王思瑤,田清源,張林安,李佳馨,郭沙沙,毛丹丹,陳良碧

(湖南師范大學生命科學學院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室，中國湖南長沙410081）

水稻高溫熱害指氣溫超過水稻發(fā)育生理溫度上限,影響水稻正常開花結實,造成結實率降低甚至絕收的一種農業(yè)氣象災害[1]。水稻的生長周期較長,生殖生長階段對高溫更為敏感,當溫度超過35℃時,2 h的高溫就能使水稻育性顯著降低。高溫影響下,水稻花粉生長過程中由于水稻內環(huán)境甚至細胞結構被破壞,花粉發(fā)育不良,花粉活力降低?；ǚ勰讣毎麥p數(shù)分裂期是水稻對高溫最為敏感的時期,期間對水稻造成的傷害多為不可逆。其次是抽穗開花期,再次是灌漿初期和中期[2]。如果花期遭受高溫天氣,會導致水稻花粉育性下降,花藥開裂不全,柱頭沾染花粉粒數(shù)降低,花粉管萌發(fā)受阻等現(xiàn)象發(fā)生[3～6]。

周海等[7]在研究溫敏核不育系的育性基因調控時發(fā)現(xiàn),溫敏核不育系水稻的TMS5基因突變后,其編碼的RNase Zs1失去降解UbL40的mRNA能力,高溫條件下UbL40的mRNA大量積累,導致花粉不育；21℃較低溫度條件下,溫敏核不育系UbL40表達水平低,花粉可育。該研究結果表明,UbL40是響應高溫而表達的基因,且與花粉發(fā)育有關。因此,常規(guī)水稻中該基因的表達是否響應高溫,以及該基因的表達是否與花粉發(fā)育耐高溫有關是一個值得探討的問題。

本研究在高溫條件下對190份水稻資源材料的花粉育性進行比較,并在此基礎上分析UbL40基因的表達規(guī)律與水稻花粉育性的關系,旨在促進對水稻花粉耐高溫分子機制的認識和耐高溫水稻的選育。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的190份材料都為一季稻,其中107份為父本材料,由湖南師范大學生命科學學院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室提供。

1.2 水稻材料的種植

實驗在湖南長沙湖南師范大學水稻實驗基地(北緯 28.12°,東經(jīng) 112.59°,海拔 45 m)進行。共設置3個播種期,分別為4月15日、4月30日和5月15日。采取盆栽種植,每盆插10株(桶口內徑27.2 cm,高17.5 cm),每材料每期種植3盆。以7月中旬到8月中旬的盛夏高溫階段抽穗開花的材料為研究對象。溫度記載采用溫濕度記錄儀自動記錄。

1.3 花粉育性的鑒定

水稻始穗開花期選取稻穗的上、中、下各部3個穎花的花藥,用碘化鉀溶液制片,在光學顯微鏡下觀察花粉育性并計數(shù)和拍照。

1.4 水稻結實率的統(tǒng)計

成熟期每材料取5株統(tǒng)計總粒數(shù)和實粒數(shù),計算結實率。結實率(%)=實粒數(shù)÷總粒數(shù)×100%。

1.5 水稻花藥RNA的提取

取劍葉葉枕距為1 cm±1 cm的水稻幼穗,在冰上取花藥,液氮速凍后-80℃保存。一次取適量(約100 mg)花藥置于研缽的液氮中研磨。將粉末轉移至已加入1 mL Trizol的1.5 mL EP管中,混勻后冰上靜置5 min。加入1 mL的氯仿,充分振蕩后冰上靜置15 min,然后12 000 r/min、4℃離心15 min。轉移上清至另一1.5 mL EP管中,加入等體積的異丙醇,輕柔顛倒混勻后,于4℃或者-20℃靜置10 min,沉淀RNA。4℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清液。用預冷的75%乙醇重復洗滌沉淀,干燥后加入20 μL DEPC水,于60℃水浴鍋水浴10 min,使RNA充分溶解。吸取2 μL RNA于Eppendorf公司紫外分光光度計中檢測RNA純度與濃度,其余放置-80℃冰箱備用。

