范 爽，武雪亮，薛 軍，徐丹丹，韓艷君，李源睿，屈 明

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1普通外科 2中心實(shí)驗(yàn)室，河北張家口 075000

3河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000

4西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710000

我國結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢(shì)，目前結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中分別位居第3和第5位，多數(shù)患者在確診時(shí)已屬于中晚期[1]。雖然手術(shù)切除是結(jié)直腸癌臨床治療的主要手段，但藥物治療在結(jié)直腸癌治療中占比逐漸增加，當(dāng)前中低位進(jìn)展期直腸癌推薦行以氟尿嘧啶類藥物為基礎(chǔ)的新輔助放化療，目的在于提高手術(shù)切除率，提高保肛率，延長(zhǎng)患者無病生存期，而化療藥物發(fā)生耐藥是患者預(yù)后差的主要原因。因此，尋找腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗的靶點(diǎn)，從而克服腫瘤細(xì)胞耐藥性，提高化療藥物療效，開展個(gè)體化治療耐藥逆轉(zhuǎn)，已成為結(jié)直腸癌治療中亟待解決的關(guān)鍵性問題。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是臨床上治療結(jié)直腸癌的主要化療藥物之一，通過干擾腫瘤細(xì)胞DNA的合成，使其增殖受阻[2]。研究顯示，runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(runt-related transcription factor 3，RUNX3)在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，RUNX3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)，RUNX3低表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而RUNX3基因與結(jié)腸癌細(xì)胞藥物敏感性的關(guān)系尚無相關(guān)研究。本研究通過藥物濃度梯度遞增法構(gòu)建 5-FU耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT- 116/5-FU，通過siRNA技術(shù)敲低HCT- 116細(xì)胞中RUNX3的表達(dá)，初步探討了耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性及RUNX3基因與腫瘤耐藥性的關(guān)系，以期為克服腫瘤細(xì)胞耐藥性，提高化療藥物療效，開展個(gè)體化治療耐藥逆轉(zhuǎn)奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

材料RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司(批號(hào)8119436)，McCoy’S 5A培養(yǎng)基(批號(hào)2020047)和小牛血清(批號(hào)1829596)購自以色列Biological Industries公司，胰蛋白酶-EDTA消化液(批號(hào)20200422)、青鏈霉素混合液(貨號(hào)p1400)購自北京索萊寶科技有限公司，CCK- 8購自美國APExBIO公司，5-FU購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，RNA提取試劑盒(貨號(hào)DP430)、逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒(貨號(hào) KR118)、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Gree)(貨號(hào) FP205)購自天根生化科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；兔抗人RUNX3(貨號(hào)AF5188)、P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)(貨號(hào)：AF5185)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistanec-associated protein1，MRP1)(貨號(hào)：DF7148)和肺耐藥蛋白(lung resistance protein，LRP)單克隆抗體(一抗)(貨號(hào)：DF2935)購自美國Affinity公司，兔抗人GAPDH單克隆抗體(一抗)(貨號(hào)：ET1601- 4)購自杭州華安生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體(貨號(hào)：S1002)購自美國Sera Care Life Sciences公司，Western細(xì)胞裂解液、SDS配膠試劑、SDS-PAGE電泳試劑、PVDF膜和免疫印跡ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，RUNX3-siRNA- 1、RUNX3-siRNA- 2、RUNX3陰性對(duì)照序列RUNX3-NC和Lipofectamine2000購自上海吉瑪基因有限公司。

