吉 磊，顧光超，陳思良，王 威，任金銳，李方達(dá)，吳建強(qiáng)，楊 丹，鄭月宏

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1血管外科 2醫(yī)學(xué)研究中心，北京100730

3中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所生物信息學(xué)研究中心，北京100193

腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是指腎下主動(dòng)脈的局部全層擴(kuò)張，且擴(kuò)張直徑大于3 cm或超過(guò)正常管徑的50%，65歲以上人群的發(fā)病率約為4%～8%，一旦破裂，死亡率可達(dá)80%[2]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是AAA的一個(gè)重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]，Ito等[4]研究顯示，53%的AAA患者并發(fā)冠心病，若篩查其他大中動(dòng)脈，AS合并率可能更高。AAA和AS存在一些共同的危險(xiǎn)因素，如吸煙、衰老、家族史、男性等，且從分子層面，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)尚不能證實(shí)AAA和AS是兩種獨(dú)立的疾病。AAA的病理學(xué)特征主要包括慢性炎癥、平滑肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解等[5]，這些特征同時(shí)可促進(jìn)AS斑塊的形成[6]。這些證據(jù)意味著AS可能是AAA發(fā)病的重要階段。然而，對(duì)兩種疾病的全基因組測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)，AAA和AS雖在脂質(zhì)代謝、平滑肌細(xì)胞功能和炎癥調(diào)控等方面具有相似的遺傳途徑[7-9]，但仍存在大量獨(dú)立的致病基因位點(diǎn)[10]。AAA和AS的關(guān)系問(wèn)題尚存爭(zhēng)議，因此，從不同角度尋找這兩種疾病的差異十分必要。腸道菌群作為人體“第二基因組”參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)與AS發(fā)病之間存在明顯的相關(guān)性[12]。同樣，以載脂蛋白E敲除小鼠為模型的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，血管緊張素Ⅱ造模成功的AAA小鼠在α、β多樣性方面與對(duì)照組小鼠均有較大差異[13]。但AAA和AS在人體腸道菌群方面的差異尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，從人體腸道微生物角度，探索AAA和AS的差異點(diǎn)，從而為后續(xù)兩種疾病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究和差異化治療提供參考。

對(duì)象和方法

對(duì)象及分組2018年12月至2019年6月在北京協(xié)和醫(yī)院血管外科經(jīng)超聲或CT確診的年齡≥60歲的AAA患者(AAA組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)為腎下主動(dòng)脈直徑大于3 cm或超過(guò)正常直徑的1.5倍，同時(shí)超聲或CT確認(rèn)AAA患者在主動(dòng)脈或分支動(dòng)脈處合并無(wú)癥狀性AS。2018年12月至2019年6月在北京協(xié)和醫(yī)院血管外科經(jīng)超聲或CT確診AS所致的年齡≥60歲的頸動(dòng)脈狹窄患者(AS組)。排除標(biāo)準(zhǔn)：6個(gè)月內(nèi)患者有抗生素、益生菌和胃腸道疾病相關(guān)藥物使用史，腹部手術(shù)史，傳染病、食物不耐癥和炎癥性腸病病史，短期內(nèi)飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。此外，排除炎性、感染性動(dòng)脈瘤等其他病因所致的AAA。記錄所有研究對(duì)象的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)和合并疾病等臨床數(shù)據(jù)。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)(JS- 2629)。

樣本采集清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集研究對(duì)象的新鮮糞便置于專(zhuān)用的糞便保存管內(nèi)，而后迅速將其放入液氮罐內(nèi)速凍，轉(zhuǎn)運(yùn)至生物樣本庫(kù)儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。囑研究對(duì)象在收集糞便樣本前將尿液排盡，避免污染糞便。

測(cè)序過(guò)程

糞便樣本DNA提取和質(zhì)檢：根據(jù)操作說(shuō)明，使用DNA提取試劑盒(TIANamp Stool DNA kit，北京天根生化科技有限公司)提取糞便樣本DNA。利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)(美國(guó)ThermoFisher公司)和1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA質(zhì)檢。

引物設(shè)計(jì)并合成：16S rDNA擴(kuò)增選擇區(qū)域?yàn)閂3-V4區(qū)，使用的通用引物為341F和806R。引物設(shè)計(jì)：forward primer(5’- 3’)：CCTACGGGRSGCAGCAG(341F)；reverse primer(5’- 3’)：GGACTACVVGGGTATCTAATC(806R)。

PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化：以稀釋后的基因組DNA為模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit(瑞士Roche公司)高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。 采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(美國(guó)AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物。回收后，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計(jì)和2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢。文庫(kù)質(zhì)檢合格后，使用Qubit進(jìn)行文庫(kù)定量，并根據(jù)每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

