楊少青，周彬，邵春艷，宋泉江，宋厚輝*，王曉杜*，姜?jiǎng)?

(1. 浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖應(yīng)用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；3. 動(dòng)物健康互聯(lián)網(wǎng)檢查技術(shù)浙江省工程實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300)

壬基酚(nonylphenol，NP)是非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚(NPEOs)的主要降解產(chǎn)物和中間體，廣泛存在于土壤、空氣和水中[1-2]。壬基酚具有一定的雌激素活性，屬環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)[3]，能夠通過(guò)水體、土壤和空氣進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，并通過(guò)食物鏈富集放大，嚴(yán)重影響動(dòng)物和人類健康及水生生態(tài)系統(tǒng)安全[4]。研究發(fā)現(xiàn)NP對(duì)動(dòng)物和人類具有多器官毒性作用[5-9]，而且在人尿樣和脂肪組織中檢測(cè)到NP[10-11]。最近的研究表明，接觸EEDs會(huì)增加代謝紊亂的風(fēng)險(xiǎn)，如脂肪變性、肥胖和II型糖尿病等[12-15]。目前，NP對(duì)人類及動(dòng)物健康的影響已不容忽視。因此，本研究探討了NP染毒對(duì)小鼠肝腎損傷效應(yīng)，為研究NP促發(fā)脂肪肝性疾病和腎臟疾病作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

壬基酚(NP，純度≥99%)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；玉米油購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

清潔級(jí)ICR小鼠(40只，雌雄各半，體重18～23 g)購(gòu)自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為20201225Abzz0105999790。小鼠飼養(yǎng)于溫控凈化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，環(huán)境溫度保持24～26 ℃，飼喂商品化顆粒飼料和清潔飲水。飼喂1周后，小鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組(CON)和低(LNP)、中(MNP)、高劑量(HNP)NP染毒組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)期間每天于上午9：00，采用口服灌胃法進(jìn)行染毒試驗(yàn)，CON小鼠給予玉米油，LNP小鼠給予100 mg/kg NP，MNP小鼠給予150 mg/kg NP，HNP小鼠給予200 mg/kg NP。各組灌胃體積為0.01 mL/kg，每晚21:00禁食，連續(xù)灌胃30 d，每天1次。每日觀察小鼠精神狀態(tài)、飲水與采食情況、排便排尿情況等。每5 d測(cè)量小鼠的體重變化并調(diào)整灌胃量。

1.3 體重日均增重量及肝腎臟器系數(shù)測(cè)定

染毒30 d結(jié)束后，小鼠稱重計(jì)算體重日均增重率，日均增重率=(試驗(yàn)后體重-試驗(yàn)前體重)/試驗(yàn)天數(shù)。稱重結(jié)束后小鼠處死，迅速分離肝臟和腎臟進(jìn)行稱重，并計(jì)算肝或腎臟器系數(shù)(肝或腎臟器系數(shù)=肝或腎重量/體重×100%)；取部分肝腎組織用于病理形態(tài)學(xué)分析，其余組織-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠肝臟和腎臟組織病理學(xué)觀察

每組取適量肝臟和腎臟組織至于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟和腎臟顯微結(jié)構(gòu)變化。

1.5 小鼠肝功和腎功參數(shù)的測(cè)定

小鼠處死前，經(jīng)頜下靜脈采血0.5 mL，室溫靜置10 min后3 500 r/min離心10 min，取適量血清，使用動(dòng)物專用生化分析儀檢測(cè)肝功和腎功參數(shù)：谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、血尿素(UREA)和血清磷(P)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，使用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)配對(duì)差異分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 體重日均增長(zhǎng)量及臟器系數(shù)

試驗(yàn)過(guò)程中，各組試驗(yàn)小鼠均未出現(xiàn)死亡，對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，采食量和飲水量均正常；低劑量NP染毒小鼠精神狀態(tài)未見(jiàn)明顯異常，但采食量和排便量均稍減少，中高劑量NP染毒小鼠精神狀態(tài)尚可，被毛稍顯粗亂，欠光澤，采食量和排便量下降，各組小鼠活動(dòng)能力未見(jiàn)明顯異常。經(jīng)過(guò)30 d染毒，各組染毒小鼠的日均增重量隨著NP劑量的增加而降低，且均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；與CON比較，LNP、MNP和HNP小鼠的肝體系數(shù)顯著升高(P<0.05)；CON相比，各染毒組小鼠腎體系數(shù)無(wú)顯著性變化(P>0.05)?？傮w而言，隨著NP染毒劑量增加，小鼠增重量逐漸降低，增重量與NP染毒劑量呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明NP染毒可影響小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。各組小鼠體重日均增長(zhǎng)量和臟器系數(shù)見(jiàn)圖1。