1.6 水稻花藥RNA反轉錄和定量PCR

水稻花藥RNA反轉錄和對目基因的定量PCR(real-time PCR)及檢測分別按反轉錄試劑盒(AT311-02 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix,北京全式金生物技術有限公司)和2×SYBR Green qPCR Mix(北京艾德萊生物有限公司)試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 不同水稻花粉育性耐高溫的差異比較

在水稻抽穗前后經(jīng)歷10 d持續(xù)自然日平均氣溫34.7℃高溫條件下,190個水稻材料的花粉育性和結實率差異顯著,可分為耐高溫和不耐高溫兩大類型,其中不耐高溫材料中又可分為花粉染敗、花粉典敗和無花粉3種高溫敏感型(表1)。

耐高溫水稻品種包括MCQA8等36個(表1、圖1)。高溫條件下耐高溫水稻的花粉可染率為95.2%～97.3%,結實率為87.7%～94.1%(圖2),日平均氣溫25.1℃的適溫條件下,花粉可染率為96.1%～98.9%,結實率93.2%～99.5%。該結果說明耐高溫水稻在不同溫度條件下,花粉育性和結實率變化不大。

圖1 不同溫度條件下水稻花粉育性比較Fig.1 Comparison of pollen fertility in rice under different temperature conditions

圖2 高溫條件下不同水稻品種結實性狀比較(A)結實穗表型；(B)結實率(n=3)。Fig.2 Comparison of seed-setting traits of different rice varieties under high temperature(A)Spike phenotypes；(B)Seed-setting rates(n=3).

在高溫條件下,花粉染敗率增加、結實率下降的水稻品種有華恢1006等135個,花粉可染率為11.3%～73.3%,結實率為13.0%～61.8%；在適溫條件下,花粉可染率為78.8%～98.5%,結實率為87.2%～98.4%。高溫條件下花粉以典敗為主的水稻有MZQA2等4個,其在適溫條件下育性正常。高溫條件下,鏡檢無花粉、結實率為零的水稻有YWQB3等15個,其在適溫條件下育性正常。

2.2 不同溫度條件下水稻幼穗中TMS5基因的表達差異比較

TMS5(thermo-sensitive genic male sterile 5)基因突變導致溫敏核不育系花粉不育[8～9]。為了探究常規(guī)稻在不同溫度條件下該基因的表達有否差異以及與花粉育性有否關系,選取耐高溫品種MZQA8、MCQA2以及不耐高溫的華恢1006(部分花粉染敗,結實率中等)、638和越1000父(無花粉型,結實率為零)為材料,比較不同溫度條件下TMS5基因的表達差異。結果顯示:在不同溫度下各水稻品種材料幼穗中均有TMS5基因的表達(圖3),高溫條件下TMS5的mRNA表達水平是適溫條件下的2～3倍,說明該基因對高溫有一定響應,但花粉耐高溫和不耐高溫的水稻之間該基因的表達水平?jīng)]有明顯差異,即該基因的表達水平與水稻花粉育性的相關性不高。

圖3 不同溫度條件下水稻幼穗中TMS5基因mRNA的相對表達水平比較Fig.3 Relative expression levels of TMS5 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions**:P＜0.01.

2.3 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL40基因的表達差異比較

溫敏核雄性不育系水稻幼穗中UbL40基因的mRNA表達水平隨著溫度的升高而增加,UbL40的mRNA累積導致溫敏核雄性不育[7～8]。以安農S-1為陽性對照,對幾個代表性耐高溫和不耐高溫常規(guī)水稻品種幼穗中UbL40的mRNA水平進行比較分析,結果表明,各水稻幼穗在不同溫度下均有UbL401基因的表達,且高溫條件下UbL401的mRNA含量高于適溫條件下的含量。耐高溫的MZQA8和MCQA2中UbL401的mRNA相對表達水平明顯低于不耐高溫的華恢1006,而華恢1006的mRNA相對表達水平又低于無粉型的638、越1000父。這些結果說明,UbL401的mRNA相對表達水平與水稻花粉的可育性呈現(xiàn)負相關(圖4)。

圖4 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL401基因的相對表達水平比較Fig.4 Relative expression levels of UbL401 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions*:P＜0.05,**:P＜0.01.