Illumina測(cè)序：采用Illumina Miseq PE250(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。設(shè)計(jì)16S特定引物擴(kuò)增特異區(qū)域，得到 425bp 左右擴(kuò)增片段。加接頭，采用Illumina平臺(tái)，測(cè)序得到PE250的 Paired-End數(shù)據(jù)，通過(guò)拼接得到較長(zhǎng)序列，從而進(jìn)行后續(xù)分析。

分析方法

OTU分析：為便于下游物種多樣性分析，將長(zhǎng)Reads聚類(lèi)為操作分類(lèi)單元(operational taxonomic unit，OTU)。利用Usearch在97%相似度下進(jìn)行聚類(lèi)，將序列按照彼此的相似性人為分歸為許多小組，1個(gè)小組就是1個(gè)OTU。

α和β多樣性分析：利用QIIME軟件計(jì)算樣品的α多樣性指數(shù)值，并做出相應(yīng)的稀釋曲線。分別對(duì)α多樣性的各個(gè)指數(shù)進(jìn)行秩和檢驗(yàn)分析，通過(guò)秩和檢驗(yàn)篩選不同條件下顯著差異的α多樣性指數(shù)。通過(guò)QIIME軟件，采用迭代算法計(jì)算β多樣性指數(shù)的值，分別在加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息和不加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息的情況下進(jìn)行差異計(jì)算。

顯著性差異分析：線性判別分析效應(yīng)值(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)采用線性判別分析來(lái)估算每個(gè)組分豐度對(duì)差異效果影響的大小，找出對(duì)樣品劃分產(chǎn)生顯著性差異性影響的群落或物種。本分析采用LEfSe Tools進(jìn)行。使用秩和檢驗(yàn)的方法進(jìn)行顯著性差異分析，以找出對(duì)組間劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的物種。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 7.04統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比進(jìn)行描述，組間比較采用卡方檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

臨床特征根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，AAA組和AS組均納入20例患者，兩組在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、高血壓、糖尿病、冠心病、吸煙、飲酒等方面差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)(表1)。

表1 兩組患者臨床特征比較(n=20)Table 1 Comparison of clinical characteristics between two groups(n=20)

物種分類(lèi)和豐度分析通過(guò)16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，共獲得有效序列1 422 567條，其中，AAA組722 298條，AS組700 269條。在對(duì)有效序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)和抽平處理后，樣品物種豐富度α指數(shù)(chao1)稀釋曲線趨于平緩(圖1A)。根據(jù)每個(gè)樣品的OTU在每個(gè)樣品的豐度，計(jì)算出每個(gè)樣品或組間共有和特有的。AAA組獨(dú)有OTU為47個(gè)，AS組獨(dú)有的OTU為104個(gè)，兩組間共有的OTU為416個(gè)(圖1B)。腸道內(nèi)菌群絕大多數(shù)歸屬于厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和變形菌門(mén)4類(lèi)。AAA組和AS組在菌門(mén)水平和優(yōu)勢(shì)物種方面的組間相似度較高，在屬水平可能存在一些差異菌屬(圖1C、D)。

AS：動(dòng)脈粥樣硬化；AAA：腹主動(dòng)脈瘤；OTU：操作分類(lèi)單元AS：atherosclerosis；AAA：abdominal aortic aneurysm；OTU：operational taxonomic unitA.樣品物種豐富度α指數(shù)稀釋曲線圖；B.韋恩圖，橙色代表AS組獨(dú)有的OTU數(shù)目，藍(lán)色代表AAA組獨(dú)有的OTU數(shù)目，橙色和藍(lán)色相交的灰色部分代表AS組和AAA組共有的OTU數(shù)目；C.門(mén)水平兩組間物種譜對(duì)比柱狀圖；D.屬水平兩組間物種譜對(duì)比柱狀圖A.rarefaction curves of Chao1 index representing microbial richness of samples；B.Venn diagram，the orange and blue parts indicate the unique OTUs in AS and AAA groups，respectively，and the gray part indicate the common OTUs shared between AAA and AS groups；C.the relative abundance of gut microbiota at the phylum level between two groups；D.the relative abundance of gut microbiota at the genus level between two groups圖1 物種組成和豐度分析Fig 1 Microbial composition and relative abundance

