藺蕙,潘陽陽,韓小紅,蔡得琪,王萌,盧國杰,柯良備,王瑞剛,王學義,余四九*

(1. 甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070；2. 金川區(qū)農業(yè)農村局，甘肅 金川 737100；3. 西吉縣農業(yè)農村局，寧夏 西吉 756299)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在青藏高原及其周圍高海拔地區(qū)，適應高寒、低氧的特有物種[1-2]。睪丸作為雄性動物產生精子傳遞遺傳信息的重要生殖器官，其發(fā)育的優(yōu)良影響動物的繁殖性能[3]。哺乳動物精子生成包括精原細胞有絲分裂為精母細胞以及精母細胞經過減數分裂形成單倍體的精細胞；精子發(fā)生的后期要經歷變態(tài)反應，這一過程伴隨著一些階段特異性基因的表達[4-5]。圓形精子細胞要準確的分化為成熟精子，其階段特異性基因必須在一定的時間準確表達[6]。

過渡蛋白(TNPs)是精子發(fā)生過程中的一個重要蛋白家族，TNP2為過渡蛋白家族的成員之一[7-13]，其主要在精子細胞中表達，調控精子發(fā)生過程中組蛋白-核蛋白轉換[14]；如果TNPs發(fā)生異常，就會導致精子畸形的變化和雄性不育[7]。TNP2在圓形精子細胞中特異表達，其缺失會導致精子畸形，進而影響精子的獲能及與卵細胞的融合[8]，精子運動能力也會降低；TNP2 mRNA過早翻譯會導致精子畸形的比例增加及運動速度降低，也是導致雄性不育的主要原因之一[6]。上述研究表明，TNP2在雄性動物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中起著重要作用。

目前，TNP2基因在人、牛、綿羊及小鼠上已得到成功克隆，并且在小鼠、大鼠睪丸中表達的研究[11]提示其在睪丸相關功能方面起著重要作用，但目前尚未見關于牦牛TNP2基因以及其在睪丸發(fā)育中的表達方面的報道。本試驗通過克隆牦牛TNP2基因編碼區(qū)序列進行分子特征分析；通過免疫組織化學(IHC)技術檢測TNP2蛋白在牦牛睪丸組織中的表達定位；通過熒光定量PCR(RT-qPCR)技術檢測TNP2在牦牛睪丸組織中的mRNA表達；通過免疫印跡(Western blot)技術檢測TNP2在牦牛睪丸組織中的蛋白表達，以期闡明牦牛TNP2 基因的分子遺傳特性及其在牦牛睪丸發(fā)育中的表達情況，為進一步探討其在牦牛精子發(fā)生過程中發(fā)揮的作用及提高牦牛繁殖性能提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

根據韓杰等[15]和李忠邦等[16]對不同發(fā)育階段牦牛的分類方法及何靜宜[17]對牛年齡的判斷方法，選取初生期(0～1歲)、幼年期(1～2歲)、性成熟初期(2～3歲)、性成熟后期(3～7歲)、老年期(7～11歲)公牦牛各5頭，處死以后迅速解剖睪丸組織，用無菌生理鹽水將其沖洗干凈，一部分包裹上錫箔紙并放入布袋中，快速投入液氮并帶回實驗室，存放在-80 ℃冰箱備用；另一部分利用4%多聚甲醛固定，存放在4 ℃的冰箱中以備用。

1.2 儀器和試劑

Total RNA Kit I(50)購自OMEGA公司；Go ScriptTMReverse Transcription System和GoTaq?Green Master Mix,2×購自Promega公司；SYBR?Premix ExTaqTMEraserTM(Tli RNaseH Plus)購自TaKaRa公司；pMDTM19-T Vector Cloning Kit(大連寶生物工程有限公司)；普通PCR儀(T100TMThermal Cycler，Rio-Rad公司,美國)；恒溫培養(yǎng)箱(日本松下電器有限公司)；熒光定量PCR儀(ABI ViiA7，Life Technologies公司，美國)；顯微鏡(DP71，Olympus,日本)； 一抗STP2(DBEl)XP?Rabbit mAb(Bioss公司)；二抗羊抗兔IgG(Bioss公司)；陽離子防脫片購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色液、顯/定影液、SP試劑盒購自Bioss公司。

1.3 RNA的提取與cDNA的合成

將存放在-80 ℃冰箱中備用的各發(fā)育階段牦牛睪丸組織樣品按RNA抽提試劑盒Total RNA Kit I(50)的說明書提取總RNA，并將總RNA按照反轉錄試劑盒Go ScriptTMReverse Transcription System說明書反轉錄，將cDNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.4 引物設計