UbL402基因包括UbL402a和UbL402b兩種同源異構體。在高溫與適溫條件下,水稻幼穗中均有UbL402基因表達,且高溫條件下表達水平都升高。但不同水稻間UbL402a的mRNA相對表達水平無明顯差異(圖5A),而UbL402b的mRNA相對表達水平與水稻育性呈負相關(圖5B)。

圖5 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL402a(A)和UbL402b(B)基因的相對表達水平比較Fig.5 Relative expression levels of UbL402a(A)and UbL402b(B)mRNAs in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions*:P＜0.05,**:P＜0.01.

水稻中 UbL404基因分為 UbL404a、UbL404b和UbL404c。耐高溫和不耐高溫水稻中UbL404a、UbL404b和UbL404c基因都有表達(圖6),表達水平都是適溫條件下低,高溫條件下高,但不同水稻間UbL404a、UbL404b的相對表達水平?jīng)]有明顯差異,而UbL404c的相對表達水平(圖6C)與水稻花粉育性呈負相關。

圖6 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL404基因的相對表達水平比較(A)UbL404a基因mRNA；(B)UbL404b基因mRNA；(C)UbL404c基因mRNA。Fig.6 Relative expression levels of UbL404 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions(A)UbL404a mRNA；(B)UbL404b mRNA；(C)UbL404c mRNA.*:P＜0.05,**:P＜0.01.

以上結果表明,在常規(guī)水稻的幼穗中UbL40是受高溫誘導的基因,對于不耐高溫的水稻,其花粉敗育可能與UbL401、UbL402b和UbL404c的高表達有關。

3 討論

高溫對世界主要糧食作物特別是水稻的生產造成極大的威脅。探索高溫的影響機制,篩選和培育耐高溫的水稻品種是水稻科學研究的重要方向。本研究對190份水稻花粉育性耐高溫的差異進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)受試水稻中大多數(shù)品種的花粉發(fā)育對高溫敏感,結實率低。這類花粉發(fā)育不耐高溫的水稻品種在長江中下游作為一季稻種植存在較大風險,因為一季稻的花粉發(fā)育時期遇35℃以上高溫的頻率高。本研究鑒定出的耐高溫MZQA8、MCQA2等材料可作為長江中下游一季稻耐高溫育種的基因源。

周海等[7～9]研究發(fā)現(xiàn),TMS5基因編碼的RN-ase ZS1在野生型水稻中降解UbL40基因的mRNA,從而使水稻中的該mRNA保持在較低的水平。溫敏核不育系(如安農S-1)中TMS5基因發(fā)生單堿基突變,不能產生活性RNase ZS1,在較高溫度條件下導致UbL40的mRNA積累,使不育系花粉敗育；在低溫條件下,由于UbL40表達降低,不育系花粉可育。周海等的研究還發(fā)現(xiàn),TMS5基因編碼的RNase ZS1在各組織的表達屬于組成型表達,其mRNA在高溫和低溫條件下都在花粉的小孢子母細胞(MMC)中相對富集,并不受低溫(23℃)或高溫(28℃)條件的影響,因而被認為是一個非溫敏基因。但本研究表明,在高溫逆境條件下TMS5基因的表達對高溫有一定響應,推測這種響應可促進其對UbL40基因mRNA的降解,有利于花粉的發(fā)育,但耐高溫和不耐高溫水稻在高溫條件下該基因的表達沒有明顯差異,故TMS5基因是決定溫敏核不育系花粉育性的關鍵基因,而不是決定常規(guī)水稻花粉發(fā)育能否耐高溫的關鍵基因。常規(guī)水稻花粉發(fā)育是否耐高溫與UbL40基因有關,即在常規(guī)水稻的幼穗中UbL40受高溫誘導表達,其中UbL401、UbL402b和UbL404c的過高表達導致不耐高溫的水稻花粉發(fā)育不良,結實率降低。相關分子機制有待進一步深入研究。