細(xì)胞及培養(yǎng)人結(jié)腸癌親本細(xì)胞株HCT- 116(上海百歐晶生物科技有限公司)置于含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)的McCoy’S 5A培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d用濃度為0.25%的胰酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。所有實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞均為活力良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株誘導(dǎo)采用低濃度梯度遞增法聯(lián)合大劑量沖擊誘導(dǎo)HCT- 116/5-FU耐藥株，5-FU作用HCT- 116細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibition concentration，IC50)值為(5.554±0.038)μg/ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT- 116細(xì)胞，逐步提高5-FU的質(zhì)量濃度，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入終質(zhì)量濃度為0.6 μg/ml(1/9 IC50)的5-FU培養(yǎng)液連續(xù)作用48 h，棄去培養(yǎng)上清液；加入不含5-FU的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)后，消化傳代，如此反復(fù)換液、傳代(0.6 μg/ml→1.7 μg/ml→2.8 μg/ml →3.9 μg/ml→5.0 μg/ml)，每種濃度沖擊5次；當(dāng)細(xì)胞在含5.0 μg/ml 5-FU培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)，以含加倍質(zhì)量濃度(10.0 μg/ml→20.0 μg/ml)大劑量5-FU培養(yǎng)液對(duì)HCT- 116細(xì)胞進(jìn)行間斷誘導(dǎo)，最終獲得對(duì)5-FU耐藥的HCT- 116細(xì)胞，將該細(xì)胞命名為HCT- 116/5-FU。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染以對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT- 116為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，待生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞融合至80%～90%，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)，并接種于6孔板內(nèi)(密度為8×104個(gè)/孔)培養(yǎng)，使其約24 h后達(dá)到待處理狀態(tài)；轉(zhuǎn)染前2 h將細(xì)胞培養(yǎng)液換成新鮮的無血清的McCoy’S 5A培養(yǎng)基，每孔加入1.5 ml，提前將購買的RUNX3-siRNA- 1、RUNX3-siRNA- 2及RUNX3-NC按說明書要求分裝好置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，引物序列見?。將5 μl RUNX3-siRNA- 1、RUNX3-siRNA- 2和RUNX3-NC加入250 μl無血清的培養(yǎng)基中，輕輕吹打數(shù)次混勻。同時(shí)將5 μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000也加入250 μl無血清培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻，靜置5 min。將稀釋好的RUNX3-siRNA- 1、RUNX3-siRNA- 2和RUNX3-NC與脂質(zhì)體混合后，輕輕吹打混勻，室溫靜置20 min。將混合液500 μl沿6孔板壁緩慢加入6孔板中，輕輕搖晃數(shù)次使其混勻，將6孔板重新放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱6 h，小心吸棄轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，換成新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24 h后檢測(cè)HCT- 116細(xì)胞中RUNX3在基因和蛋白水平的表達(dá)情況。

表1 轉(zhuǎn)染試劑序列Table 1 Sequence of transfection reagents

CCK- 8法檢測(cè)5-FU對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞親本株HCT- 116、耐藥株HCT- 116/5-FU的IC50取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期親本細(xì)胞HCT- 116、si-RUNX3組、si-NC組和耐藥細(xì)胞HCT- 116/5-FU胰酶消化后，按每孔100 μl含2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h后分別加入藥物濃度為0.9375、1.8750、3.7500、7.5000、15.0000、30.0000、60.0000、120.0000、240.0000 μg/ml 5-FU，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK- 8溶液10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定OD值。細(xì)胞存活率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100，As=實(shí)驗(yàn)孔吸光度(含有細(xì)胞、含藥培養(yǎng)基、CCK- 8孔的吸光度)，Ab=空白孔吸光度(普通培養(yǎng)基和CCK- 8孔的吸光度)，Ac=對(duì)照孔吸光度(含有細(xì)胞、普通培養(yǎng)基和CCK- 8孔的吸光度)，細(xì)胞抑制率(%)=1-細(xì)胞存活率，用GraphPad繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算藥物5-FU分別對(duì)HCT- 116、HCT- 116/5-FU、si-RUNX3組、si-NC組的IC50值。計(jì)算耐藥指數(shù)(resistance index，RI)=HCT- 116/5-FU細(xì)胞IC50/HCT- 116細(xì)胞IC50。