*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。下同

2.2 肝臟和腎臟組織病理學(xué)檢測(cè)

如圖2所示，LNP小鼠肝臟中央靜脈周圍可見(jiàn)少量肝細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松淡染(黑色箭頭)，少量肝細(xì)胞輕度脂肪變性，胞質(zhì)中可見(jiàn)較小的圓形空泡(黃色箭頭)；MNP小鼠肝細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松淡染(黑色箭頭)；局部匯管區(qū)門靜脈周圍可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(黃色箭頭)；HNP小鼠肝臟中央靜脈周圍可見(jiàn)大量肝細(xì)胞水腫，胞質(zhì)疏松淡染(黑色箭頭)；肝細(xì)胞脂肪變性，胞質(zhì)中可見(jiàn)較小的圓形空泡(黃色箭頭)。如圖3所示，LNP小鼠腎臟局部腎小囊腔內(nèi)有少量嗜酸性物質(zhì)(黑色箭頭)；MNP小鼠腎臟腎小管擴(kuò)張(黑色箭頭)；局部可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫(黃色箭頭)；HNP小鼠腎臟有大量腎小囊腔萎縮(黑色箭頭)。

A. CON組；B. LNP組；C. MNP組；D. HNP組

A. CON組；B. LNP組；C. MNP組；D. HNP組

2.3 肝功和腎功參數(shù)檢測(cè)

小鼠經(jīng)過(guò)不同劑量NP灌胃后血清肝功和腎功參數(shù)的變化見(jiàn)圖4和圖5。與CON比較，LNP、MNP和HNP小鼠血清AST和ALP含量均顯著升高(P<0.05)，HNP小鼠血清ALT和TP含量顯著升高(P<0.01)，HNP小鼠血清ALB含量顯著降低(P<0.01)；與LNP比較，HNP小鼠血清AST、ALT和TP含量均顯著升高(P<0.05)；與MNP比較，HNP小鼠血清ALT和TP含量均顯著升高(P<0.05)。各組小鼠血清中TBIL含量均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。與CON比較，MNP和HNP小鼠血清UREA和血清P含量均顯著升高(P<0.05)，LNP小鼠血清P含量顯著升高(P<0.05)，LNP、MNP和HNP小鼠血清CREA含量無(wú)顯著性變化(P>0.05)；與LNP比較，MNP和HNP小鼠血清P含量均顯著升高(P<0.01)；與MNP比較，HNP小鼠血清P含量顯著升高(P<0.01)。

圖4 不同劑量NP對(duì)小鼠血清肝功參數(shù)的影響

圖5 不同劑量NP對(duì)小鼠血清腎功參數(shù)的影響

3 討論

NP是一種典型的內(nèi)分泌干擾物，在環(huán)境中檢出率較高，而且在卵巢、肝臟、腎臟等器官及血清中容易蓄積[16]。研究表明NP能夠與雌激素受體結(jié)合，破壞組織器官氧化應(yīng)激平衡狀態(tài)[17]，從而破壞機(jī)體內(nèi)分泌狀態(tài)及代謝器官(如肝臟)的生理功能[18]。本研究中經(jīng)不同劑量NP灌胃30 d后，小鼠體重增長(zhǎng)量隨著NP劑量的增加而降低，說(shuō)明NP染毒抑制小鼠體重增長(zhǎng)，這與大鼠的研究結(jié)果保持一致[19]。臟體系數(shù)是一種反映毒物對(duì)動(dòng)物機(jī)體臟器毒害作用的綜合性參數(shù)，可反映該臟器長(zhǎng)期受影響的情況，是亞慢性毒性試驗(yàn)中較為常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。組織臟體系數(shù)增加，預(yù)示該臟器可能出現(xiàn)增生、肥大、水腫或充血；組織臟體系數(shù)下降，預(yù)示染毒后該臟器出現(xiàn)了萎縮或其他退行性病變[20]。因此，臟體系數(shù)變化可提示臟器組織形態(tài)病理學(xué)的變化[21]。本研究中NP染小鼠肝臟臟體系數(shù)增加，腎臟臟體系數(shù)降低，這也與已有研究結(jié)果保持一致[21]，說(shuō)明肝臟和腎臟是NP毒性效應(yīng)器官之一。綜合小鼠體重增長(zhǎng)量和臟體系數(shù)的變化，說(shuō)明NP染毒可影響小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。