根據GenBank數據庫中牛TNP2基因和牦牛β-actin基因的mRNA序列通過primer-Blast設計引物(引物序列見表1)。引物1用于擴增牦牛TNP2基因序列，引物2用于RT-qPCR檢測其TNP2在不同發(fā)育階段組織的表達差異；引物3(β-actin)用于內參對照,由上海生工基因科技有限公司合成引物。

表1 引物序列

1.5 牦牛TNP2基因的克隆

牦牛TNP2基因的擴增：PCR反應條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數40；72 ℃保存5 min,4 ℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增產物。

構建重組質粒：取一個200 μL的無RNA酶離心管，加入2 μL PCR擴增產物、1 μL pMDTM19-T Vector(20 μL)、5 μL pMDTM19-T Vector(75 μL)、2 μL ddH2O，在普通PCR儀中于16 ℃條件下作用30 min，將反應后的所有液體加入大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109中，輕輕置于冰上30 min后,于42 ℃的水浴鍋中作用45 s，再于冰中作用1 min，吸取890 μL SOC培養(yǎng)基加入作用后的JM109中輕輕混勻，置于搖床(37 ℃，180 r/min)上培養(yǎng)60 min。取培養(yǎng)產物涂在含有Amp、X-gal、IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，挑選單個白色菌落于無菌水中以其作為DNA模板進行PCR擴增，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測有無單一條帶。若條帶單一，將剩余液體接種到1 mL液體培養(yǎng)基中搖床(37 ℃，180 r/min)培養(yǎng)過夜，次日取菌液送北京華大基因科技有限公司測序。

5年來，為提升食品藥品監(jiān)管的公信力，中心先后建立督辦制度，對重要案件實施跟蹤指導；全面實施首日先行聯(lián)系制度，確保投訴舉報人第一時間得到回應；落實和宣傳舉報獎勵制度，制定了《舉報人信息保護工作制度》，鼓勵“深喉”和企業(yè)內部知情人員積極提供違法違規(guī)線索。

1.6 牦牛TNP2基因分子特征分析

對測序成功的基因序列，用在線軟件NCBI-ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)進行開放閱讀框分析；用NCBI在線軟件進行比對，分析與其他物種的同源性，選擇12種其他物種的TNP2序列，將其核苷酸序列及氨基酸序列與其他物種的核苷酸序列及氨基酸序列進行同源性比對，并用MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹。用在線軟件ExPASY(https://www.expasy.org/)分析其蛋白質結構，包括：跨膜區(qū)、疏水性、蛋白理化性質、磷酸化位點、N-糖基化位點、蛋白質二級結構、蛋白質三級結構。

1.7 RT-qPCR檢測TNP2的mRNA表達

引物2和引物3進行普通PCR擴增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。RT-qPCR反應體系(20 μL)：SYBR?Premix ExTaqTMEraserTM(2×)10 μL、模板cDNA 2 μL、上游和下游引物各0.5 μL、去離子水7 μL，并每組做4次重復，進行熔解曲線檢測，用2-ΔΔCt法計算TNP2基因的相對表達量。

1.8 IHC檢測TNP2蛋白在牦牛睪丸中的表達定位

采用王靜瑜等[18]的免疫組織化學法，制作石蠟切片經過脫水至蠟，抗原修復，阻斷，封閉，孵育一抗，二抗反應，DAB顯色，自來水中終止，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，自來水反藍，脫水透明最后樹脂封片并顯微鏡拍照。

1.9 Western blot檢測TNP2蛋白的表達

采用韓小紅等[19]的免疫蛋白印跡法，提取不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織蛋白樣品，制膠并進行SDS-PAGE；采用PVDF膜制作“三明治”轉膜；在5%脫脂奶粉中封閉6 h；置于一抗工作液(STP2(DBEl)XP?Rabbit mAb∶5%脫脂乳=1∶100)4 ℃過夜，次日，PBST清洗，將膜置于二抗工作液(羊抗兔IgG∶5%脫脂乳=1∶1 000)室溫搖床孵育1 h，PBST清洗；將曝光液(A∶B=1∶1)滴加于膜上用化學發(fā)光儀曝光成影并掃描圖片。

1.10 數據統(tǒng)計與分析

對每個樣品分別進行3次重復試驗，熒光定量結果采用2-ΔΔCt計算TNP2基因的相對表達量，蛋白免疫印跡結果利用Image J收集灰度值；所得試驗數據使用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析(單因素方差分析-多重比較)，P<0.01表示組間差異性極顯著，P<0.05表示組間差異性顯著，P>0.05表示組間差異性不顯著，所有結果用“平均值±標準誤”表示。