細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞群體倍增時(shí)間分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT- 116和HCT- 116/5-FU細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中，2.5 ml/孔；細(xì)胞培養(yǎng)1～7 d，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板每天計(jì)數(shù)3個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)，取平均值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。按 Patterson公式計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間(doubling time，TD)=T×log2/(log Nt-log No)，No指初始細(xì)胞數(shù)，Nt指終末細(xì)胞數(shù)，T指Nt-No時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

qRT-PCR檢測(cè)RUNX3、P-gp、MRP1和LRP mRNA的表達(dá)qRT-PCR測(cè)定RUNX3、P-gp、MRP1、LRP mRNA的表達(dá)，引物序列見表2。分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT- 116和HCT- 116/5-FU細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取各組總RNA，測(cè)定各組所提RNA濃度，取2 μl RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：42 ℃15 min→95 ℃3 min。產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 34 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s→60 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)，采集熒光。采用ΔΔCt相對(duì)定量法分析結(jié)果，差異水平用2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-Ct管家基因)-對(duì)照組(Ct目的基因-Ct管家基因)。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primers used for qRT-PCR

Western blot法檢測(cè)RUNX3、P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)去除6孔板中培養(yǎng)基，用PBS洗滌2 次，吸棄PBS，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μl和2 μl蛋白酶抑制物PMFS預(yù)冷的蛋白裂解液在冰上裂解，移液槍吹打混勻，裂解15 min，14 000×g離心5 min，取上清液；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取蛋白樣品50 μg，加入5×上樣緩沖液(體積比1∶1)，金屬浴100 ℃煮沸3 min后上樣。經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗體2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，然后分別加入特異性一抗，4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜3 次，每次10 min，再加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL顯色。以目的基因與GAPDH灰度值之比作為其相對(duì)表達(dá)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，方差齊性采用Dunnett檢驗(yàn)，方差非齊性采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察HCT- 116親本細(xì)胞呈單層排列，多為梭形，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，輪廓清晰，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密。HCT- 116/5-FU耐藥細(xì)胞同樣呈單層排列，細(xì)胞大小不均勻，細(xì)胞體積增大，形狀不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)顆粒增加(圖1)。

圖1 親本細(xì)胞HCT- 116和耐藥細(xì)胞HCT- 116/5-FU細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×100)Fig 1 Morphology of HCT- 116 and HCT- 116/5-FU cells(×100)

RUNX3敲低效率檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過24 h細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，si-NC組、si-RUNX3- 1組和si-RUNX3- 2組的RUNX3 mRNA表達(dá)量分別為1.294±0.203、0.534±0.023和0.343±0.049，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=51.756，P<0.001)；其中，si-RUNX3- 1組和si-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.064)，si-RUNX3- 2組明顯低于si-NC組(P=0.034)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在si-NC組、si-RUNX3- 1組和si-RUNX3- 2組RUNX3蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=208.728，P<0.001)，si-RUNX3- 1組和si-RUNX3- 2組均明顯低于si-NC組(P均<0.001)(圖2)。

Mr：相對(duì)分子質(zhì)量Mr：relative molecular mass圖2 Western blot法驗(yàn)證si-NC、si-RUNX3- 1和 si-RUNX3- 2細(xì)胞RUNX3的蛋白表達(dá)量Fig 2 Western blot of protein expression of RUNX3 in si-NC，si-RUNX3- 1，and si-RUNX3- 2 cells

