放處的β-變形菌是無生活污水的近3倍，α-變形菌和γ-變形菌在無生活污水排放點(diǎn)則是有污水排放的近3倍．這提示生活污水排放顯著改變綱水平的光合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)．從圖5b可見，在屬水平上，生活污水排放后，明顯增多的是紅長(zhǎng)命菌(Rubrivivaxgelatinosus)，湖棲菌(Limnohabitanssp. Hippo3)，明顯降低的是甲基桿菌(Methylobacteriumaquaticum)，海洋著色菌(Marichromatiumpurpuratum)，檸檬色微菌(Citromicrobiumsp. JL477)和紅桿菌(Rhodobacter)．

圖4 生活污水排放顯著影響光合細(xì)菌

圖5c顯示，生活污水排放后，在種水平上明顯增多的是膠狀紅長(zhǎng)命菌(Rubrivivaxgelatinosus)和湖棲菌(Limnohabitanssp. Hippo3)，明顯降低的有水生甲基桿菌(Methylobacteriumaquaticum)、 紫色海洋著色菌(Marichromatiumpurpuratum)和檸檬色微菌(Citromicrobiumsp. JL477)．

3 討 論

為了探討生活污水排放對(duì)濕地光合細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)的影響，采用pufM標(biāo)記基因，比較了濕地生活污水排放口上下游兩個(gè)樣點(diǎn)中光合細(xì)菌的差異．pufM基因是光合操縱子中的一個(gè)相對(duì)保守的基因，在億萬年的演化后依然同源性很高，常被作為光合細(xì)菌分子生態(tài)的標(biāo)記基因．

圖5 生活污水排放影響光合細(xì)菌多樣性

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的差異較大的幾種光合細(xì)菌都報(bào)道過在污水處理中具有重要作用．膠狀紅長(zhǎng)命菌是紫色非硫細(xì)菌類光合細(xì)菌(non-sulfur photosynthetic bacterium)，可以改善水質(zhì)[24]，是兼性光異養(yǎng)，生活在淡水環(huán)境如小池塘、 食品加工廢水、 活性污泥和下水道中．這與生活污水排放處該菌數(shù)量增加比較吻合．根據(jù)環(huán)境條件，膠狀紅長(zhǎng)命菌可以在浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)下生長(zhǎng)[25-26]．同時(shí)，其代謝能力多樣，可以光能營(yíng)養(yǎng)，也可以化能營(yíng)養(yǎng)，發(fā)酵，產(chǎn)氫(H2)[27]，全基因組序列也包含了相應(yīng)基因[28]．Mg2+[29]、 Fe3+[30]均可提高膠狀紅長(zhǎng)命菌生物量．膠狀紅長(zhǎng)命菌可以一氧化碳作為唯一碳源、 水作為電子受體產(chǎn)生CO2和H2[31]．

湖棲菌(Limnohabitans)屬細(xì)菌是全球淡水生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌[32]，也是硫氧化菌，還參與氮循環(huán)，利用細(xì)菌葉綠素a捕獲光能[33]進(jìn)行光自養(yǎng)，是好氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌．湖棲菌基因組具有光合基因簇、 RuBisCO、 一氧化碳脫氫酶、 氨單加氧酶和硫氧化基因[32]，提示代謝能力多樣化．營(yíng)養(yǎng)會(huì)影響湖棲菌豐度[34-36]．城市河流中，湖棲菌屬細(xì)菌的豐度與溶解有機(jī)物的數(shù)量正相關(guān)[37]．這與我們發(fā)現(xiàn)生活污水排放處其豐度顯著增加也非常吻合．根據(jù)營(yíng)養(yǎng)條件不同，Limnohabitans 屬菌可能入侵，改變?cè)屑?xì)菌區(qū)系生態(tài)，維持細(xì)菌多樣性[38]．Limnohabitans 屬菌也是研究入侵物種對(duì)微生物區(qū)系影響的理想模式菌．

生活污水排放降低了水生甲基桿菌(Methylobacteriumaquaticum)豐度．鑭系元素是甲基營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌XoxF-型甲醇脫氫酶的必需因子[39]．與植物共棲的水生甲基桿菌基因組具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和利用植物釋放的甲醇的基因[40]，這提示該類菌可能與水生植物一起發(fā)揮作用．

紫色海洋著色菌(Marichromatiumpurpuratum)屬于紫色硫細(xì)菌，其硫代硫酸脫氫酶含有兩個(gè)血紅素，屬于c-型細(xì)胞色素[41]，它們會(huì)積累元素硫[42]．

檸檬色微菌(Citromicrobium)在寡營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中廣泛存在[43]，也屬于好氧不產(chǎn)氧光合細(xì)菌．生活污水排放點(diǎn)其豐度降低，與其在寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中廣泛存在吻合．

當(dāng)然，本研究DNA水平的結(jié)果只能反映環(huán)境中光合細(xì)菌整體的多樣性，不能反映出群落中光合細(xì)菌的生存能力、 代謝活力以及生長(zhǎng)力，也不知優(yōu)勢(shì)光合細(xì)菌pufM表達(dá)水平高低和功能．下一步需要在轉(zhuǎn)錄水平以及生態(tài)功能水平研究濕地光合細(xì)菌，特別是分離這些光合細(xì)菌，比較它們處理生活污水的能力．