2 結果

2.1 牦牛TNP2基因的分子特征

2.1.1 TNP2基因的克隆和測序

引物1的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，其結果條帶單一并與預期條帶的大小基本相符。

M.D2000 DNA相對分子質量標準；1. TNP2基因

2.1.2 TNP2基因的分子特征分析

通過在線軟件預測結果顯示TNP2蛋白分子式為C602H969N201O186S2，等電點11.63；TNP2蛋白不含跨膜區(qū)和信號肽，屬于非分泌蛋白；位于78位的精氨酸(Arg)親水性最強，分值為-3.100，位于116位的丙氨酸(Ala)疏水性最強，分值為0.178，且其親水性大于疏水性，是可溶性蛋白；包含5個絲氨酸(Ser)、2個蘇氨酸(Thr)其潛力值高于閾值，為可能的O-糖基化位點；磷酸化位點分析結果顯示TNP2有12個絲氨酸(Ser)、9個蘇氨酸(Thr)、1個酪氨酸(Tyr)可能成為該蛋白的磷酸化位點。

TNP2蛋白結構預測：該蛋白由18種氨基酸組成，其脯氨酸(Pro)含量最高為21.1%，不含異亮氨酸(Ile)和甲硫氨酸(Met)(表2)；其二級結構包括α螺旋(Hh)占3.91%、延伸鏈(Ee)占5.47%、β-轉角(Tt)占1.56%和無規(guī)卷曲(Cc)占89.06%(圖2)。

表2 TNP2的氨基酸組成及占比

.開放閱讀框；.磷酸化位點；.疏水性最強的氨基酸；.親水性最強的氨基酸；.O-糖基化位點；.β-轉角；.延伸鏈；.無規(guī)卷曲；.α-螺旋

利用DNAMAN軟件將牦牛的核苷酸序列，與牛、印度水牛、瘤牛、德克薩斯白尾鹿、綿羊、山羊、火狐、白鼬、北美水獺、野豬、野駱駝及人類的TNP2核苷酸序列進行同源性比對，其結果依次為：77.1%、79.2%、79.7%、76.6%、71.0%、72.5%、64.0%、64.0%、62.0%、63.5%、63.8%及52.4%。將牦牛TNP2基因的氨基酸序列與上述物種進行同源性比對，結果顯示其與瘤牛的同源性最高為74.2%，而與人類的同源性最低為37.2%。使用軟件 MEGA 7.0，進行牦牛TNP2基因系統(tǒng)進化樹的構建如圖3所示。進化樹結果顯示牦牛TNP2基因的進化水平與瘤牛、印度水牛更近，與火狐、人類的進化水平較遠。

圖3 牦牛TNP2基因系統(tǒng)進化樹

2.2 TNP2在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中的表達

2.2.1 TNP2基因的表達情況

利用引物2和引物3進行普通PCR擴增，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，發(fā)現(xiàn)產物條帶單一，大小與預期相符(圖4)，故可用于后續(xù)RT-qPCR試驗。RT-qPCR結果顯示，牦牛TNP2基因在不同發(fā)育階段牦牛睪丸中的表達存在顯著性差異，其老年期的表達量極顯著(P<0.01)高于其他4個時期，幼年期的表達量極顯著(P<0.01)高于初生期、性成熟早期和性成熟后期，而初生期、性成熟早期和性成熟后期三者之間無顯著差異(P>0.05)(圖5)。

M.D2000 DNA相對分子質量標準；1.初生期；2.幼年期；3.性成熟初期；4.性成熟后期；5.老年期

注：不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同

2.2.2 TNP2蛋白的表達情況

Western blot結果顯示牦牛睪丸組織TNP2蛋白表達量在性成熟初期顯著(P<0.05)高于性成熟后期，性成熟后期極顯著(P<0.01)高于幼年期、老年期和初生期；在幼年期和老年期的表達量極顯著(P<0.01)高于初生期；而幼年期和老年期之間差異不顯著(P>0.05)(圖6A、6B)。說明睪丸TNP2蛋白在性成熟初期及后期的表達量高于其他發(fā)育階段。