HCT- 116/5-FU耐藥細(xì)胞株的鑒定CCK- 8法檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著5-FU藥物濃度升高，HCT- 116細(xì)胞和HCT- 116/5-FU細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均逐漸升高；HCT- 116細(xì)胞在藥物濃度為1.000、1.875、3.750、7.5000、15.000、30.000、60.000、120.000、240.000 μg/ml時(shí)，藥物濃度和細(xì)胞抑制率不具有相關(guān)性(P=0.117)；在藥物濃度為1.000、1.875、3.750、7.500、15.000、30.000 μg/ml時(shí)，藥物濃度和細(xì)胞抑制率呈顯著正相關(guān)(r=0.858，P=0.029)；當(dāng)藥物濃度達(dá)到60.000 μg/ml時(shí)，細(xì)胞抑制率已接近100%，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞抑制率不再變化，故整體分析兩因素?zé)o相關(guān)性。HCT- 116/5-FU細(xì)胞在藥物濃度為1.000、1.875、3.750、7.5000、15.000、30.000、60.000、120.000、240.000 μg/ml時(shí)，藥物濃度和細(xì)胞抑制率呈顯著正相關(guān)(r=0.894，P=0.010)；當(dāng)藥物濃度達(dá)到240.000 μg/ml時(shí)，細(xì)胞抑制率接近100%；HCT- 116/5-FU細(xì)胞在5-FU各濃度處理下的抑制率均明顯低于HCT- 116細(xì)胞(P均<0.001)。HCT- 116細(xì)胞的IC50值明顯低于HCT- 116/5-FU細(xì)胞[(5.554±0.004)μg/ml比(42.782±0.271)μg/ml，t=-238.08，P<0.001](圖3)。HCT- 116/5-FU細(xì)胞耐藥倍數(shù)約為HCT- 116細(xì)胞的7.7 倍。si-NC組細(xì)胞的IC50為(5.469±0.151)μg/ml，明顯低于si-RUNX3組的(15.640±0.039)μg/ml(t=-112.733，P<0.001)(圖4)。進(jìn)一步將HCT- 116細(xì)胞、HCT- 116/5-FU細(xì)胞、si-NC組細(xì)胞和si-RUNX3組細(xì)胞進(jìn)行兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(F=38049.910，P<0.001)；其中，si-NC組與HCT- 116細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.996)，HCT- 116/5-FU細(xì)胞與HCT- 116細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，si-RUNX3組細(xì)胞與HCT- 116細(xì)胞差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

與HCT- 116細(xì)胞相比較，aP<0.001aP<0.001 compared with HCT- 116 cells圖3 親本細(xì)胞HCT- 116和耐藥細(xì)胞HCT- 116/5-FU在不同濃度5-FU作用下細(xì)胞抑制率的變化Fig 3 Inhibition rates of 5-FU at different concentrations on HCT- 116 and HCT- 116/5-FU cells

與si-NC組比較，aP<0.01aP<0.01 compared with si-NC group圖4 si-NC組和si-RUNX3組在不同濃度5-FU作用下細(xì)胞抑制率的變化Fig 4 Inhibition rates of different concentrations of 5-FU on cells in si-NC group and si-RUNX3 group

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞群體TD細(xì)胞生長(zhǎng)曲線示，兩組細(xì)胞在連續(xù)培養(yǎng)第1天(t=0.261，P=0.807)、第2 天(t=1.476，P=0.214)組間細(xì)胞計(jì)數(shù)值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第3天(t=6.608，P=0.003)、第4天(t=42.345，P<0.001)、第5天(t=42.444，P<0.001)、第6天(t=67.822，P<0.001)，第7天(t=542.867，P<0.001)HCT- 116細(xì)胞的增殖速度均明顯快于HCT- 116/5-FU細(xì)胞(圖5)。HCT- 116/5-FU細(xì)胞群體TD為(35.53±1.26)h，明顯高于HCT- 116細(xì)胞的(25.80±1.85)h(t=-7.538，P=0.002)，HCT- 116/5-FU細(xì)胞群體的TD是HCT- 116細(xì)胞的1.38 倍，HCT- 116/5-FU細(xì)胞群體TD延長(zhǎng)且生長(zhǎng)增殖速度減慢(圖6)。