α和β多樣性分析α多樣性是對(duì)單個(gè)樣本中物種多樣性的分析，采用5種常用指數(shù)來(lái)度量：Observed species和Chao1反映樣本中物種豐富度，但不考慮每個(gè)物種的占比情況(均勻度)；Shannon和Simpson反映物種的豐富度和均勻度；Good’s Coverage反映樣本的測(cè)序深度，以上5種度量方法均提示AAA組和AS組在α多樣性方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，選擇 Chao1(P=0.97)和Shannon指數(shù)(P=0.51)作代表性展示(圖2A、B)。與α多樣性不同，β多樣性是用來(lái)比較各樣本在物種多樣性方面存在的差異。Anosim(Weighted，P=0.077)、Adonis(Weighted，P=0.051)等多種分析方法發(fā)現(xiàn)，盡管得到的數(shù)據(jù)表明兩組間的差異并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但AAA組和AS組間仍然存在一定的菌群組成差異(圖2C～F)。

R>0代表組間差異大于組內(nèi)差異R>0 indicates the difference between groups is greater than that within groupsA.Chao1指數(shù)比較菌群豐富度；B.Shannon指數(shù)比較菌群豐富度和均勻度；C.加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息情況下Adonis分析比較兩組間β多樣性差異；D.加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息情況下Anosim分析比較兩組間β多樣性差異；E.不加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息情況下Adonis分析比較兩組間β多樣性差異；F.不加權(quán)物種分類(lèi)豐度信息情況下Anosim分析比較兩組間β多樣性差異A.comparison of Chao1 index representing microbial richness；B.comparison of Shannon index representing microbial richness and homogeneity；C.weighted Adonis analysis of β diversity；D.weighted Anosim analysis of β diversity；E.unweighted Adonis analysis of β diversity；F.unweighted Anosim analysis of β diversity圖2 α和β多樣性分析Fig 2 Analyses of α and β diversities

顯著性差異菌群分析LEfSe分析結(jié)果顯示，AAA組明串珠菌科、魏斯氏菌屬、糞桿菌屬、瘤胃球菌科較AS組為優(yōu)勢(shì)菌。而AS組厚壁菌綱、Selenomonadales菌目、韋榮氏菌科顯著增加(圖3A)。從屬水平差異性分析顯示，兩種差異菌屬——魏斯氏菌屬和糞桿菌屬均在AAA組樣本中含量增加(圖3B、C)。

LEfSe：線性判別分析效應(yīng)值LEfSe：linear discriminant analysis effect sizeA.LEfSe分析；B.顯著差異菌屬的PCA分析，橫縱坐標(biāo)分別表示第1和第2主坐標(biāo)，百分比則表示相應(yīng)主坐標(biāo)對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)率；C.顯著差異菌屬比較箱型圖A.LEfSe；B.PCA of significantly differential genera，the abscissa and ordinate denote principle components 1 and 2，respectively，and the percent represents the contribution rate of the corresponding principal component to the sample difference；C.boxplot for the comparison of significantly differential genera圖3 LEfSe和顯著性差異菌屬分析Fig 3 LEfSe and significantly differential genera

討 論

本研究通過(guò)對(duì)AAA與AS腸道菌群的比較，發(fā)現(xiàn)兩組患者在菌群均勻和豐富度上具有很大的相似性，其根源在于兩類(lèi)疾病可影響菌群的致病因素譜高度重合，但β多樣性分析證實(shí)兩組間在菌群多樣性方面存在一定差異。進(jìn)一步通過(guò)LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌綱、Selenomonadales菌目、韋榮氏菌科、明串珠菌科、魏斯氏菌屬、糞桿菌屬等不同水平的差異菌群。在屬水平差異分析中，魏斯氏菌和糞桿菌屬均在AAA組顯著增加。

魏斯氏菌屬是一種異型發(fā)酵、兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，1993年由Collins等[14]首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。魏斯氏菌屬在腌制類(lèi)發(fā)酵食品中廣泛存在，如醬油、泡菜等[15]。生物作用上，魏斯氏菌屬可將原料轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸，同時(shí)促進(jìn)膽固醇向膽鹽異化并加快體外排泄，從而發(fā)揮抗炎、降膽固醇的作用[16-17]，因此一般被認(rèn)為是有益菌。但魏斯氏菌屬富集的腌制類(lèi)發(fā)酵食物往往伴隨著高鹽，Golledge等[18]對(duì)11 742人的鹽分?jǐn)z入問(wèn)卷調(diào)查結(jié)合AAA篩查研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食組AAA患病率增加。此外，在機(jī)體不同的器官微環(huán)境下，有益菌可能存在有害的一面。有學(xué)者報(bào)道魏斯氏菌屬與菌血癥、膿腫、關(guān)節(jié)假體感染和感染性心內(nèi)膜炎等相關(guān)[19]。尤其是在一些存在免疫缺陷的患者體內(nèi)，魏斯氏菌屬可增多并發(fā)生腸道移位，進(jìn)而成為優(yōu)勢(shì)致病菌造成感染[20]。免疫功能紊亂與AAA發(fā)病聯(lián)系密切[21]，魏斯氏菌屬的增多可能從側(cè)面證實(shí)這一點(diǎn)。