A.Western blot分析(1.初生期；2.幼年期；3.性成熟初期；4.性成熟后期； 5.老年期)；B. 蛋白條帶灰度分析

2.3 TNP2蛋白在不同發(fā)育階段牦牛睪丸組織中的定位

免疫組織化學結果顯示，各發(fā)育階段牦牛的睪丸組織均有TNP2分布(圖7A～7D)，各個時期的陽性反應部位基本一致，圓形精子細胞和長形精子細胞呈現(xiàn)出顏色較深的棕褐色強陽性表達，睪丸間質細胞、精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞以及支持細胞等呈現(xiàn)出微弱的陽性表達；性成熟初期間質細胞染色呈現(xiàn)的棕褐色反應相對較淺；而老年期的切片中有一部分精子細胞并未呈現(xiàn)顏色較深的棕褐色反應。通過觀察發(fā)現(xiàn)TNP2蛋白在牦牛睪丸中主要表達于圓形精子細胞和長形精子細胞。

注：CST.生精小管；LC.間質細胞；S.精原細胞；PS.初級精母細胞；SS.次級精母細胞；RS.圓形精子細胞；Sp.精子；SC.支持細胞；標尺=50 μm

3 討論

近年來，TNP2蛋白在哺乳動物精子發(fā)生過程中的作用受到廣泛關注，其在牛、綿羊等動物中已成功克隆[4，7]，目前關于牦牛的TNP2基因序列尚未見報道。本試驗成功克隆了牦牛TNP2基因CDS區(qū)序列，將牦牛與其他哺乳動物核苷酸序列同源性比對，其同源性大約只有60%～80%的同源性，而氨基酸序列同源性與其余物種的同源性在50%左右，這與白音巴圖等[4]、張帥等[7]對牛、綿羊核苷酸及氨基酸序列與其他物種的同源性比較結果基本一致，進一步驗證了TNP2蛋白在哺乳動物中保守性不強[7]這一結論；其理化性質預測發(fā)現(xiàn)含有半胱氨酸為1.6%，精氨酸含量為10%左右，賴氨酸含量1.6%，這一結果與盧惠等[10]的研究結果有所不同，其原因可能是TNP2在進化過程中不夠保守。

本研究發(fā)現(xiàn)TNP2蛋白主要在圓形精子細胞和長形精子細胞中高表達，這與TNP2主要在精子細胞中表達參與組蛋白-核蛋白轉換相符[20]。TNP2在初生牦牛睪丸中表達量最低，且表達量隨著牦牛性成熟而增加，性成熟牦牛睪丸中TNP2的表達量最高，而老年牦牛的睪丸中其表達量相對下降，且老年牦牛睪丸中有部分精子細胞并未表達TNP2，其可能是老年牦牛精子不能正常成熟、精液質量下降，繁殖能力喪失的原因。此次研究發(fā)現(xiàn)TNP2蛋白的這一表達趨勢與TNP2主要表達于雄性生殖細胞減數分裂后期，主要參與精子變態(tài)過程中組蛋白-核蛋白的轉這一生化事件[14]相符。

本試驗發(fā)現(xiàn)TNP2 mRNA 在不同發(fā)育階段的牦牛睪丸中均有表達，然而其表達量具有差異，表明TNP2在睪丸發(fā)育過程中起一定的作用。TNP2基因在幼年牦牛睪丸及老年牦牛睪丸中表達量較高，而在性成熟牦牛睪丸中其表達量反而下降，這可能是睪丸中的細胞組成發(fā)生變化，在幼年期及老年期時，睪丸中成熟的長形精子數量少，而在性成熟期睪丸中成熟精子數量增多。有資料顯示，TNP2在圓形精子細胞中轉錄，但儲存在翻譯抑制狀態(tài)，一直到長形精子中被激活翻譯[8-9,20-24]。

本研究發(fā)現(xiàn)牦牛TNP2 mRNA與蛋白的表達水平不一致，出現(xiàn)相反的現(xiàn)象。資料顯示，miRNA-122a能夠抑制TNP2的轉錄以及介導TNP2的 mRNA降解[25]，故其可能在轉錄后調控哺乳動物睪丸中TNP2 的表達[10，26-27]。同樣有資料顯示，miR-469在圓形精子細胞可以抑制TNP2蛋白的翻譯，而在伸長的精子細胞中無這種抑制作用，使TNP2 mRNA能夠順利翻譯[25,28]，故TNP2 mRNA與蛋白相對表達規(guī)律不一致可能是由于非編碼RNA的調控作用所致。

綜上所述，TNP2蛋白在各年齡段的牦牛睪丸中均有表達，而且存在一定的規(guī)律性，即其在睪丸的發(fā)育以及精子的發(fā)生過程中可能起著重要作用。哺乳動物TNP2基因及氨基酸保守性不強，性成熟期牦牛睪丸TNP2基因表達高于其他發(fā)育階段，表明其可能在睪丸的發(fā)育以及精子的發(fā)生過程中起著重要作用，為進一步研究TNP2基因在牦牛繁殖中的作用提供相關資料。