與HCT- 116細(xì)胞比較，aP<0.01，bP<0.001aP<0.01，bP<0.001 compared with HCT- 116 cells圖5 HCT- 116和HCT- 116/5-FU細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig 5 Growth curves of HCT- 116 and HCT- 116/5-FU cells

圖6 HCT- 116和HCT- 116/5-FU的細(xì)胞群體倍增時(shí)間Fig 6 Population doubling time of HCT- 116 and HCT- 116/5-FU cells

RUNX3、P-gp、MRP1和LRP的mRNA相對(duì)表達(dá)水平PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線顯示每條曲線均有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期；PCR產(chǎn)物的溶解曲線顯示曲線均為單峰，峰的形狀比較銳利(圖7)。HCT- 116/5-FU的P-gp(t=4.903，P=0.008)、MRP1(t=8.930，P=0.001)和LRP(t=8.168，P=0.001)mRNA表達(dá)均明顯高于HCT- 116，HCT- 116的RUNX3 mRNA表達(dá)量明顯高于HCT- 116/5-FU(t=-2.820，P=0.048)(表3、圖8)。

RUNX3：runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3；P-gp：P糖蛋白；MRP1：多藥耐藥相關(guān)蛋白1；LRP：肺耐藥蛋白R(shí)UNX3：runt-related transcription factor 3；P-gp：P-glycoprotein；MRP1：multidrug resistance-associated protein 1；LRP：lung resistance-related protein圖7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線Fig 7 Amplification curves and melting curves of real-time fluorescence quantitative PCR

與HCT- 116細(xì)胞比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001 compared with HCT- 116 cells圖8 各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 8 Relative mRNA levels of RUNX3，P-gp，MRP1，and LRP

表3 各基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量Table 3 Relative mRNA levels of RUNX3，P-gp，MRP1，and LRP

RUNX3、P-gp、MRP1和LRP蛋白的相對(duì)表達(dá)水平HCT- 116/5-FU細(xì)胞的RUNX3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于HCT- 116細(xì)胞(t=35.355，P<0.001)，P-gp蛋白(t=-31.740，P<0.001)、MRP1蛋白(t=-37.541，P<0.001)和LRP蛋白(t=-14.047，P<0.001)均明顯高于HCT- 116細(xì)胞(圖9)。

圖9 Western blot法檢測(cè)HCT- 116和HCT- 116/5-FU細(xì)胞的RUNX3、P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)Fig 9 Western blot of protein expression of RUNX3，P-gp，MRP1，and LRP

si-RUNX3對(duì)HCT- 116細(xì)胞中P-gp、MRP1、LRP蛋白表達(dá)的影響si-RUNX3組P-gp蛋白(t=-13.006，P<0.001)、MRP1蛋白(t=-11.392，P<0.001)和LRP蛋白(t=-15.081，P<0.001)相對(duì)表達(dá)量均明顯高于si-NC組(圖10)。

圖10 Western blot法檢測(cè)si-NC組細(xì)胞和si-RUNX3組細(xì)胞的P-gp、MRP1和LRP蛋白表達(dá)Fig 10 Western blot of protein expression of P-gp，MRP1，and LRP in si-NC group and si-RUNX3 group

討 論

RUNX3是哺乳動(dòng)物RUNX3家族中的成員之一，作為抑癌基因，RUNX3在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、生物學(xué)效應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等方面發(fā)揮重要作用，在許多腫瘤中存在缺失，如胃癌、食管癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌等[3]。臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和Wnt信號(hào)通路是RUNX3發(fā)揮抑癌作用的兩條主要途徑，RUNX3可能是一種作用廣泛的抑癌基因，參與多種腫瘤的發(fā)生[4- 6]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯低于腺瘤和正常組織，RUNX3的表達(dá)與腫瘤的TNM分期等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，并且通過大宗病例的臨床收集和隨訪，證實(shí)RUNX3的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的生存期密切相關(guān)，高表達(dá)患者的生存期明顯長(zhǎng)于低表達(dá)患者[7- 9]。目前我國結(jié)直腸癌的診療情況不容樂觀，多數(shù)患者在確診時(shí)已屬于中晚期，中晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差，其無疾病生存期、總生存期均不高，主要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥所致。因此，尋找腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗的靶點(diǎn)，克服腫瘤細(xì)胞耐藥性、提高化療藥物療效、開展個(gè)體化治療耐藥逆轉(zhuǎn)，已成為結(jié)直腸癌治療中亟待解決的關(guān)鍵性問題。5-FU是尿嘧啶5位上的氫被氟取代的衍生物，進(jìn)入細(xì)胞后可轉(zhuǎn)化為單磷酸脫氧氟尿嘧啶，后者可抑制胸苷酸合成酶的活性，干擾DNA合成，起到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[10]。