糞桿菌屬是一種無(wú)孢子形成、嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，約占正常人體腸道菌群的5%[22]。研究表明，腸道微生態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的糞桿菌屬減少，與銀屑病、炎癥性腸病和結(jié)腸癌等多種疾病呈正相關(guān)[23]。慢性炎癥是AAA和AS共同的病理特征，但炎癥相關(guān)的一些關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，如細(xì)胞因子等，可能在這兩種心血管疾病中發(fā)揮相反的作用[24]。Rabiei等[25]報(bào)道糞桿菌屬及其胞外囊泡處理的人腸上皮細(xì)胞表達(dá)的干擾素-γ相比對(duì)照組顯著降低。早期研究表明，將重組干擾素-γ注入CD4+T細(xì)胞缺乏的小鼠可導(dǎo)致動(dòng)脈瘤發(fā)生[26]。然而，King等[27]利用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的AAA小鼠研究發(fā)現(xiàn)，干擾素-γ缺乏在AAA中起保護(hù)作用。以上證據(jù)說(shuō)明作為有益菌的糞桿菌屬在AAA發(fā)病中可能起負(fù)面作用。

大量研究已從各個(gè)角度證實(shí)腸道菌群紊亂與AS發(fā)病存在一定的相關(guān)性[28-30]。AS與腸道菌群的相關(guān)性主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方面：(1)腸道菌群直接感染。有研究表明，在AS斑塊中存在相當(dāng)含量的細(xì)菌DNA[31]。進(jìn)一步研究證實(shí)，這些斑塊中的細(xì)菌可能來(lái)自口腔或腸道[32]。(2)腸道菌群通過(guò)調(diào)控膽固醇和脂質(zhì)代謝影響AS的發(fā)展。Fu等[33]通過(guò)893例患者的大隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，34個(gè)菌群?jiǎn)卧c體質(zhì)量指數(shù)、三酰甘油和高密度脂蛋白相關(guān)。但有趣的是，在該隊(duì)列中，腸道菌群對(duì)總膽固醇和低密度脂蛋白的影響較小。(3)腸道菌群的代謝產(chǎn)物影響AS發(fā)病。目前發(fā)現(xiàn)，與AS相關(guān)的代謝產(chǎn)物主要包括氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)、短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)等[34-35]。以TMAO為例，食物中的膽堿等經(jīng)腸道細(xì)菌代謝為三甲胺入血，而后在肝臟中經(jīng)黃素單氧化酶轉(zhuǎn)化成TMAO[36]。一些研究證實(shí)，TMAO可通過(guò)抑制膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)和激活炎癥相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮促AS的作用[37-38]。

脂質(zhì)代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)，AAA和AS導(dǎo)致外周動(dòng)脈疾病的血清代謝譜存在一定差異[39]，結(jié)合上述總結(jié)，對(duì)AAA和AS的腸道菌群差異研究十分必要。本研究利用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AAA和AS患者在菌群豐富度、均勻度和大多數(shù)菌屬方面具有較大相似性，兩組患者糞便樣本中厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的相對(duì)豐度沒(méi)有明顯差異。而在屬水平，曾有研究表明糞桿菌屬在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者糞便中富集[40]，提示糞桿菌屬可能為AS的致病菌之一，同時(shí)在本研究中，糞桿菌屬在AAA組顯著富集，因此結(jié)論后期擴(kuò)大樣本量，增加健康對(duì)照組后進(jìn)一步闡釋。

本研究存在以下局限性：(1)入組患者均來(lái)自北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，具有明顯的地域性。為保證組間樣本的一致性，AS組均為頸動(dòng)脈狹窄患者，并不能完全代表AS。(2)影響腸道菌群組成的因素很多，如飲食、環(huán)境等，本研究無(wú)法全面考慮這些可能影響菌群的潛在因素，研究成果未來(lái)還需加大樣本量聯(lián)合多中心加以證實(shí)。本研究結(jié)果是對(duì)AAA和AS兩種疾病在人體腸道微生物組方面差異的初步探索，發(fā)現(xiàn)的差異菌屬還需構(gòu)建相關(guān)動(dòng)物模型，增加測(cè)序深度，如采用宏基因組學(xué)，并聯(lián)合其他組學(xué)如代謝組學(xué)等予以進(jìn)一步驗(yàn)證。