肝臟是機(jī)體主要的解毒和代謝器官，參與機(jī)體的解毒、代謝、排泄等多種生理功能。AST和ALT是最為常見(jiàn)的表征肝功能的生物標(biāo)志物[22-24]。AST通常僅存在于肝臟，而ALT也見(jiàn)于骨骼肌、腎臟、大腦和紅細(xì)胞中。正常情況下，血中ALT和AST水平較低，但肝細(xì)胞受到損害或肝細(xì)胞膜通透性增加后，ALT和AST會(huì)由細(xì)胞中滲出，轉(zhuǎn)入血液循環(huán)[25]。肝功能異常不僅表現(xiàn)在血清中AST、ALT升高，血中ALB降低也能說(shuō)明肝功能異常[26]。當(dāng)肝臟受損時(shí)，經(jīng)由肝細(xì)胞合成的ALB合成量減少，因此血清中ALB水平降低顯示肝細(xì)胞合成功能降低。本研究中肝臟損傷標(biāo)志物AST與NP劑量呈正相關(guān)，小鼠血清AST水平隨著NP劑量的增加而增加。血清中ALT和ALB水平變化雖與NP劑量未呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，但高劑量NP染毒小鼠ALT高于對(duì)照組，而ALB則低于對(duì)照組。因此本研究結(jié)果表明，NP染毒30 d對(duì)小鼠肝臟造成一定損傷。另外肝臟組織病理學(xué)分析結(jié)果也可印證，各組NP染毒小鼠肝臟組織均出現(xiàn)水腫和脂肪變性，而且發(fā)生水腫的肝細(xì)胞數(shù)量隨著NP染毒劑量的增加而增加，表明NP進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，在肝臟中蓄積，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生水腫，進(jìn)一步提示肝損傷的發(fā)生，這也與小鼠肝臟臟體系數(shù)結(jié)果相呼應(yīng)。這可能跟NP具有親脂性，容易在肝臟組織中蓄積有關(guān)[16]。研究表明，NP可破壞小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的完整性、促進(jìn)肝細(xì)胞ALT和AST的釋放，抑制肝細(xì)胞合成功能，導(dǎo)致肝損傷。

腎臟的基本功能是生成尿液，它是機(jī)體清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及某些廢物、毒物的重要器官。本研究結(jié)果顯示，不同劑量NP染毒30 d小鼠腎臟臟體系數(shù)并未發(fā)生明顯改變，無(wú)顯著性差異，表明NP暴露可能并未對(duì)腎臟造成顯著的形態(tài)學(xué)損傷。血中尿素和肌酐含量是指示腎功能的標(biāo)志物，血中二者水平的升高提示腎功能障礙[27]。有研究發(fā)現(xiàn)NP具有一定的腎毒性，會(huì)導(dǎo)致血中與腎功能有關(guān)的指示物(如尿酸、肌酐和葡萄糖等)發(fā)生紊亂[28]。本研究結(jié)果也證實(shí)，NP染毒后，小鼠血中尿素水平顯著提高，而肌酐未發(fā)生顯著性變化，提示NP可能引起小鼠腎功能損傷，使得腎臟排泄尿素的能力下降。通過(guò)HE染色對(duì)腎臟組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腎臟腎小囊腔內(nèi)有少量嗜酸性物質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫，高劑量NP導(dǎo)致小鼠腎臟腎小囊腔萎縮，說(shuō)明NP對(duì)小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)造成一定損傷。這與NP暴露3周對(duì)魚(yú)腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果保持一致[29]。

綜上所述，NP暴露對(duì)小鼠具有肝腎多毒性效應(yīng)，可引起小鼠肝臟和腎臟發(fā)生不同程度的損傷，影響肝腎功能和組織結(jié)構(gòu)。但鑒于暴露方式、暴露劑量、機(jī)體代謝及環(huán)境分布等多因素變量影響，NP對(duì)肝腎毒性的具體作用機(jī)制尚未闡明，因此NP肝腎毒性機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。