本研究采用qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)RUNX3及耐藥蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P-gp、MRP1、LRP在耐藥株中的表達(dá)水平均明顯高于親本株，而RUNX3在耐藥株中的表達(dá)水平明顯低于親本株。RNA干擾(RNA interfering，RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。細(xì)胞中核糖核酸酶Ⅲ 家族成員之一的dsRNA特異性核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21～25個(gè)核苷酸組成的siRNA，隨后siRNA作為介導(dǎo)子引起特異性降解相同序列的mRNA，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制[12- 13]。本研究成功構(gòu)建了RUNX3低表達(dá)的HCT- 116細(xì)胞，通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在RUNX3低表達(dá)的細(xì)胞中P-gp、MRP1、LRP高表達(dá)，RUNX3表達(dá)的抑制可能和耐藥蛋白表達(dá)的上調(diào)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌細(xì)胞系中的RUNX3進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)染和siRNA敲除，RUNX3表達(dá)的缺失會(huì)使P-gp、MRP等耐藥蛋白表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生，此外，RUNX3的重新表達(dá)會(huì)下調(diào)耐藥蛋白表達(dá)，增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[14- 17]。Zheng等[18]在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，RUNX3過表達(dá)可能通過生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞凋亡增強(qiáng)和G1期阻滯，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。此外，RUNX3的低表達(dá)可以使細(xì)胞中的AKT/GSK3/β-catenin 信號(hào)通路激活，導(dǎo)致Akt1的高表達(dá)，使患者化療的敏感性降低，增加RUNX3表達(dá)可能是逆轉(zhuǎn)肺癌化療耐藥的一種潛在途徑。Xu等[19]在肝癌研究發(fā)現(xiàn)，miR- 130a上調(diào)可使抑癌基因RUNX3 的表達(dá)下降，從而導(dǎo)致 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活及肝癌細(xì)胞耐藥性增強(qiáng)，證明RUNX3/Wnt信號(hào)通路是肝癌化療耐藥的一種途徑，為肝癌化療提供了新的靶點(diǎn)。

綜上，本研究通過低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊法建立人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HCT- 116/5-FU，耐藥株中耐藥蛋白的表達(dá)明顯高于親本株，而RUNX3的表達(dá)明顯低于親本株，初步證明在結(jié)腸癌HCT- 116細(xì)胞中RUNX3的表達(dá)和耐藥蛋白的表達(dá)存在相關(guān)性。同時(shí)通過siRNA技術(shù)構(gòu)建RUNX3低表達(dá)的HCT- 116細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P-gp、MRP1、LRP耐藥蛋白的表達(dá)量增高，結(jié)合前期研究，晚期結(jié)直腸癌預(yù)后較差，和腫瘤的耐藥相關(guān)，并且RUNX3的表達(dá)和腫瘤的TNM分期相關(guān)，其機(jī)制可能與RUNX3低表達(dá)上調(diào)P-gp、MRP1、LRP耐藥蛋白的表達(dá)相關(guān)。RUNX3可能成為一個(gè)潛在的結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)，為結(jié)直腸癌患者治療提供新的方向。